Situazione della contaminazione da micotossine in alcuni cereali piemontesi, con particolare riferimento al riso

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1 Situazione della contaminazione da micotossine in alcuni cereali piemontesi, con particolare riferimento al riso Maria Lodovica Gullino e Davide Spadaro AGROINNOVA Università di Torino Torino, 28 febbraio 2012

2 Outline: o Produzioni cerealicole piemontesi o Funghi micotossigeni o Il progetto MICORID o Funghi micotossigeni su riso o Micotossine nei prodotti risicoli o Il progetto RISINNOVA o Il progetto ITACA o Prevenzione, difesa e decontaminazione

3 Produzioni cerealicole piemontesi (ISTAT, 2011) a v p e Cereale Superficie (ha) Produzione totale (q) Frumento tenero Frumento duro Segale Orzo Avena Riso Mais Sorgo Altri cereali Riso in Italia: ha; q

4 o Produzioni cerealicole piemontesi o Funghi micotossigeni o Il progetto MICORID o Funghi micotossigeni su riso o Micotossine nei prodotti risicoli o Il progetto RISINNOVA o Il progetto ITACA o Prevenzione, difesa e decontaminazione

5 Funghi micotossigeni Malattie: marciumi delle radici, dello stelo e delle spighe. Capacità di produrre micotossine nelle piante attaccate in pieno campo o durante l immagazzinamento e durante le operazioni di trasformazione dei prodotti. Specie fungine più importanti che producono micotossine nei cereali: Fusarium, Claviceps, Aspergillus, Penicillium. Infection density field fungi Alternaria Aureobasidium Cladosporium Rhizopus Chaetomium Fusarium storage fungi Aspergillus Penicillum Mucor Rhizopus malt fungi Geotrichum Mucor Rhizopus Field Harvest Storage Malt production

6 Mycotoxin formation by different Fusarium - species on cereals Fusarium - species Tricho - Zearale - Fumo- Monili - Fusa- cycl. thecenes nones nisines formin rines Peptides F. avenaceum F. culmorum F. crookwellense F. equiseti F. graminearum F. moniliforme F. poae F. sambucinum F. sporotrichioides F. subglutinans F. tricinctum F. venenatum Desjardins & Proctor 2001

8 Sintesi dei risultati del progetto MICORID Lotta alla fusariosi del riso: identificazione degli agenti causali, monitoraggio delle micotossine nei prodotti alimentari derivati costituzione di varietà resistenti Ricerca finanziata dalla Regione Piemonte Bando per linee

10 Nota dal 1828 in Giappone Malattia trasmessa per seme Ingiallimenti e allungamento dei culmi Bakanae pianticella sciocca 1999 segnalata in California Italia: maggiore diffusione a partire dall inizio degli anni Novanta

11 Andamento della comparsa dei sintomi durante la stagione colturale Numero totale di piante prelevate durante ogni rilievo Sintomi più evidenti all inizio della stagione vegetativa Totale piante sintomatiche a fg 3a-4a fg inizio acc. 2-3 culmi acc. accestim. inizio levata inizio levata levata fine levata inizio fioritura fioritura maturazione 21/5/09 28/5/09 4/6/09 12/6/09 19/6/09 26/6/09 2/6/09 10/7/09 17/7/09 24/7/09 31/7/09 26/8/09 Data e fase fenologica

12 Fusarium Link 1809 Il genere include oltre 80 specie Molti patogeni vegetali Specie micotossigene Numerose specie saprofite Caratteristica principale: macroconidi fusiformi Macroconidi

13 macroconidi microconidi clamidospore Fusarium: morfologia Fusarium: criteri secondari Morfologia della colonia Pigmentazione Tasso di crescita a 25 C e 30 C

14 Fusarium: gruppi di compatibilità vegetativa MP-A (F. verticillioides) F. moniliforme MP-F (F. thapsinum) F. proliferatum MP-C (F. fujikuroi) MP-D (F. proliferatum) F. subglutinans MP-B (F. sacchari) MP-E (F. subglutinans) MP-H (F. circinatum) MP-I (F. konzum) F. fujikuroi F. proliferatum F. verticillioides

15 SINTOMATOLOGIA E PATOGENICITÀ DELLE SPECIE DI FUSARIUM ASSOCIATE ALLA FUSARIOSI DEL RISO Raccolta e isolamento Campioni di riso infetti da Bakanae raccolti durante la stagione vegetativa dal 2006 al 2010 nelle principali aree risicole del nord-ovest province di Novara, Vercelli e Pavia provinces) da campi di diverse cultivar Isolamento: da tessuto colpito da seme (1% NaOCl per 30 s, risciaquo x 2 in acqua distillata, piastratura su terreno Komada) Miceli isolati da tessuto e da seme trasferiti su capsule petri contenenti PDA (+ 25 mg/l streptomicina) per generare colture monoconidiche.

16 Fusarium: analisi molecolari Fingerprinting AFLP Sequenziamento geni nucleari o TEF 1α Sequenziamento del gene TEF con i primer: ef1 (5 -ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3 ) ef2 (5 - GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3 ) (O Donnell et al., 1998) Analisi BLAST: - NCBI - FUSARIUM-ID (Geiser et al., 2004)

17 Isolati di Fusarium spp. nel isolati identificati sulla base delle caratteristiche morfologiche, microscopiche e molecolari Popolazione di Fusarium spp. isolate da riso nel 2008 F. avenaceum F. graminearum F.verticillioides F. proliferatum F. sporotrichioides F. equiseti F. fujikuroi Fusarium spp. isolated from diseased rice in 2008 Fungal species tissue seed % F. fujikuroi F. proliferatum 0 2 2,5 F. equiseti 0 2 2,5 F. verticillioides 0 1 1,25 F. avenaceum 0 1 1,25 F. graminearum 0 1 1,25 F. sporotrichioides 0 1 1,25 TOTAL

18 Popolazione di Fusarium spp. isolata da riso nel 2009 Isolati di Fusarium spp. nel 2009 F.oxysporum F. fujikuroi Fusarium spp. isolated from diseased rice in 2009 Fungal species tissue seed % F. fujikuroi F. oxysporum F. proliferatum* F. verticillioides* F. equiseti F. graminearum F. andyazi Fusarium spp TOTAL

19 Isolati di Fusarium spp. nel 2010 Popolazione di Fusarium spp. isolata da riso nel 2010 F. prolif erat um F. graminearum F. oxysporum F. f ujikuroi Fusarium spp. isolated from diseased rice in 2010 Fungal species tissue % F. fujikuroi F. oxysporum 9 7 F. proliferatum* 1 1 F. graminearum 5 4 TOTAL

20 Test di patogenicità 123 ceppi di Fusarium spp. valutati per la loro patogenicità e grado di virulenza sulla cultivar Galileo altamente suscettibile al Bakanae. Scala di valutazione sintomi

21 Patogenicità e grado di virulenza Fusarium spp. Identificativo dell isolato Grado di virulenza Range of DSI c F. fujikuroi 15-66, 2-10, 2-147, 2-82, I2.4, 19-77, I3.1, 2-42, 11-3, 2-76, 19-53, 11-23, 11-85, I1.6, I1.1, I2.1, 14-22, I2.6, I 1,5, 11-80, 2-179, 11-93, I1.3, 11-50, 15-69, SG4, C2S, G6S, A1, A7, G3S, C3S, CFG, AC6, A6, C4S, M1149 b, VAL1, D5, VAE2, C5S, Ve13, Gl7S, S5S, G1S, VPG2, S6S, S2S, A5, C6S, D4,L5, S7, VPG6, VAG6, LS6, AG2, LS3, AG8, A4-27, Da3, S6, VAE7, Ca2, S2, S4, Da5, high virulent low avirulent 8 < 1 F. proliferatum 2-19, 2-21, 2-27, 2-36, 2-79, 2-91, 2-105, 2-160, 11-11, 11-64, 11-74, FMR2, ITEM1720 a, S1S, 11-28, , , 19-9 F. verticillioides , 2-33, 19-69, , I1.2, ITEM1746 a, ITEM231 a, ITEM504 a, S3S avirulent avirulent F. avenaceum GL4S avirulent F. brevicatenulatum avirulent F. graminearum 2-1, 2-30, G5S avirulent F. equiseti 15-23,11-17,11-56, 11-15, G2S, GL2S avirulent F. napiforme avirulent F. oxysporum 11-47, 11-77, avirulent F. sporotrichioides GL3S avirulent 1 0 Fusarium spp , I2.8 avirulent 2 0-1

22 L identificazione specie-specifica di F. fujikuroi e F. proliferatum F. fujikuroi è morfologicamente indistinguibile da F. proliferatum e può essere distinto solo mediante sequenziamento di regioni di DNA. L allineamento multiplo delle sequenze del gene TEF di diverse specie di Fusarium ha mostrato una dlezione di 6 nucleotidi nella sequenza di F. fujikuroi e il polimorfismo in due ducleotidi nella medesima regione di F. proliferatum.

23 Disegno di primer specie-specifici per F. fujikuroi e F. proliferatum Sulla delezione di 6 nucleotidi sono stati disegnati primer specifici per F. fujikuroi e F. proliferatum. I primer disegnati si sono rivelati specifici sia PCR classica. Anche in real time PCR si è mantenuta la specificità e la sensibilità ha raggiunto i 10 pg di DNA.

25 MONITORAGGIO DELLE MICOTOSSINE PRODOTTE DA FUSARIUM SPP. NELLA FILIERA DEL RISO Limiti di legge per le fusario-tossine nel riso Regolamento 1881/2006 e 1126/2007 Non trasformato Consumo umano DON 1250 ppb 750 ppb ZEA 100 ppb 75 ppb FUMB1 e B ppb 1000 ppb T2 e HT

26 Metodologia impiegata per l analisi delle micotossine Smonitoraggio della presenza di fusariotossine: lateral-flow ROSA (Rapid one-step assay; Charm Sciences, Inc.) Quantificazione del DON: analisi HPLC + rivelatore fluorimetrico (Agilent serie 1100) Quantificazione delle tossine T2 e HT2: Analisi LC/MS/MS (spettrometro di massa a triplo quadrupolo Varia 310)

27 2007 Presenza di fusariotossine su diverse cultivar di riso Cultivars FB 1 and FB2 DON ZEA T2-HT2 Gange 0,0 37,5 0,0 0,0 Galileo 0,0 62,5 0,0 0,0 Aleramo 0,0 12,5 0,0 0,0 Gladio 0,0 12,5 0,0 0,0 Loto 0,0 37,5 0,0 0,0

28 2008 Presenza di DON nelle diverse fasi di lavorazione del riso 60,00 50,00 DON 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Risone Riso sbramato Riso Valori riscontrati: ppb

29 2008 Presenza di tossina T2 e di tossina HT2 in diverse cultivar di riso Risone HT2 T2 toxin Concentrazione T2 e Ht2 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 Livelli molto bassi 0, Concentrazione T2 e Ht2 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 Riso sbramato HT2 T2 toxin Concentrazione T2 e Ht2 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 Riso HT2 T2 toxin

30 CARNISE PRECO CE GIANO SAMBA CENTAURO EG EO BRIO LIBERO AIACE BALDO LO TO S. ANDREA ARSENAL ERCO LE SIRIO CL VIALO NE NANO KARNAK VO LANO SELENIO CARNAROLI ROMA GLADIO BALILLA ALBATRO S SP55 NEMBO ALERAMO THAIBONNET ELLEBI AUG USTO G ALILEO CRESO 700,0 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0, Livelli di DON su diverse cultivar di riso Annata con livelli di contaminazione più elevati. Livelli più alti nel risone, rispetto al riso sbramato. Risone Sbramato Concentrazione DO N (ppb )

31 Monitoraggio della presenza di micotossine nei prodotti derivati dal riso commercializzati nel 2008 Confronto della concentrazione media delle diverse micotossine presenti in differenti tipologie di prodotti commerciali a base di riso. FUM DON ZEA T2 HT2 Biscotti 0,0 37,5 0,0 0,8 Riso per Colazione 0,0 70,0 0,0 0,8 Gallette 0,0 75,0 0,0 0,8 Pasta 0,0 30,0 0,0 0,6 Riso 0,0 25,0 0,0 0,5 Cracker e Grissini 0,0 91,7 0,0 1,8 Farina 0,0 75,0 0,0 2,0 Snack 0,0 16,7 0,0 3,0

32 Sinergia tra gruppi di ricerca: TO / MI / VR / VC / RM Isolamento da seme in vaschetta rappresentativo del campo Identificazione molecolare precisa: nuovi primer per PCR F. fujikuroi specie più diffusa Conclusioni Solo gli isolati di F. fujikuroi causano Bakanae Bassa presenza di fusariotossine in sementi di riso, principalmente DON (F. graminearum) Bassa presenza di fusariotossine in alimenti a base di riso Inizio della selezione varietale con identificazione di genotipi suscettibili e resistenti a Bakanae

34 MONITORAGGIO DI FUSARIUM COMPLEX E VALUTAZIONE DEL GERMOPLASMA PER RESISTENZA (CRA-PAV, CRA-GPG, UNITO) WP1.3a: Organizzazione e caratterizzazione di una collezione di Fusarium spp. Fase 1: collezione campioni da aree risicole; Fase 2: caratterizzazione morfologica e molecolare; Fase 3: screening della collezione Italoryza per tolleranza; Fase 4: fasi iniziali per popolazioni segreganti sperimentali WP1.3b: Analisi trascrittomica (RNASeq Illumina) di genotipo tollerante/isolato virulento WP1.3c: Analisi di espressione di geni chiave per la sintesi di micotossine Fase 1: valutazione capacità produzione micotossine (HPLC); Fase 2: espressione geni biosintesi in diverse condizioni (T, U, ph) in vitro e in vivo (in planta);

35 Correlazione tra espressione FUM1 e produzione fumonisine in Fusarium spp. FUM1 e FUM8 sono geni chiave iniziali FUM 2 è un gene chiave nella differenziazione tra FB1 e FB2

36 Correlazione tra espressione FUM1 e produzione fumonisine in Fusarium spp. Crescita su PDB Estrazione RNA Retrotrascrizione Amplificazione Quantificazione fumonisine (7, 14, 21 g)

38 PROGETTO ITACA ( )

39 Individuazione delle varietà di riso più resistenti alla fusariosi Prove suscettibilità varietale Fusarium fujikuroi Saggiate finora: 24 linee Sa.Pi.Se e confrontate con 13 varietà commerciali. Procedura: Crescita conidi in PDB per 6 giorni Preparazione sospensione conidica 10 6 conidi/ml Immersione semi delle diverse linee per mezz ora Asciugatura sotto cappa Semina in serra (per linea: 3 ripetizioni costituite da 3 vaschette) Rilievo: 30 g dalla semina

41 AIN: Termoterapia su riso Semi naturalmente contaminati cv Galileo Immersione dei semi in acqua calda precondizionata: 28 Settembre C per 5, 10, 15 e 20 minuti. 65 C per 5, 10, 15 e 20 minuti. 70 C per 5, 10, 15 e 20 minuti. 75 C per 5, 10, 15 e 20 minuti. Essicazione con aria calda a 45 C per 10 minuti Valutazione dell efficacia dei trattamenti in vitro e in vivo Marcata inibizione della germinabilità dei semi dopo i trattamenti a 70 C per 15 e 20 minuti e a 75 C per 5, 10, 15 e 20 minuti. Marcata inibizione della crescita di Fusarium spp su semi trattati a 70 e 75 C. Presenza dei sintomi di bakanae sulle piante di riso (lavoro in corso). FONDO EUROPEO DI SVILUPPO REGIONALE P.O.R FONDO EUROPEO AGRICOLO PER LO SVILUPPO RURALE P.S.R Valutazione in vivo dei trattamenti effettuati

42 Risultati in vivo Trattamenti termici 100,00 80,00 ef ef f f ef ef ef ef d c 60,00 40,00 b 20,00 0,00 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a * Duncan (P<0,05) Semi germinati (%) Piante morte (%)

43 Risultati in vivo (2) Trattamenti termici 30,0% f 25,0% 20,0% 15,0% ef ef cd b b d bc c de de 10,0% 5,0% 0,0% a a a a a a * Duncan (P<0,05) Indice di malattia (%)

44 AIN: Lotta biologica su riso Semi naturalmente contaminati cv Galileo Immersione dei semi in sospensioni di ogni antagonista saggiato Sospensioni contenenti 1x10 7 CFU/ml. Antagonisti isolati da risone (R23, R26, R8 e R12) Testimone commerciale (Bacillus subtilis) Rilievi dopo 15 e 30 giorni Valutazione dell efficacia dei trattamenti in vitro e in vivo Settembre Valutazioni sintomatica delle piante di riso germinate (0. pianta sana; 1. pianta malata con poco sintomo; 2. pianta malata con molto sintomo evidente; 3. pianta morta) FONDO EUROPEO DI SVILUPPO REGIONALE P.O.R FONDO EUROPEO AGRICOLO PER LO SVILUPPO RURALE P.S.R

45 Riso naturalmente contaminato 45

46 Riso naturalmente contaminato 46

47 Rimozione selettiva dei contaminanti Partner: GBV, SPS, POLITO, TEC, AIN, LAG, RET, MRE Il Task 2.3 è orientato al miglioramento dei sistemi di rimozione dei contaminanti che inficiano la qualità e la sicurezza di riso: Fusarium spp.

48 Impiego dell ozono Acquisizione degli ozonizzatori (di due capacità produttive : 0,5 e 4 gr/h) approntamento delle attrezzature per lo svolgimento dei test con l ozono (tamburo rotante collegato ad ozonizzatore per il trattamento dinamico dei prodotti) test preliminari per verificare la possibilità tecnica di trattare riso, nocciole, grano e semola fornitura di grano duro e tenero per la contaminazione necessaria alla realizzazione dei test

49 Impiego della CO2 supercritica (POLITO DISMIC) Apparecchiatura Autoclave: 1 litro Estrazioni in discontinuo TI Serpentino CO 2 Pompa riscaldato V1 V2 PI V3 Bagno riscaldato Bombola TIC Bagno TIC Scarico refrigerante Autoclave

50 Impiego del Plasma di tipo atmosferico Apparecchiatura fornita Realizzazione camera di prova (ambiente confinato) Movimentazione campione Set up di prova Plasma

51 Impiego delle microonde Realizzazione camera di prova (ambiente confinato) Set up di prova

52 Conclusioni 1. Epidemiologia dei Fusarium spp. su riso 2. Identificazione di specie mediante sequenziamento del gene TEF 3. Monitoraggio dei Fusarium spp. 4. Solo Fusarium fujikuroi dà origine al Bakanae 5. Messa a punto di un sistema diagnostico molecolare per le diverse specie del Gibberella fujikuroi species complex 6. Diagnosi accurata per malattie da seme 7. Livello di micotossine su riso grezzo più alto, su riso lavorato più basso 8. Basso livello di micotossine su prodotti derivati dal riso 9. Presenza di DON e T2/HT2 (prodotti da F. graminearum e F. poae) 10. Produzione di fumonisine correlata a espressione di geni chiave 11. Identificazione di cv di riso resistenti e suscettibili 12. Primi risultati sulla concia termica e biologica 13. Valutazione dell efficacia di ozono, CO2 supercritica, micronde e plasma a freddo

53 Conclusioni Sistema di finanziamenti pubblici e privati MICORID (Regione Piemonte) ITACA (Regione Piemonte) RISINNOVA (AGER) Rete di istituzioni coinvolte nella ricerca sul riso INRAN (ex ENSE) CRA RIS, CRA GPG, CRA PAV CNR IBBA, CNR IPP PTP UNIMI, UNIPR, UNIFE, UNIPV, UNIPD, UNIMORE, POLITO ICGEB Partnership con aziende private: Sa.Pi.Se., Vecco, GBV, Fotovoltando,