Aspergillus, Penicillium, Fusarium (Ritieni e Randazzo, 1997). Il significato

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1 1. Introduzione 1.1. Le micotossine Le micotossine sono metaboliti a basso peso molecolare, prodotti del metabolismo secondario di funghi appartenenti principalmente ai generi Aspergillus, Penicillium, Fusarium (Ritieni e Randazzo, 1997). Il significato biologico della produzione delle micotossine è sostanzialmente ancora ignoto. Tuttavia è unanime il consenso sul fatto che la presenza di un metabolismo secondario, atto alla sintesi di micotossine, possa essere un differenziamento chimico analogo all acquisizione di differenze morfologiche; inoltre, la diversità nelle strutture e nell attività biologica dimostrata dalle micotossine suggerisce una molteplicità funzionale da un punto di vista ecologico (Bennet, J.V.; et al. 1983). Tra le numerose teorie espresse in merito alle possibili funzioni svolte dalle micotossine, (Wicklow, D.T.; et al.1988), ha ipotizzato che i metaboliti tossici possano impedire l utilizzo dei funghi quali nutrimento per artropodi; questi ultimi, attraverso le loro preferenze alimentari potrebbero in tal modo avere anche un effetto indiretto sulla competizione tra le specie fungine e, di conseguenza, influire, sui processi di decomposizione. 1

2 Tra i funghi produttori di micotossine, alcuni sono in grado di sintetizzare più tossine e al contempo, una stessa tossina può essere prodotta da diversi funghi. La presenza delle micotossine nell ambiente non è strettamente correlata alla contemporanea presenza fisica del fungo, in quanto esse possono persistere anche dopo la scomparsa del produttore. La qualità e la quantità della produzione delle tossine sono influenzate da diversi fattori ambientali e non, quali l acqua la temperatura, il ph, e l eventuale utilizzo di agenti biocidi in campi coltivati (Ritieni e Randazzo, 1997). I substrati ideali per la crescita dei funghi che sintetizzano tossine sono rappresentati dalle derrate alimentari, dalle granaglie quali mais, riso, orzo e frumento, e dai mangimi per animali, soprattutto se immagazzinati in condizioni microclimatiche di umidità e temperatura favorevoli (Bottalico, A.; et al. 1988). Le micotossine presentano sia notevoli differenze da un punto di vista chimico, sia un ampia gamma di effetti biologici dovuti alla loro capacità di interagire con differenti organi e/o sistemi bersaglio. Le differenti attività biologiche manifestate dalle micotossine nei vari organismi sono causate da interazioni delle stesse e/o dei loro derivati con le diverse molecole cellulari, quali: DNA, RNA, proteine funzionali, cofattori enzimatici, e costituenti di membrana. 2

3 Per quanto riguarda gli effetti tossici prodotti dalle micotossine, raramente essi conducono a fenomeni patologici di tipo acuto in quanto il rischio maggiore risiede nell accumulo delle stesse all interno degli organismi viventi con eventuale insorgenza di sintomatologie di tipo cronico (Berry, C.L.; et al. 1988). Tuttavia, anche se di difficile valutazione, esiste un rischio reale per l uomo, alla luce dei numerosi ritrovamenti di micotossine negli alimenti e nei prodotti zootecnici (Jalinek, C.F.; et al. 1987) e dai risultati di alcune indagini epidemiologiche condotte su popolazioni di aree geografiche più a rischio, che evidenziano una significativa correlazione positiva tra la presenza di micotossine nella dieta e l incidenza di alcune malattie endemiche (WHO/IARC, 1993). Fra le muffe che attaccano e colonizzano le piante o le derrate alimentari, il genere Fusarium, un genere di funghi imperfetti comprendente almeno 50 specie raggruppate in 12 sezioni (Nelson, P.E.; et al. 1983), rappresenta uno dei maggiori problemi sia di natura fitopatologica sia micotossicologica. Infatti molte specie di Fusarium sono dannose per l agricoltura, sia per gli effetti diretti nocivi sulle piante che parassitizzano, a cui sottraggono o alterano i componenti nutritivi, con conseguente degradazione del substrato colonizzato, sia per la capacità di tali organismi di produrre un ampia varietà di metaboliti tossici (Marasas, W.F.O.; et al. 1984). 3

4 Inoltre, le specie di Fusarium sono largamente distribuite nel suolo e nei substrati organici e sono diffuse in tutte le aree del pianeta tanto da essere state isolate dai ghiacci permanenti nell Artico e dalla sabbia del Sahara (Booth, C.; et al. 1971). Esse, comunque, abbondano nei suoli coltivati sia delle regioni temperate, sia di quelle tropicali e sono fra le specie fungine più frequentemente isolate dai patologi vegetali (Booth, C.; et al. 1971). Le malattie causate dalle specie di Fusarium sono di tipo vascolare (tracheofusariosi) e di tipo parenchimatico (marciumi, cancri), e lo spettro di piante che possono essere attaccate è molto ampio (Nelson, P.E.; te al. 1981). In particolare, sono causa di grande preoccupazione i danni che le specie di Fusarium possono causare sui cereali. Le fusariosi di mais, grano, riso e sorgo, i cui prodotti sono spesso alimento base per la maggioranza della popolazione mondiale, sono malattie diffusissime nel pianeta e causano ogni anno perdite di prodotto per miliardi di dollari (Leslie, J.F.; et al. 1990). Tuttavia un ampio spettro di altre coltivazioni, di grande importanza sia dal punto di vista alimentare, sia commerciale, possono essere attaccate da specie di Fusarium, con gravi danni sia di tipo diretto per la perdita di raccolto, sia per le contaminazioni da micotossine dei prodotti. 4

5 Fra queste, la coltivazione del fico può essere seriamente danneggiata a seguito dell infezione da specie di Fusaria che nel complesso causano sulla pianta la malattia nota come endosepsi del fico. 1.2 Endosepsi del fico Il fico (Ficus carica L. Moraceae) è una pianta di origine asiatica, che non richiede particolari cure agronomiche e, la cui coltivazione si è facilmente diffusa in tutto il bacino del mediterraneo. La maggior parte della produzione mondiale di fichi é concentrata tra Turchia, Tunisia, Grecia, Marocco e Italia. Il fico, che presenta frutti maschili (caprifichi) e femminili (eduli), produce infiorescenze (ipoantodi) carnose, da globose a piriformi, provviste di un breve peduncolo, di una cavità interna centrale che comunica con l'esterno per mezzo di un orifizio (ostiolo); i fiori tappezzano la parte interna degli ipoantodi. Dal loro sviluppo si formano le infruttescenze, i siconi, che contengono una polpa gelatinosa, dolce o molto dolce, di colore da biancastro a rosso vinoso. Il siconio del caprifico è tappezzato internamente con numerose centinaia di infiorescenze femminili e poche centinaia di infiorescenze maschili; il siconio dei frutti eduli femminili contiene solo 5

6 infiorescenze femminili (Wiebes, J.T. 1979) I caprifichi producono il polline e offrono un riparo invernale per l insetto impollinatore rappresentato dalla vespa del fico (Blastophaga psenes L.) che dimora negli ovari dei fiori pistilliferi. L'utilizzazione quasi esclusiva dei siconi è il consumo diretto allo stato fresco oppure in alternativa come prodotto essiccato. La particolare morfologia del siconio rende facilmente accessibile a funghi ed insetti la penetrazione tramite l'ostiolo e il successivo sviluppo all'interno del siconio stesso. Tale sviluppo é facilitato dalla composizione del siconio per cui i fichi sono un ottimo terreno di coltura per la crescita dei patogeni fungini. Oltre alla contaminazione dei frutti freschi, c è da segnalare un rischio molto elevato di contaminazione dei frutti secchi. La tecnologia di essiccazione nella maggioranza dei casi è di tipo naturale, al sole, e può avvenire sull'albero o dopo la raccolta. Nel primo caso i fichi sono raccolti quando già parzialmente disidratati e sono posti interi su graticci esposti al sole per un periodo di 4-8 gg; nel secondo caso invece i siconi sono raccolti ad uno livello di disidratazione meno avanzato, tagliati longitudinalmente e posti ad essiccare per gg. (Godini, A. Fico, Frutticultura Speciale, REDA, Autori Vari 1991). 6

7 Di conseguenza, tale metodologia di essiccazione combinata alla composizione chimica e alla morfologia del siconio può facilmente spiegare l elevato rischio di contaminazione fungina correlata ai fichi secchi. A tale riguardo è stato riportato in letteratura la colonizzazione da parte dell' Aspergillus flavus nei fichi essiccati, con conseguente contaminazione dei fichi di aflatossine (Buchanan, J.R.; et al ) Ulteriori ricerche hanno dimostrato che i fichi freschi possono essere colonizzati da varie specie di Aspergillus, delle sezioni Nigri, Flavi, e Circumdati, produttori di ocratossine, aflatossine e di acido ciclopiazonico (Doster, M.A.; et al.1996). I controlli effettuati, su partite di fichi importati, presso gli organi competenti di frontiera sono focalizzati sulla determinazione del livello di aflatossine presenti e il loro superamento é causa spesso del rifiuto delle partite stesse. Inoltre, Subbarao e Michailides (1993) hanno evidenziato il ruolo non secondario che svolgono i funghi appartenenti al genere Fusarium nella colonizzazione del siconio, ed in particolare quello svolto dalle specie che causano l endosepsi del fico ( Subbarao, K.V.; et al 1993.) L endosepsi del fico, definita anche come marciume rosa, bruno, o soffice del fico, ha raggiunto ormai un ruolo estremamente importante dal punto di vista commerciale fra le patologie fungine dei siconi arrivando a causare perdite anche del 50% di prodotto (Michailides, T.J.; et al. 1996). 7

8 Lo sviluppo della malattia è facilitato dai danni meccanici arrecati sulla superficie esterna dei frutti (Michailides, T.J.; et al. 1996). I primi sintomi dell endosepsi si evidenziano con imbrunimenti all interno della cavità dei fichi quando il siconio comincia a maturare. Quando molte infiorescenze sono infettate, la malattia si manifesta esternamente con lesioni marcescenti attorno all ostiolo del siconio. La malattia si diffonde nel frutto attraverso il peduncolo, ed un micelio spesso può a volte apparire sulla superficie del siconio. Caldis (1927), ha messo in evidenza le relazioni fra la malattia e la vespa del fico, evidenziando i rapporti fra la malattia e i cicli dell insetto e mostrando come la vespa del fico conduca polline e propaguli fungini ai fichi maschili e femminili recettivi. Caldis (1927) ha individuato in F. moniliforme, il principale agente della malattia, definendo, sulla base della colorazione del micelio aereo e su basi morfologiche una varietà tassonomica distinta e specifica del fico che definì F. moniliforme var. fici. Successivamente, Subbarao e Michailides (1992), dopo aver mostrato che le caratteristiche morfologiche utilizzate da Caldis per definire F. moniliforme var. fici come agente patogeno dell endosepsi del fico, non fossero uniche per tale patogeno e che tale popolazione non mostrava neanche specificità per il fico, abbandonarono la definizione di varietà per utilizzare solo il nome di F. moniliforme. 8

9 Recentemente, inoltre, Subbarao e Michailides (1993) hanno dimostrato che in California almeno tre erano le specie responsabili dell endosepsi del fico: F. moniliforme, F. solani, F. dimerum, oltre alle quali ancora più recentemente sono state identificate da eminenti esperti altre due specie quali F. proliferatum e F. subglutinans (Marasas, W.F.O.; Nirenberg, H.; Logrieco, A. comunicazione personale). Queste due ultime specie, insieme a F. moniliforme, appartengono alla sezione Liseola del genere (Nelson, P.E.; et al. 9

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11 1983) e rappresentano la forma anamorfica di Gibberella fujikuroi il teleomorfo con il quale convivono in un rapporto metagenetico (Nelson, P.E.; et al. 1983). Mentre F. solani e F. dimerum non producono tossine note, le specie della sezione Liseola sopra indicate sono in grado di produrre diversi metaboliti tossici trai quali posseggono un ruolo di primo piano le fumonisine (Gelderblom, W.C.A.; et al. 1988), e l acido fusarico (Yabuta, T.; et al. 1937), insieme a molecole interessanti, ma di più recente acquisizione quali fusaproliferina e beauvericina (Logrieco, A.; et al. 1997). La fotografia riportata nella pagina seguente, tratta dal lavoro di Subbarao e Michailides (1996), mostra dei siconi con sintomi di endosepsi causata da Fusarium spp. Nella figura A le frecce indicano le lesioni esterne di un siconio infettato, mentre nella figura B, le frecce indicano il micelio del fungo colonizzatore. 11

12 1.3. FUMONISINE Le fumonisine sono un gruppo di tossine isolate per la prima volta in Sud Africa da colture di Fusarium moniliforme e correlato con casi di micotossicosi sia di equini che di suini ( Gendelbrom, W.C.A.; et al. 1988). Al gruppo delle fumonisine appartengono almeno 8 differenti composti correlati chimicamente tra di loro e riconducibili strutturalmente all 1,2,3 tricarbossi pentanoico acido 2-ammino-12,16-dimetil polidrossieicosano. La fumonisina B1 (fig 1) con la B2 e la B3 rappresentano dal punto di vista quantitativo le tre più importanti fumonisine. Il loro accumulo e la loro ingestione attraverso mangimi contaminati sono stati correlati con diversi casi di ELEM (leucoencefelomalacia equina); (Thiel, P.G., et al. 1991); e di sindrome da edema polmonare nei suini ( Ross, P.F.; et al. 1990). Inoltre negli animali che hanno subito danni da fumonisine sono evidenti i danni in sede autoptica a livello epatico e renale.(visconti, A.; et al ) La presenza di fumonisine, con altre tossine prodotte da Fusarium spp. é stata associata in alcune regioni del globo, nord Italia, Sud Africa e sud est asiatico, alle abitudini alimentari delle popolazioni autoctone ed a una maggiore incidenza di patologie neoplastiche esofagee (Franceschi, S.; et al. 1990). In tali regioni la dieta é particolarmente ricca, o addirittura 12

13 esclusivamente composta da cereali e da mais che rappresentano il substrato ideale di accrescimento di Fusarium tossinogeni e a conferma di ciò numerosi studi riportano una elevata presenza di fumonisine quali contaminanti naturali. (Rheeder, J.P.; et al. 1992) (Fun, S. Chu; Guo, Y. Li; 1994) Il meccanismo di azione delle fumonisine é solo parzialmente conosciuto ma la loro struttura chimica non dissimile da quella degli sfingolipidi consente di ipotizzare un ruolo delle fumonisine nella regolazione del metabolismo sfingolipidico. Le fumonisine sono inibitori naturali della biosintesi degli sfingolipidi perché esse interagiscono in studi fatti su epatociti di ratto con l enzima cerammide sintetasi. (Norred, W.P.; et al. 1992) Sulla base di questi dati biologici insieme a numerose altre sperimentazioni sulle attività delle fumonisine " L Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro" ha provveduto ad inserire nel gruppo B2, composto possibile cancerogeno per l uomo, le tossine prodotte da Fusarium moniliforme (Visconti, A., et al. 1999). Tale decisione non imputa alle solo fumonisine la responsabilità dell azione carcinogenica degli estratti di colture da tale fungo; ma i rapporti quantitativi relativi dei metaboliti presenti negli estratti e gli studi condotti su 13

14 fumonisine pure inducono a suggerire che siano esse le reali responsabili di tali fenomeni biologici BEAUVERICINA e FUSAPROLIFERINA La beauvericina (fig 2) é stata isolata la prima volta da Beauveria bassiana (Hamill, R.; et al. 1969), utilizzando dei saggi di tossicità su larve di Artemia Salina (Scott, P.M.; et al. 1971) quali sistemi di monitoraggio biologico. La beauvericina é chimicamente un lattone trimero ciclico formato alternativamente da tre residui di N-metil-phenilalanina e tre residui di acido D-α-idrossiisovalerico legati con legami depsipeptidico. La struttura chimica della beauvericina é strutturalmente correlabile alla famiglia delle enniatine (Logrieco, A.; et al. 1997). 14