L infezione da Vagococcus salmoninarum della trota iridea in Italia. Vagococcus salmoninarum infection in rainbow trout in Italy

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1 L infezione da Vagococcus salmoninarum della trota iridea in Italia Vagococcus salmoninarum infection in rainbow trout in Italy Claudio Ghittino 1 *, Francesco Agnetti 1, Carmen Panzieri 1, Simone Cabra 2, Silvia Colussi 2, Marino Prearo 2 1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell Umbria e delle Marche, Via Salvemini Perugia 2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta, Via Bologna Torino RIASSUNTO Fra le patologie emergenti della trota iridea (Oncorhynchus mykiss), la Vagococcosi o infezione da Vagococcus salmoninarum sta assumendo una notevole importanza. Un recente monitoraggio, ha messo in luce una sua diffusione soprattutto nelle aree montane dell Italia Centrale. La malattia è stata osservata esclusivamente a carico di soggetti di pezzatura superiore ai 50 g ed in impianti riforniti da acque con temperatura di 8-11 C. I pesci colpiti hanno manifestato letargia, anoressia, melanosi ed accentuato esoftalmo bilaterale, spesso complicato da rottura dei globi oculari. L esame necroscopico ha mostrato anemia branchiale, congestione cerebrale, idropericardite, splenomegalia, lievi emorragie a carico di fegato, vescica natatoria e peritoneo. L isolamento batterico è avvenuto nel 100% dei prelievi effettuati da occhio e cervello, ma solo nel 10% dei prelievi renali. L esame colturale ha evidenziato crescita di colonie α-emolitiche dopo ore d incubazione a 22 C, ma non a 37 C. A differenza di Lactococcus garvieae, l identificazione biochimica ha rivelato negatività per arginina deidrolasi, α-glucosidasi e galattosio. Il test in PCR ha permesso di visualizzare, in caso di positività per V. salmoninarum, una banda specifica di 300 paia di basi. La caratterizzazione sierologica mediante AGID ha stabilito una eterologia antigenica tra gli isolati di campo italiani (appartenenti ad un unico sierotipo) e quelli francesi e spagnoli. Le prove di infezione sperimentale hanno dimostrato come per raggiungere la DL 50 siano necessari circa 40 giorni, in seguito a challenge per via endoperitoneale con concentrazioni virulente di V. salmoninarum pari a 10 9 ufc/pesce. SUMMARY Among emerging pathologies of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), Vagococcosis or Vagococcus salmoninarum infection is assuming a notable importance. A recent monitoring has pointed out its widespreading in some mountain districts of Central Italy. The disease was observed exclusively in fish over 50 g and in farms supplied with cold water (8-11 C). Affected fish shoved lethargy, anorexia, melanosis and marked bilateral exophthalmos, frequently leading to distruption of the eye ball. At necropsy, gill anemia, brain congestion, hydropericarditis, spleen enlargement, slight hemorrhaging on the liver, the swim bladder and the peritoneum, were noticed. Isolation of V. salmoninarum was obtained in 100% of samplings from the eye and the brain, but only in 10% of samplings from the kidney. Bacteriological examination revealed growth of α-hemolytic colonies following an incubation of hours at 22 C, but not at 37 C. Unlike for Lactococcus garvieae, reactions for arginine dihydrolase, α-glucosidase and galactose were found to be negative at biochemical identification. In case of positivity for V. salmoninarum, a specific band of 300 bp was detected with the PCR test. Serological characterization through AGID has indicated an antigenic heterology among Italian field isolates (belonging to a single serotype) and French and Spanish isolates. Experimental infection trials have demonstrated that the LD 50 may be obtained at day 40 post challenge, following an intraperitoneal injection with 10 9 cfu of virulent V. salmoninarum / fish. Key words: Rainbow trout, Vagococcus salmoninarum, Diagnosis, PCR * Corresponding Author: c/o Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell Umbria e delle Marche, Centro di Acquacoltura e Ittiopatologia, Via Muratori, Terni Italy. Tel ; Fax ; c.ghittino@pg.izs.it 25

2 INTRODUZIONE Fra le malattie emergenti che colpiscono i salmonidi vanno annoverate le infezioni sostenute da cocchi Gram positivi patogeni a temperatura dell acqua inferiore ai 12 C, note anche come Streptococcosi d acqua fredda (Ghittino et al., 2000; Ghittino & Pedroni, 2001). Nel loro ambito la Vagococcosi, o infezione da Vagococcus salmoninarum, è la più frequente, avendo una diffusione cosmopolita (Inglis et al., 1993; Austin & Austin, 1999): è infatti stata descritta in Nord America (Oregon, Idaho) (Wallbanks et al., 1990), Australia (Tasmania) (Schmidtke & Carson, 1994) ed Europa (Francia) (Michel et al., 1997). Focolai di malattia sono stati riscontrati anche in Italia, a partire dal 1993 (Ghittino et al., 1999). V. salmoninarum colpisce elettivamente soggetti subadulti ed adulti, di taglia superiore ai 100 g, allevati in acque con temperature intorno ai 10 C. Dà luogo ad un infezione a decorso cronico, con perdite annue che possono raggiungere il 20%. E caratterizzata da un andamento subdolo, in cui a lunghi periodi di latenza del germe seguono brevi accessi setticemici (Ghittino et al., 1999). Nel presente lavoro viene descritto il quadro clinico-anatomopatologico riscontrato negli episodi di Vagococcosi verificatisi nelle troticolture italiane, unitamente ai metodi diagnostici impiegati per l isolamento e l identificazione dell agente causale. Vengono inoltre riportati i risultati delle prove di infezione sperimentale condotte per stabilire la virulenza del germe nei confronti della trota iridea (Oncorhynchus mykiss). MATERIALE E METODI Nel corso dell ultimo decennio sono stati monitorati vari allevamenti italiani di trota iridea che lamentavano problemi sanitari riconducibili ad infezioni da cocchi Gram positivi. Soggetti venuti a morte e soggetti sintomatici appositamente sacrificati, sono stati sottoposti ad esame anatomopatologico. Contemporaneamente, sono stati effettuati prelievi di organi da sottoporre ad esame istologico: i campioni sono stati fissati in formaldeide al 4%, processati, colorati con Ematossilina-Eosina (E-E) e McCallum-Goodpasture ed osservati al microscopio ottico. Il prelievo per l esame batteriologico è stato effettuato in parallelo da rene, occhio e cervello; il materiale è stato seminato su piastre di agar sangue ed incubato a 22 ± 1 C e a 37 ± 1 C; in caso di positività, le colonie sono state sottoposte a colorazione di Gram e ai test identificativi mediante l impiego di gallerie biochimiche API 20 STREP, API 50 CH e API ZYM (biomèrieux), inoculate con sospensioni aventi densità ottica pari a McFarland 4 ed incubate a 22 ± 1 C per ore. L antibiogramma è stato allestito su Mueller-Hinton sangue incubato a 22 ± 1 C per 48 ore, secondo la metodica di Kirby-Bauer. La conferma identificativa è avvenuta tramite PCR, utilizzando primers specifici per Vagococcus salmoninarum - psal-1 (5 -GTTTTAGCCGCATGGCTGAGATAT-3 ) e psal-2 (5 -AGGTGGGAACAGTTACTCTCCCA-3 ) - seguendo la metodica impiegata da Zlotkin et al. (1998). Oltre agli isolati italiani, sono stati analizzati fenotipicamente e genomicamente alcuni ceppi provenienti da Francia (Bretagna) e Spagna (Aragona), oltre al ceppo di referenza di V. salmoninarum (ATCC 51200), di origine nordamericana (Oregon). La caratterizzazione sierologica è avvenuta tramite immunodiffusione in gel di agar (AGID), cimentando gli isolati in esame con un antisiero policlonale prodotto contro il ceppo di riferimento di laboratorio ITP-4545/97, isolato a Macerata (Marche) nel 1997, secondo il protocollo riportato da Prearo et al. (2002). 26

3 ITTIOPATOLOGIA, 2004, 1: La virulenza del germe per la trota iridea è stata valutata tramite prove d infezione sperimentale e calcolo della DL50, secondo il protocollo utilizzato da Ghittino et al. (1995). In acquari della capacità di 300 litri e con temperatura costante di 10 C, sono stati posti gruppi di 20 trote iridea sane di 200 g; cinque gruppi sono stati inoculati per via endoperitoneale, previa anestesia, con sospensioni decrescenti di V. salmoninarum (ceppo ITP 4545/97): 1 gruppo 1010ufc/pesce, 2 gruppo 109ufc/pesce, 3 gruppo 108ufc/pesce, 4 gruppo 107ufc/pesce, 5 gruppo 106ufc/pesce; il sesto gruppo, di controllo, è stato inoculato con soluzione fisiologica. RISULTATI La Vagococcosi è stata osservata esclusivamente in impianti riforniti da acque con temperatura di 8-11 C ed a carico di soggetti di pezzatura superiore ai 50 g. Tali allevamenti erano ubicati prevalentemente in zone di montagna. L area nella quale sono stati reperiti i principali focolai è quella dell Appennino Umbro-Marchigiano. I soggetti colpiti manifestavano letargia, anoressia, melanosi, accentuato esoftalmo bilaterale, spesso complicato da rottura dei globi oculari. Se la malattia veniva diagnosticata precocemente, la terapia medicata con ossitetraciclina (75 mg/kg p.v. die/10 giorni di trattamento) dava generalmente dei buoni risultati. In caso contrario, la precoce comparsa di anoressia impediva l assunzione di mangime medicato e ne scaturivano mortalità medie annuali del 10-20%. L esame necroscopico ha mostrato quadri di protrusione dei globi oculari, anemia branchiale (più spiccata nei soggetti con rottura dei globi stessi), congestione cerebrale, idropericardio accompagnato da pericardite, splenomegalia, lievi emorragie a carico di fegato, vescica natatoria e peritoneo (Fig. 1 e 2). Gli altri organi sono apparsi nella norma. Figura 1 - Trota iridea colpita da Vagococcosi (stadio subacuto): marcato esoftalmo. Figure 1 - Rainbow trout affected by Vagococcosis (subacute phase): marked exophthalmos. 27

4 Figura 2 - Trota iridea colpita da Vagococcosi (stadio cronico): rottura del globo oculare. Figure 2 - Rainbow trout affected by Vagococcosis (chronic phase): disrupture of the eye ball. L esame istologico dei preparati colorati con E-E ha messo in evidenza una panoftalmite associata a spiccata cheratite (Fig. 3), nonché una sierosite localizzata soprattutto a livello delle meningi (Fig. 4) e dell epicardio. I preparati colorati con McCallum-Goodpasture hanno rilevato frequente presenza di cluster di coccobacilli Gram positivi nell ambito dell umore vitreo. L esame colturale ha evidenziato crescita, dopo ore d incubazione, di colonie biancastre, circondate da alone di α-emolisi. La colorazione di Gram ha visualizzato coccobacilli Gram positivi, disposti in paia o in corte catenelle. La crescita si è verificata solo sulle piastre incubate a 22 C e non su quelle incubate a 37 C. L isolamento batterico è avvenuto nel 100% dei prelievi effettuati da occhio e cervello, ma solo nel 10% dei prelievi renali. Le prove biochimiche condotte su gallerie API 20 STREP, API 50 CH e API ZYM (biomèrieux), hanno permesso di identificare orientativamente tutti gli isolati come V. salmoninarum (Tabella 1). In vitro, i ceppi isolati si sono dimostrati sensibili nei confronti delle tetracicline, mentre hanno manifestato una sensibilità intermedia per l eritromicina e una resistenza verso sulfamidici (sulfametoxazolo + trimethoprim) e chinoloni (flumechina). La metodica in PCR ha evidenziato, in caso di positività per V. salmoninarum, una banda specifica delle dimensioni di 300 paia di basi sui gel di agarosio. Questa è risultata amplificata sia per il ceppo di referenza ATCC che per i ceppi italiani, francesi e spagnoli (Fig. 5). 28

5 ITTIOPATOLOGIA, 2004, 1: Figura 3 - Sezione di globo oculare (E-E): panoftalmite e cheratite. Figure 3 - Section of the eye ball (H-E): panophthalmitis and keratitis. Figura 4 - Sezione di cervello, spazio di Virchow (E-E): meningite. Figure 4 - Section of the brain, Virchow s space (H-E): meningitis. 29

6 Figura 5 - Identificazione di Vagococcus salmoninarum con PCR: corsia 1 = V. salmoninarum ATCC T (Oregon, USA); 2 = V. salmoninarum ITP-4545/97 (Marche) 3 = V. salmoninarum (Piemonte); 4 = V. salmoninarum (Bretagna, Francia); 5 = V. salmoninarum (Aragona, Spagna); 6 = Carnobacterium piscicola ATCC T ; 7 = Lactococcus garvieae (Lombardia). Figure 5 - PCR identifcation of Vagococcus salmoninarum: lane 1 = V. salmoninarum ATCC T (Oregon, USA); 2 = V. salmoninarum ITP-4545/97 (Marches, Italy) 3 = V. salmoninarum (Piedmont, Italy); 4 = V. salmoninarum (Brittany, France); 5 = V. salmoninarum (Aragon, Spain); 6 = Carnobacterium piscicola ATCC T ; 7 = Lactococcus garvieae (Lombardy, Italy). All AGID tutti gli isolati italiani hanno reagito positivamente nei confronti dell antisiero prodotto, mentre gli isolati francesi e spagnoli hanno reagito negativamente. Le prove di infezione sperimentale hanno messo in luce i seguenti aspetti: 1) al 10 giorno post-inoculazione assenza di sintomatologia, conservazione dell appetito e della vitalità in tutti i gruppi; 2) al 20 giorno assenza di sintomatologia, conservazione dell appetito e della vitalità nei gruppi 3-4-5; modico esoftalmo bilaterale, melanosi, scarsa vitalità e appetito diminuito nei gruppi 1-2; 3) al 30 giorno assenza di sintomatologia, conservazione dell appetito e della vitalità nel gruppo 5; lieve letargia nei gruppi 3-4; lieve esoftalmo bilaterale, melanosi, letargia e mortalità del 10% nel gruppo 2; evidente esoftalmo bilaterale, melanosi, letargia e anoressia, nonché mortalità del 15% nel gruppo 1; 30

7 4) al 40 giorno assenza di sintomatologia, conservazione dell appetito e della vitalità nel gruppo 5; lieve letargia nei gruppi 3-4; grave esoftalmo bilaterale, melanosi, letargia, anoressia, con mortalità del 50% nel gruppo 2; grave esoftalmo bilaterale, con rottura dei globi oculari, melanosi, letargia e anoressia, nonché mortalità del 60% nel gruppo 1. Non si è osservata alcuna sintomatologia né comparsa di mortalità nei soggetti del gruppo di controllo. L esame anatomopatologico dei soggetti morti, presentanti la sintomatologia descritta, ha messo in evidenza quadri di cheratite, anemia branchiale, meningite, pericardite, splenomegalia e modica presenza di emorragie epatiche e peritoneali. Da tali esemplari è stato costantemente reisolato V. salmoninarum, con realizzazione del postulato di Koch. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Il monitoraggio effettuato nell ultimo decennio negli allevamenti italiani colpiti da Vagococcosi ha permesso di constatare una sua maggior prevalenza nei distretti dell Appennino Umbro-Marchigiano. La temperatura ideale per lo sviluppo della malattia è risultata essere di 8-11 C; rari focolai sono però stati osservati anche a 12 C. Le taglie di trote maggiormente coinvolte sono risultate essere quelle superiori ai 100 grammi, ma casi sporadici hanno riguardato anche soggetti di pezzatura inferiore (50 g). Clinicamente la Vagococcosi ha mostrato un tipico andamento cronicizzante, con precoce anoressia, letargia e melanosi; nelle fasi iniziali della malattia (stadio subacuto) è stato riscontrato esoftalmo bilaterale molto accentuato, che evolveva in rottura dei globi oculari nelle fasi più avanzate (stadio cronico). L isolamento batterico è stato possibile solo nel 10% dei prelievi renali, a differenza del 100% dei prelievi oculari e cerebrali. Ciò è da mettere in relazione alla rarità degli accessi setticemici, a fronte di una frequente localizzazione a carico dell occhio, peculiare bersaglio del germe. Ne sono una conferma i cluster batterici riscontrati a carico dell umore vitreo e messi in evidenza tramite colorazione di McCallum-Goodpasture. In vitro, V. salmoninarum è cresciuto a 22 C, ma non a 37 C, caratteristica che permette una sua rapida differenziazione da Lactococcus garvieae. L impiego di gallerie API 20 STREP, API 50 CH e API ZYM ha consentito un affidabile identificazione biochimica del germe che, a differenza di Lactococcus garvieae, è risultato arginina deidrolasi e α- glucosidasi negativo e non acidificante il galattosio. La PCR si è rivelata rapida ed affidabile come metodica di conferma identificativa, sia nei confronti dei ceppi italiani che di quelli francesi e spagnoli. La caratterizzazione sierologica mediante AGID ha messo in evidenza una eterologia antigenica tra gli isolati di campo italiani e quelli francesi e spagnoli: mentre i primi sono risultati appartenere tutti ad un unico sierotipo, i secondi ed i terzi non hanno reagito nei confronti del siero iperimmune di coniglio prodotto contro il ceppo di riferimento di laboratorio ITP-4545/97. Le prove d infezione sperimentale hanno dimostrato come, nella trota iridea di taglia intorno ai 200 grammi, per il raggiungimento della DL 50 occorrano circa 40 giorni, dopo challenge per via endoperitoneale con concentrazioni virulente di V. salmoninarum pari a 10 9 ufc/pesce. Tali risultati sembrano confermare il lungo periodo di incubazione e l andamento tipicamente cronico della Vagococcosi. 31

8 Caratteristiche colturali α glucosidasi [16] - Arbutina [24] + Morfologia Coccobacillo N-acetil- β- glucosaminidasi [18] - Esculina [25] + Emolisi α α mannosidasi [19] - Salicina [26] + Crescita a/in: 10 C + α fucosidasi [20] - Celiobiosio [27] + 25 C + Maltosio [28] [+] 37 C - Fermentazione degli zuccheri Lattosio (LAC) [29] - ph 9,6 + Glicerolo [1] - Melibiosio [30] - NaCl 6,5% - Eritrolo [2] - Saccarosio [31] [+] D-arabinosio [3] - Trealosio (TRE) [32] + Attività enzimatica L-arabinosio (ARA) [4] - Inulina (INU) [33] - Produzione acetoina (VP) w Ribosio (RIB) [5] [+] Melezitosio [34] - Idrolisi ippurato (HIP) w D-xilosio [6] - D-raffinosio (RAF) [35] - β-glucosidasi (ESC) [17] + L-xilosio [7] - Amido (AMD) [36] - Pirrolidonil-arilamidasi (PYRA) + Adonitolo [8] - Glicogeno (GLYG) [37] - α-galattosidasi (αgal) [13] - β-metil-d-xiloside [9] - Xilitolo [38] - β glucuronidasi (βgur) [15] - Galattosio [10] - β-gentiobiosio [39] + β galattosidasi (βgal) [14] - D-glucosio [11] + D-turanosio [40] - Fosfatasi alcalina (PAL) [2] - D-fruttosio [12] + D-lixosio [41] - Leucina arilamidasi (LAP) [6] w D-mannosio [13] + D-tagatosio [42] [+] Arginina diidrolasi (ADH) - L-sorbosio [14] - D-fucosio [43] - Esterasi [3] w Ramnosio [15] - L-fucosio [44] - Esterasi-Lipasi [4] + Dulcitolo [16] - D-arabitolo [45] - Lipasi [5] - Inositolo [17] w L-arabitolo [46] - Valina arilamidasi [7] [+] Mannitolo (MAN) [18] [+] Gluconato [47] - Cistina arilamidasi [8] - Sorbitolo (SOR) [19] [+] 2-cheto-gluconato [48] - Tripsina [9] - α-metil-d-mannoside [20] - 5-cheto-gluconato [49] - α chimotripsina [10] w α-metil-d-glucoside [21] - Fosfatasi acida [11] w N-acetil-glucosamina [22] + Naftol-AS-BI-fosfoidrolasi [12] w Amigdalina [23] [+] Legenda: (Sigla) = test su galleria API 20 STREP; [Numero] = test su galleria API ZYM e API 50 CH; + = reazione positiva; w = reazione debole; [+] = reazione ritardata; - = reazione negativa Tabella 1. Caratterizzazione colturale e biochimica di Vagococcus salmoninarum. Table 1 -Cultural and biochemical characterization of Vagococcus salmoninarum. 32

9 BIBLIOGRAFIA Austin B. & Austin D.A. (1999). Bacterial fish pathogens. Disease of farmed and wild fish, 3 ed. Praxis Publishing, Chichester, England: Ghittino C., Prearo M., Bozzetta E. & Eldar A. (1995). Caratterizzazione della patogenicità dell agente eziologico della Streptococcosi ittica e prove di vaccinazione in trote iridea. Boll. Soc. It. Patol. Ittica, 16: Ghittino C., Accornero P., Prearo M., Rogato F., Zlotkin A. & Eldar A. (1999). Le streptococcosi d acqua fredda nei salmonidi, con particolare riferimento all infezione da Vagococcus salmoninarum. Atti Tavola Rotonda sulle Streptococcosi Ittiche, IZS Torino, 23/4/1999. Ghittino C., Prearo M., Accornero P., Lo Bello C., Di Raimo E., Mazzone P. & Eldar A. (2000). Recenti acquisizioni sulle Streptococcosi d acqua fredda nella trota iridea. Atti VII Conv. Naz. Soc. It. Patol. Ittica, Riva del Garda (TN), 28-29/9/2000. Ghittino C. & Pedroni A. (2001). Principali patologie batteriche dei salmonidi: diagnosi, terapia e prevenzione. In Baruchelli Troticoltura moderna, ESAT notizie, suppl. al n.4: Inglis V., Roberts R.J. & Bromage N.R. (1993). Bacterial diseases of fish. Blackwell Scientific Publications, Oxford, England: 181. Michel C., Nougayrede P., Eldar A., Sochon E. & de Kinkelin P. (1997). Vagococcus salmoninarum, a bacterium of pathological significance isolated from diseased salmonid fish. Dis. Aquat. Org., 30: Prearo M., Cabra S., Accornero P., Latini M., Gilli P., Agnetti F. & Ghittino C. (2002). Uso della tecnica di immunoprecipitazione in gel di agar nella diagnosi di Lattococcosi della trota iridea. Boll. Soc. It. Patol. Ittica, 37: Schmidtke L.N. & Carson J. (1994). Characteristics of Vagococcus salmoninarum isolated from diseased salmonid fish. J. Appl. Bacteriol., 77: Wallbanks S., Martinez-Murcia A.J., Fryer J.L., Phillips B.A. & Collins M.D. (1990). 16S rrna sequence determination for members of the genus Carnobacterium and related lactic acid bacteria and description of Vagococcus salmoninarum sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 40: Zlotkin A., Eldar A., Ghittino C. & Bercovier H. (1998). Identification of Lactococcus garvieae by PCR. J. Clin. Microbiol., 36: