Ricerche Microbiologiche: procedure Standard del Regno Unito

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1 1\ Ricerche Microbiologiche: procedure Standard del Regno Unito Ricerca di parassiti in campioni diversi dal sangue Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE Batteriologia B 31 Emissione no: 5 Data emissione: Pagina: 1 di 60 Crown copyright 2017

2 Ringraziamenti Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici. Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Microbiology Services Division Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ [email protected] Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida dell Health Protection Agency (HPA) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare Website: Numero di accesso alle pubblicazioni PHE: Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di: I loghi sono aggiornati al momento della pubblicazione Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 2 di 60

3 Contenuti Ringraziamenti... 2 Tabella modifiche... 5 SMI RU: scopo e obiettivo... 6 Scopo del documento... 9 Introduzione... 9 Percentuale di portatori... 9 Informazione tecnica/limitazioni Considerazioni sulla sicurezza Prelievo del campione Trasporto, conservazione e mantenimento Processazione campione/procedura Procedura di refertazione Notifica alla PHE o equivalente Appendice 1: Tipologia dei campioni e possibili parassiti identificabili Appendice 2: Distribuzione geografica delle infezioni parassitarie Appendice 3: Calibrazione del microscopio per componenti fecali Appendice 4: Comuni costituenti microscopici delle feci Appendice 5: Dimensioni comparative delle uova di elminti Appendice 6: Oocisti di coccidi/cryptogregaria/microsporidi appendice 7: Confronto fra tenie riscontrate nell'uomo Appendice 8: Larve di elminti - caratteristiche Appendice 9: Identificazione di trofozoiti di ameba in strisci colorati Appendice 10: Balantidium coli - trofozoite e cisti Appendice 11: Identificazione delle cisti di amebe e flagellati Appendice 12: Identificazione di trofozoiti flagellati Appendice 13: Microfilarie riscontrate nell'uomo Bibliogafia Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 3 di 60

4 NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio Informazioni più dettagliate sull accreditamento possono essere consultate: Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 4 di 60

5 Tabella delle modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità. Modifica numero/data Emissione eliminata no. 4.1 Emissione inserita no. 5 Data anticipata prossima revisione* Sezione(i) interessate. Intero documento Modifica. Aggiornato lo scopo del documento per includere i metodi molecolari e tradizionali utilizzati per la rilevazione dei parassiti. Aggiornata la Sezione delle Limitazioni Tecniche. Aggiornata la Sezione delle Considerazioni sulla Sicurezza. Aggiunta bibliografia. Aggiunti altri schemi nelle appendici. * Le revisioni possono essere estese fino a cinque anni in funzione delle risorse disponibili. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 5 di 60

6 SMI RU : scopo e obiettivo Ricerca di parassiti in campioni diversi dal sangue Utilizzatori delle SMI Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione. Informazioni di base per le SMI Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione. La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di garantire in tutto il Regno Unito strategie d indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le attività di ricerca e di sviluppo. Coinvolgimento delle organizzazioni professionali Lo sviluppo delle SMI è condotto in condizione paritaria da PHE, NHS,Royal College of Patholoogists e organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito L'inclusione del logo di un organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del Comitato Direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei partecipanti non sono necessariamente quelle espresse da tutta l'organizzazione che essi rappresentano. I rappresentanti agiscono da tramite con funzione di collegamento bi-direzionale per informazione e dialogo. Le attività di rappresentanza sono ricercate tramite un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate, revisionate e aggiornate tramite un ampio processo di consultazione. Assicurazione di qualità La NHS Evidence ha accreditato la procedura usata dai SMI Working Groups per produrre le SMI. L accreditamento è applicabile a tutte le linee guida emesse dall Ottobre La procedura per losviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria attività tutti i laboratoridi microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 6 di 60

7 NICE e rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell accreditamento con la promozione di procedure d elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Le prestazioni della SMI dipendono da personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e che i risultati siano idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno. Coinvolgimento del paziente e della comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato, la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l accesso libero al nostro sito web. Informazione della gestione dei dati sensibili La PHE è un organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza.lhttps:// government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity. I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti. Dichiarazione legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche e avere la consapevolezza che la PHE e le altre organizzazioni non si fanno carico di queste modifiche. Per evitare ulteriori dubbi si precisa che le SMI sono state sviluppate per essere applicate nel RU, e qualsiasi uso al di fuori di questa sede è a rischio dell utilizzatore. Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell ente accreditato NICE. I diritti d autore delle SMI sono della Crown e questi dovrebbero essere riconosciuti ove appropriato. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 7 di 60

8 Citazione suggerita per questo documento Public Health England. (2017). Investigation of specimens other than blood for parasites. UK Standards for Microbiology Investigations. B 31 Emissione 5. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 8 di 60

9 Scopo del Documento Tipo di campione Feci, urine, vetrino con nastro adesivo, tampone perianale, LCR, bile, pus da ascessi, aspirati duodenali / digiunali, tessuti, csti idatidea, espettorato/lavaggio broncoalveolare biopsie da colonscopia o chirurgia. Questa SMI UK descrive la ricerca e l'isolamento di una vasta gamma di parassiti (protozoi, nematodi, trematodi, cestodi) e organismi in precedenza con status tassonomico tradizionalmente incerto, inclusi i protozoi isolati da diversi campioni clinici, con esclusione di quelli ematici e isolati da raschiatura del tessuto corneale. Per la ricerca di Acanthamoeba nel tessuto da raschiatura corneale fare riferimento a B 2 Investigation of bacterial eye infections. Questo documento tratta in modo dettagliato i metodi tradizionali e molecolari di rilevazione. Questa SMI del RU dovrebbe essere utilizzata in combinazione con le altre SMI del RU. Introduzione Sebbene i campioni fecali siano quelli più frequentemente inviati al laboratorio per la ricerca dei parassiti, molti altri diversi tipi di parassiti possono essere isolati da vari altri materiali inviati in laboratorio. In questa sede sono descritti i quadri clinici, la preparazione dei campioni e l identificazione dei parassiti più frequentemente identificati presso i laboratori, ma ne possono essere riscontrati anche altri. Per completezza sono descritte anche le specie di non frequente osservazione. I Laboratori di Riferimento devono essere utilizzati per identificare i parassiti che non fanno parte della normale attività diagnostica del laboratorio. Anche laboratori di ematologia, istologia e sierologia possono contribuire in modo significativo alla diagnosi delle infezioni da parassiti. Questa introduzione descrive: protozoi - amebae - flagellati/ciliati - coccidi - cryptogregaria nematodi trematodi cestodi protozoi Percentuale di portatori La percentuale di portatori varierà tra i diversi parassiti e dipenderà in gran parte: specie infettante di parassita distribuzione geografica Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 9 di 60

10 stagioni migrazione e viaggi residenza età scarsa igiene precedente esposizione suscettibilità predisponente quale immunocompromessione (ad esempio, AIDS, malnutrizione) Protozoi 2 Amebe intestinali Le Amebe che possono essere isolate dal tratto gastrointestinale includono Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii, Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Endolimax nana and Iodamoeba butschlii. Tutte, tranne E. histolytica, di solito non sono patogene (consultare Appendici 9-11). E. histolytica ed E. dispar sono morfologicamente indistinguibili al microscopio ottico 3. Delle due specie, solo E. histolytica è in grado di indurre una malattia a carattere invasivo. Quando la diagnosi è posta con l osservazione al microscopio ottico, le cisti devono essere segnalate come E. histolytica / E.dispar 4. In alternativa, i metodi diagnostici inclusi la ricerca dell antigene con saggio immunoenzimatico o la ricerca del DNA mediante PCR 2,4, potrebbero essere effettuati dai laboratori in modo differenziare questi due specie 2,3,5. Qualora ciò non fosse possibile, si consiglia ai laboratori di inviare i campioni ad appropriati specialisti per un ulteriore conferma, E. histolytica può produrre lesioni di tipo ulcerativo ed infiammatorio nel colon. Diffonde in sedi extraintestinali, più frequentemente epatica, dove si manifestano estese lesioni dei tessuti, che possono provocare formazione di ascessi. L'infiammazione del colon produce sintomi di dissenteria che includono dolore addominale al quadrante inferiore, aumento della frequenza dei movimenti intestinali e feci liquide. L infezione può provocare la perforazione del colon, megacolon tossico, ameboma, e ulcerazione perianale 4. Campioni appropriati includono i liquidi aspirati o raschiamenti da un area di tessuto intestinale o rettale sede d infiammazione in corso di dissenteria e le feci di emissione recente per l esame microscopico a fresco e con il metodo della concentrazione con etere/formolo. Il rilievo nei campioni fecali, o in quelli tissutali, di trofozoiti con emazie ingerite suggerisce la probabile diagnosi di malattia invasiva da E. histolytica 2. Amebe a vita libera L infezione nell uomo da amebe a vita libera è infrequente. Questi protozoi includono: specie Acanthamoeba, Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris e Sappinia diploidea 6. Le infezioni causano l invasione del sistema nervoso centrale, prevalentemente nei soggetti immunocompromessi e cheratite da acanthamoeba, di solito in pazienti con lenti a contatto. Meningoencefalite primitiva amebica (MPA) è causata dalla N. fowleri. Si manifesta negli adulti e nei bambini che hanno da poco nuotato in acque dolci calde infette. I microrganismi raggiungono la sede del sistema nervoso centrale per invasione diretta attraverso la mucosa nasale. Non si Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 10 di 60

11 dispone di trattamento terapeutico efficace ed affidabile e la malattia è rapidamente a decorso infausto 6. Deve essere presa in considerazione la MPA quando i pazienti sviluppano meningite o meningoencefalite purulenta ed un anamnesi di esposizione recente ad acqua dolce. Il conteggio dei globuli bianchi nel sangue periferico nella fase iniziale della malattia può essere basso, ma aumenta nel tempo. L aspetto del liquido cefalorachidiano (LCR) è emorragico, la glicorrachia è ridotta o normale e la protidorrachia aumentata. La diagnosi di laboratorio si avvale dell esame di un preparato in sospensione di LCR e di uno colorato per trofozoiti di ameba (consultare Appendice 9 e 10). L encefalopatia granulosa amebica (EGA) è causata dalle specie Acanthamoeba e Balamuthia mandrillaris. E un infezione opportunistica cronica, si manifesta più frequentemente in pazienti immuodepressi/aids, diffondendo al sistema nervoso centrale per via ematogena dal polmone o da lesioni cutanee ed è spesso ad esito letale. La cheratite da Acanthamoeba è associata all uso di lenti morbide a contatto e a traumatismi oculari; se non trattata immediatamente, può indurre un ulcerazione corneale ed eventualmente cecità. Le specie Acanthamoeba possono essere inoltre isolate dal liquido per lenti a contatto di soggetti privi di segni o sintomi di malattia. (fare riferimento a B 2- Investigation of bacterial eye infections) 6. L EGA può essere diagnosticata esaminando materiale bioptico cerebrale. In corso di meningoencefalite amebica è frequente la presenza di infezione cutanea da EGA; si possono eseguire biopsie su noduli cutanei od ulcerazioni poi esaminati con microscopia su preparato in sospensione e colorato (consultare Appendice 9). Sono disponibili anche metodi sierologici. Flagellati Giardia intestinalis (sinonimo di Giardia duodenalis e Giardia lamblia) 7 Questo microrganismo può causare epidemie diarroiche d origine idrica ed è prevalentemente diffuso per via oro-fecale da persona a persona o da animali 2. L infezione può manifestarsi con diarrea autolimitante o con sindrome diarroica cronica, steatorrea, malassorbimento e perdita di peso. I sintomi includono diarrea, crampi, gonfiore addominale e flatulenza. Possono manifestarsi vomito, febbre e tenesmo, ma l infezione può anche essere di tipo asintomatico 2. La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con l esame microscopico di feci, o mediante la ricerca dell antigene con test immunoenzimatici (EIA) o immunocromatografia a flusso laterale (ICLF) o PCR. Reazioni positive borderline e negative di dubbia interpretazione ottenute con EIA e ICLF dovrebbero essere confermate da un altro metodo 7. La microscopia è scarsamente sensibile (31%) rispetto alla PCR e i risultati evidenziano un raddoppio delle percentuali di rilevamento utilizzando EIA automatizzati 8,9. Un studio di ridotte dimensioni con EIA ha segnalato falsi positivi rispetto alla PCR 10. La sensibilità relativa dei metodi può dipendere dalla preparazione dei campioni e usati nella prova 11. Per via della variabile diffusione dei microrganismi, devono essere esaminati diversi campioni di feci, in modo particolare se si utilizza la microscopia. In teoria, dovrebbe essere esaminato complessivamente un totale di tre campioni raccolti a distanza di 2-3 giorni. La diagnosi può essere ottenuta anche con l'esame microscopico di aspirato duodenale o digiunale, e biopsie (consultare Appendice 11). Trofozoiti mobili possono essere osservati all esame diretto delle feci fresche, aspirati duodenale e digiunale mentre le cisti possono essere riscontrate in un preparato con fisiologica diretta o con concentrazione di feci con formolo-etere / acetato di etile. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 11 di 60

12 Nota: Si deve notare che non è possibile identificare trofozoiti o cisti a livello di specie mediante microscopia ottica. Sono necessari test molecolari non attualmente disponibili a livello nazionale. La sierologia non è utile e non è più disponibile nel Regno Unito. Dientamoeba fragilis 2 La patogenicità della Dientamoeba fragilis è incerta, comunque sono stati documentati casi di diarrea non invasiva associati ad astenia. Diversamente da altri protozoi, non possiede uno stadio cistico, ed è ora considerata come ameba/flagellata. Il ruolo della Diantoameba nei pazienti affetti da HIV e disordini intestinali è incerto e richiede ulteriori ricerche 12. Nei preparati emulsionati in fisiologica è molto difficile rilevare lo stadio di trofozoite, come pure in preparati di formolo-etere concentrati. Possono essere rilevati in materiale fecale con colorazioni quali tricromica, Giemsa o di Field (TP 39 - Staining Procedures). Sono stati sviluppati metodi alternativi che comprendono la ricerca del DNA con la PCR 12. Trichomonas vaginalis e Pentatrichomonas hominis Nelle infezioni dell uomo possono essere isolati Trichomonas vaginalis e Pentatrichomonas hominis. La maggior parte delle Infezioni da T. vaginalis è a trasmissione sessuale, e si manifesta principalmente nel tratto genitourinario, mentre P. hominis colonizza l intestino crasso e, di solito, non è considerata patogena, sebbene possa causare moderati sintomi gastro-intestinali se presente in alta carica (B28 Investigation of Genital Tract and Associated Specimens) 13. La diagnosi di laboratorio è di solito ottenuta con l esame microscopico per presenza di trofozoiti mobili di un preparato emulsionato in fisiologica. Possono anche essere allestiti preparati con colorazione di arancio di acridina, sebbene ciò comporti la disponibilità di un microscopio a fluorescenza e la conseguente perdita d immediatezza. Per Trichomonas vaginalis è stata sviluppata la ricerca del DNA con la PCR 14,15. Ciliati Balantidium coli B. coli è un ciliato che parassita numerosi mammiferi, inclusi l uomo e i maiali ed è presente ovunque. Di solito gli uomini sono resistenti all infezione da B. coli, ma l acloridria o la nutrizione insufficiente può aumentare il rischio di colonizzazione. La colonizzazione spesso è asintomatica. I pazienti possono sviluppare diarrea liquida intermittente o colite dissenterica acuta con feci contenenti muco e sangue 2. Dotati di rapidi movimenti, i grandi trofozoiti possono essere rilevati al microscopio nelle feci appena emesse (consultare Appendice 10). Nei campioni conservati la diagnosi è di tipo microscopico con preparato in sospensione, infatti i trofozoiti e le forme cistiche si colorano in modo indistinto con lo iodio o con le colorazioni permanenti 1. Coccidi Cyclospora L infezione da Cyclospora è presente in numerosi paesi tropicali e le epidemie possono essere associate all assunzione di acqua potabile contaminata o ingestione di cibo contaminato e colpiscono i viaggiatori e gli stranieri residenti Epidemie di origine alimentare sono state segnalate in Nord America e in Europa associate al consumo di frutti di bosco importati, foglie di insalata, erbe aromatiche e verdura,19,20. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 12 di 60

13 I sintomi dell infezione da Clyclospora includono diarrea liquida, perdita di peso, nausea, vomito e dolore addominale. L infezione da Cyclospora cayetanesis è stata inoltre segnalata in pazienti infettati da HIV 21. La diagnosi di laboratorio si avvale dell aspetto delle oocisti nei preparati in sospensione, possono essere utilizzati metodi di concentrazione. Le oocisti danno una caratteristica autofluorescenza blu a nm. Come colorazione permanente può essere utilizzata quella modificata di Ziehl- Neelsen. Cyclospora cayetanesis si colora in modo inadeguato con auramina-fenolo (consultare TP 39 - Staining Procedures e Appendice 3 e 6). Presso i laboratori di riferimento è disponibile la conferma al microscopio e il test in PCR. Non esiste un sistema standardizzato per la sottotipizzazione di Cyclospora cayetanensis. Cystoisospora belli (in precedenza Isospora belli) 2 L infezione da Cystoisospora belli è relativamente infrequente nei paesi sviluppati, ma è endemica in alcune parti del mondo. Di solito è trasmessa con ingestione di acqua o alimenti contaminati Nei pazienti immunocompetenti può determinare diarree liquide aspecifiche, autolimitanti associate a malessere, anoressia, crampi addominali e perdita di peso, mentre nei pazienti immunocompromessi può presentarsi come infezione grave causando diarrea grave con alterazioni del quadro elettrolitico e condizione patologica 22. I pazienti affetti da AIDS sono particolarmente predisposti all infezione da Cystoisospora belli (ciò è particolarmente frequente nei paesi sottosviluppati, in particolare in Africa e Medio Oriente, dove, l'incidenza varia da 0,2% a 20% nei pazienti con AIDS 23. La diagnosi di laboratorio è ottenuta con l esame microscopico di un campione fecale o di muco intestinale. E raccomandata la concentrazione delle feci con formolo-etere; in quanto, le specie Cyclospora, Cystoisospora, sono auto fluorescenti a nm (consultare TP 39 - Staining Procedures e Appendici 3 e 6). Per rilevare Cystoisospora belli nei campioni fecali è stata sviluppata una PCR 24. Sarcocystis Le Infezioni da specie Sarcocystis sono origine zoonotica. Le specie Sarcocystis differiscono dagli altri coccidi in quanto richiedono due ospiti per completare il loro ciclo vitale. L uomo diviene ospite intermedio dopo assunzione di carne cotta in modo incompleto dell ospite primario contenente sarcocisti. La maggior parte di queste infezioni è asintomatica, ma sintomi, quali dolore addominale, nausea, gonfiore addominale e diarrea possono essere correlati alla presenza di sporocisti nelle feci. Nell uomo la sarcocistosi muscolare è conseguente all infezione da ingestione di carne infetta o trasmessa da manipolazione di gatti infetti. In questo caso i sintomi comprendono dolenzia o tumefazione muscolare. Le tecniche di diagnosi di laboratorio sono le stesse di quelle per le specie Cystoisospora essendo presenti sporocisti mature nelle feci a partire dal nono giorno dall avvenuta infezione. Microscopicamente non sono facilmente differenziabili da quelle delle specie Cystoisospora, e pertanto l identificazione deve essere eseguita da un Laboratorio di Riferimento. Toxoplasma Nella maggior parte dei pazienti immunocompetenti l infezione da Toxoplasma gondii è asintomatica, possono comunque manifestarsi sintomatologia febbrile, malessere, linfoadenopatia encefalite e mialgia. Si può manifestare malattia a sede oculare. Le infezioni possono essere primitive o da riattivazione. La riattivazione di un infezione latente si manifesta in pazienti divenuti gravemente immunocompromessi. L infezione fetale può essere determinata da un infezione acuta contratta durante la gravidanza. Per ulteriori informazioni sulla ricerca di Toxoplasma in gravidanza è consigliabile contattare l appropriato Laboratorio di Riferimento specializzato. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 13 di 60

14 Le procedure diagnostiche di laboratorio comprendono l'esame microscopico diretto dei tachizoiti del Toxoplasma gondii nel liquido broncoalveolare di lavaggio (BAL) colorati con Giemsa e PCR. La PCR è stata in grado di fornire risultati migliori soprattutto in laboratori dove si dispone di minor esperienza microbiologica 25. I metodi alternativi includono saggi sierologici, la cultura e l'esame istologico. La sierologia rappresenta ancora il test standard di riferimento utilizzata nel trapianto di organi e per i pazienti affetti da HIV, anche se questi accertamenti possono fornire scarsi risultati nei pazienti immunocompromessi 25. Cryptogregaria Cryptosporidium Cryptosporidium è stato formalmente riclassificato dai Coccidi ad una nuova sottoclasse di parassiti gregarine, Cryptogregaria, in seguito a un approfondita revisione dei risultati della biologia molecolare 26. Nell uomo le specie Cryptosporidium possono causare diarree liquide profuse 27. I bambini sono particolarmente vulnerabili per la mancanza di immunità acquisita e per la scarsa igiene personale. L infezione presenta variazione stagionale con picchi d incidenza in primavera e autunno. L infezione crea particolari problemi negli immunocompromessi 2. La sintomatologia è di solito grave, con diarrea cronica e segni di malassorbimento, ma altri tipi di esordio comprendono una malattia gastrointestinale atipica, come colangite, colecistite, pancreatite ed epatite. Sono state segnalate pure affezioni del tratto respiratorio. La diagnosi primaria di laboratorio si avvale delle colorazioni per microscopia (TP 39 - Staining Procedures) o ricerca dell antigene con saggi immunoenzimatici o del DNA con PCR 28,29. Le prove di tipo specialistico includono la microscopia con immunofluorescenza, particolarmente sensibile, e i saggi PCR per identificazione di specie/genotipo che sono disponibili presso l appropriato Laboratorio specialistico di Riferimento. La sensibilità della microscopia con metodo modificato di Ziehl-Neelsen per rilevare le oocisti di Cryptosporidium ha dimostrato di essere significativamente inferiore rispetto ad altri test Altri microrganismi con tassonomia incerta Blastocystis hominis Descritti in precedenza come flagellati, lieviti, coccidi ed amebe, questo microrganismo costituisce un gruppo diverso classificato come stramenopiles 32 E dubbio il significato di B. hominis come patogeno umano 33. La presenza nelle feci in carica consistente (più di cinque microrganismi per campo ad elevato ingrandimento) è correlata a sintomi di nausea, dolore addominale, anoressia, flatulenza e diarrea 2. Per la diagnosi di laboratorio possono essere utilizzati la microscopia su preparato a fresco dopo concentrazione formolo-etere e strisci colorati con Giemsa e colorante di Fields o le confezioni di colorazioni differenziali per ottimizzare la ricerca di forme simili a cisti 34 consultare TP 39 - Staining Procedures). Metodi alternativi includono l esame colturale, PCR, ELISA e prove sierologiche. Le tecniche di coltura sono, molto probabilmente, più sensibili degli strisci diretti. E stata segnalata l'amplificazione del DNA specifico di Blastocystis con polymerase chain reaction direttamente dalle feci permettendo l'identificazione dei sottotipi di Blastocystis. Tuttavia, i test sierologici non sono attualmente utilizzati per la diagnosi di infezione da parte di questo organismo 35. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 14 di 60

15 Microsporidi Sono noti oltre 150 generi ed almeno 1500 specie di microsporidi. In patologia umana sono implicati i generi, Anncaliia (in precedenza Brachiola) Nosema, Encephalitozoon, Encephalitozoon, Microsporidium, Pleistophora, Trachipleistophora Tubulinosema e Vittaforma 36. Sono note almeno 15 specie di microsporidi che sono state identificate come agenti patogeni umani: Anncaliia algerae, Anncaliia connori, Anncaliia vesicularum, Encephalitozoon cuniculi, Encephalitozoon hellem, Encephalitozoon intestinalis, Enterocytozoon bieneusi, Microsporidium ceylonensis, Microsporidium africanum, Nosema ocularum, specie Pleistophora, Trachipleistophora hominis, Trachipleistophora anthropophthera, Vittaforma corneale, e Tubulinosema acridophagus. Questi sono microrganismi intracellulari obbligati presenti nei liquidi corporei, tessuti e tratto gastrointestinale. Originariamente classificati come parassiti, questi sono ora considerati fungi 37. La microsporidiosi rappresenta un problema particolare nei pazienti infettati da HIV 2. Questi ed altri pazienti immunocompromessi sono frequentemente infettati da parassiti opportunisti che nei soggetti immunocompetenti di solito non producono sintomatologia 38. La diarrea cronica rappresenta l aspetto clinico più eclatante dell infezione da HIV e rappresenta la causa predominante di morbilità e mortalità 39. La cherotocongiuntivite da Microsporidi è stata recentemente riscontrata in pazienti affetti da AIDS. Possono essere utilizzate colorazioni istologiche, tecniche immunologiche e la microscopia elettronica per identificare questi microrganismi nelle urine, espettorato, lavaggio broncoalveolare, bile, aspirato duodenale, feci, tessuti e nei raschiamenti corneali e congiuntivali. I Microsporidi possono essere evidenziati usando la colorazione tricromia (consultare TP 39 - Staining Procedures Appendici 3 e 6). Può essere eseguita l identificazione molecolare su feci utilizzando le PCR specie-specifiche che sono disponibili in commercio per Enterocytozoon bieneusi ed Encephalitozoon intestinalis (gia Septata intestinalis), Encephalitozoon hellem ed Encephalitozoon cuniculi. Pneumocystis jirovecii (in precedenza Pneumocistis carinii) 40 Era ritenuto un protozoo, ma è stato riclassificato ed ora è considerato un fungo parassita sulla base dai risultati delle analisi biochimiche e dell acido nucleico 41. E un microrganismo extracellulare che causa polmonite interstiziale con infiltrato plasmacellulare nei pazienti immunodepressi od immunosoppressi, nei prematuri, nei bambini ammalati e affetti da malnutrizione 42. I sintomi della polmonite da Pneumocystis includono dispnea, tosse non produttiva, e febbre. La polmonite da P jirovecii. è una comune infezione opportunistica frequente nei pazienti con AIDS (per maggiori informazioni, consultare B 57 - Investigation of Bronchoalveolar Lavage, Sputum and Associated Specimens). La diagnosi di laboratorio si avvale della colorazione dei campioni ottenuti da espettorazione indotta o da lavaggi bronco-alveolari (BAL). Questa può essere eseguita mediante colorazione con Giemsa o con impregnazione argentica o, più specificamente, con la ricerca dell antigene con metodo di immunofluorescenza diretta od indiretta. (consultare TP 39 - Staining Procedures). I metodi molecolari (PCR) hanno dimostrato di essere particolarmente utili per il rilevamento di P. jirovecii nei campioni clinici 43,44. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 15 di 60

16 Nematodi (Vermi rotondi) I Nematodi appartengono al phylum 'Nematodi'. Sono note più di specie descritte, molte delle quali sono di tipo parassitario. La diagnosi di laboratorio delle infestazioni da nematodi si avvale principalmente dell identificazione delle uova o delle larve emesse con le feci. Un preparato fecale emulsionato in soluzione fisiologica dopo concentrazione con formolo-etere/etil-acetato consente il rilievo microscopico delle uova (consultare Appendice 5). Ha pure valore diagnostico il rilevo macroscopico del parassita. In numerose infezioni parassitarie intestinali, inclusa la dissenteria amebica, possono presentare nelle feci cristalli di Charcot-Leyden. Questi sono caratteristici del coinvolgimento degli eosinofili disgregati in alcune reazioni dei tessuti. I cristalli esagonali proteici di Charcot-Leyden possono essere osservati con microscopia normale o in fluorescenza come aghi fluorescenti risplendenti di colore giallo verde 45,46. La presenza di eosinofilia tissutale e nel sangue periferico in viaggiatori di ritorno da un soggiorno prolungato, o da un viaggio in alcuni paesi in via di sviluppo, o in immigrati provenienti da aree tropicali, suggerisce la possibilità di un infezione da elminti 47. Alcune infezioni protozoarie possono causare anche eosinofila. La maggior presenza di eosinofila nei tessuti e nel sangue circolante si manifesta quando i parassiti raggiungono un contatto stretto con i tessuti, come per esempio quello delle larve migranti o per una loro estesa disseminazione in questa sede. Esempi sono rappresentati dalla trichinosi, larve viscerali migranti, polmonite da Ascaris, dalla strongiloidiasi, filariasi e schistosomiasi acuta. Organismi quali le tenie stazionano nell intestino e non invadono la mucosa, pertanto causano eosinofila di moderata entità oppure non la provocano affatto. Enterobius vermicularis Noto anche come ossiuro, determina prurito perianale e perineale, specialmente nei bambini 48. I parassiti migranti sono riscontrati nell appendice, salpingi e nelle lesioni ulcerative dell intestino tenue e del crasso, ma è incerta la loro correlazione con la con la patologia clinica (consultare Appendice 5). La diagnosi di laboratorio si avvale di solito dell esame microscopico di un preparato con nastro adesivo e/o di un campione perianale prelevato con tampone. Trichuris trichiura Noto come verme a frusta determina infezioni spesso asintomatiche 48. La perdita di sangue conseguente alle penetrazioni cefaliche delle forme adulte nella mucosa intestinale è di solito trascurabile, ma infezioni severe possono causare anemia di medio grado, diarrea ematica, disidratazione, sviluppo ritardato e prolasso rettale (consultare Appendice 5). La diagnosi di laboratorio è effettuata identificando le uova nelle feci. Nelle infezioni severe, le feci sono spesso mucoidi e contengono cristalli di Charcot-Leyden, mentre per la diagnosi delle infezioni lievi, sono necessari metodi di concentrazione. Ascaris lumbricoides 47,48 Questa infezione da nematodi è solitamente asintomatica. Comunque il verme è in grado di causare una grave malattia polmonare e di ostruire il tratto biliare e quello intestinale. Le larve migrano nei polmoni e possono causare eosinofilia ematica periferica e sintomatologia associata all infiltrazione polmonare. Nell espettorato si possono riscontrare larve al terzo stadio. Nei bambini con infezioni gravi la massa dei vermi può ostruire il lume dell intestino tenue. Ciò causa Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 16 di 60

17 distensione addominale, vomito e crampi, Può invadere anche il dotto biliare e causare dolore epigastrico, nausea e vomito (consultare Appendice 5). La diagnosi definitiva di laboratorio è di solito fornita dall' esame microscopico di uno striscio fecale. Possono anche essere utilizzate tecniche di concentrazione che comportano la flottazione o la sedimentazione delle uova. La diagnosi può essere ottenuta anche visivamente per presenza dello stadio adulto del verme di Ascaris lumbricoides nelle feci emesse di recente. Anchilostomi Due sono le specie note che causano infezione nell uomo: l Ancylostoma duodenale ed il Necator americanus 48. Le larve penetrano nella cute causando prurito intenso, eritema ed esantema papulare o vescicolare. Le larve migrano nei polmoni ove possono causare sintomatologia respiratoria ed eosinofilia nell espettorato e nel sangue periferico. Diversamente dal N. americanus, A. duodenale può causare infezione a seguito di penetrazione per via orale. I sintomi includono anemia, deficienza proteica cronica, dolore addominale, diarrea con perdita di peso e malassorbimento. Le uova dell anchilostoma possono essere riscontrate nei campioni fecali, ma non è possibile distinguere fra loro le specie se non dopo la loro schiusa (consultare Appendici 5 e 8). La diagnosi viene effettuata con l'esame microscopico diretto che evidenzia le uova nei campioni di feci. Si deve inoltre osservare che le due specie (cioè, sia Ancylostoma duodenale che Necator americanus) non possono essere differenziate in funzione della morfologia delle loro uova ma, nella maggior parte dei casi, dovrebbe essere usato il metodo di concentrazione con formoloetere/acetato di etile. Specie Trichostrongylus Noti anche come nematomorfo. Questi nematodi sono presenti in tutto il mondo, ma si riscontrano raramente negli paesi europei. Possono causare malattie nell uomo e sono associati a zone rurali, dove sono allevati animali erbivori. Le infezioni nell uomo avvengono dopo l'ingestione di larve infettanti presenti nell acqua acqua o vegetali contaminati. I sintomi includono dolore addominale, perdita di peso, diarrea, nausea, flatulenza e stanchezza generalizzata. L eosinofilia è spesso riscontrata nei pazienti sintomatici. La diagnosi è effettuata con l esame microscopico diretto che evidenzia le uova nei campioni di fecali. Strongyloides stercoralis Strongyloides stercoralis invade la mucosa intestinale e deposita uova a parete sottile che schiudono larve rabditoidi 47. Queste possono essere emesse con le feci o sviluppare nel lume intestinale larve infettive che possono provocare autoinfezione dell ospite. Questa può assumere andamento destruente nei pazienti immunocompromessi 48. La sintomatologia polmonare è molto simile a quella dell infezione da anchilostomi. Altri sintomi includono bruciore o coliche addominali dolorose, diarrea, emissione di muco, nausea, vomito, perdita di peso e malassorbimento. I pazienti possono sviluppare anche un esantema orticaroide generalizzato o localizzato, inizialmente perianale, che si estende poi alle natiche, addome e alle cosce. Il primo stadio delle larve (rabditoide) è di solito riscontrato nelle feci, mentre le uova sono presenti solo in caso di diarrea severa (consultare Appendice 8) 50. Per la diagnosi di strongiloidosi sono utili gli strisci diretti e i metodi concentrazione delle feci. Tuttavia, le indagini sierologiche sono un valido aiuto nella diagnosi. La PCR è considerata utile nella diagnosi di S. stercoralis nelle infezioni Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 17 di 60

18 croniche con precocità diagnostica di tre o quattro settimane rispetto ai metodi attualmente utilizzati 51. Infezioni insolite da nematodi La diagnosi di laboratorio delle infezioni di seguito descritte può essere superiore alle possibilità diagnostiche della maggior parte dei laboratori di routine. Poiché molte di queste infestazioni sono rare e si riscontrano solo nei paesi tropicali, si raccomanda che i campioni dei pazienti che presentano alcune peculiarità siano gestiti da un laboratorio di riferimento. Le specie Trichinella sono ingerite con carne poco cotta o cruda 47,52,. La maggior parte delle infezioni è asintomatica, ma la presenza nell intestino di un elevato numero di vermi adulti può causare diarrea, dolenzia addominale e vomito. Le larve si insediano nei muscoli scheletrici e causano febbre, edema peri-orbitale e miosite con dolore e rigonfiamento. L infezione è confermata con la sierologica o con la prova cutanea per la Trichinella. Di solito non è necessaria la biopsia muscolare. Larva viscerale migrante (LVM). Si tratta di larve note come Toxocariasi. Queste migrano dall intestino a fegato, polmone e trachea 47,53. L agente eziologico più frequente è la Toxocara canis. Le specie Toxocara e altre elminti (Ascaris lumbricoides, Gnathostoma spinigerum) possono pure essere associate alla sindrome. La LVM si manifesta principalmente nei bambini d età inferiore a sei anni. La maggior parte delle infezioni è asintomatica, anche se i pazienti possono presentare tosse, febbre, dispnea ed epatomegalia. Raramente le larve si localizzano nell occhio. L eosinofilia associata a leucocitosi è indicativa di LVM. Sono disponibili prove sierologiche. La larva migrante oculare è conseguente alla penetrazione delle larve di T. canis (e meno frequentemente di T. cati) che sono intrappolate nell occhio formando una massa infiammatoria eosinofila 34. La larva cutanea migrante, (LOM) o eruzione strisciante, è di solito causata dall Ancylostoma braziliense 53. Si presenta come lesione cutanea serpiginosa, arrossata, rilevata e pruriginosa. Questa manifestazione può essere causata da altri parassiti, come lo S. stercoralis. Le larve di specie Anisakis (associate ad ingestione di pesce crudo, es. sushi), specie Phocanema e altri generi, possono penetrare nello stomaco e nell intestino tenue e provocare sintomi addominali simulanti un appendicopatia 53. La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con endoscopia, studi radiologici o con esame istologico dei tessuti coinvolti. Gli accertamenti sierologici sono utili nella diagnosi di Toxocariasi e Trichinellosi. Angiostrongylus Le larve di Angiostrongylus cantonensis possono invadere il cervello e causare meningite associata a pleiocitosi eosinofila nel LCR e ad eosinofilia periferica 53. Le larve sono raramente rilevate nel LCR. G. spinigerum può causare una malattia simile. Gli esseri umani si infettano dopo ingestione di larve presenti in lumache crude o poco cotte, o acqua e verdure contaminate. La angiostrongyliasi addominale è causata da A. costaricensis 53,54. Le larve penetrano e si sviluppano nell intestino tenue e nel colon. La diagnosi di laboratorio può essere ottenuta con l esame di campioni bioptici. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 18 di 60

19 Capillaria e Paracapillaria 42,53 La capillariasi, è un infezione parassitaria causata una nuova specie di nematode, nota come Paracapillaria philippinensis (in precedenza Capillaria philippinensis) e da Capillaria hepatica, (nota come Calodium hepaticum) 55. P. philippinensis può presentarsi con diarrea, vomito, perdita di peso e malassorbimento, mentre C. hepatica può causare epatite acuta/subacuta con eosinofilia periferica e sintomi simili ai precedenti, compresi ascite e epatolitiasi. La principale fonte di acquisizione della capillariasi intestinale è dovuta all ingestione di pesce crudo di acqua dolce. Questa infezione si riscontra dopo pasto di pesce crudo nelle aree quali le Filippine 56. Per la diagnosi di laboratorio di questa infezione è richiesto l'esame di materiale fecale dopo concentrazione con formolo-etere / acetato di etile o materiale bioptico. Metodi alternativi comprendono immunodiagnosi, che può essere uno strumento diagnostico complementare che aiuta a rilevare infezioni da P. philippinensis, così come la PCR, che è stata usata con successo nella diagnosi rapida di P. philippinensis, evitando così il ritardo nella gestione e possibili complicazioni 56,57. Dracunculus L infezione da Dracunculus (Malattia da verme della Guinea) è causata dal parassita nematode Dracunculus medinensis (comunemente noto come Guinea worm). Questa infezione è caratterizzata da una ulcera cutanea cronica da cui il protrude il verme 52. Alcuni pazienti sviluppano una reazione generalizzata con orticaria, nausea, vomito, diarrea e dispnea. Si sviluppano ulcere dolose che producono liquido contenente le larve. Queste possono essere riscontrate all esame microscopico per confermare la diagnosi. Onchocerca volvulus Oncocercosi (nota come cecità fluviale) è causata dal parassita filaria Onchocerca volvulus. Questo è trasmesso dalle mosche nere 52. Provoca una dermatite pruriginosa, noduli sottocutanei, cheratite e corioretinite. La diagnosi di laboratorio può essere effettuata mediante rilevazione microscopica delle microfilarie nel sangue e nei tagli cutanei, con il rilevamento indiretto delle microfilarie con il test cutaneo con dietilcarbamazina, il rilevamento di anticorpi contro antigeni oncocercali, o il rilevamento con PCR del DNA di O. volvulus in frammenti cutanei 58. Vermi adulti possono essere riscontrati nei campioni bioptici delle formazioni nodulari (consultare Appendice 13). Mansonella streptocera Questa specie particolare è trasmessa dai moscerini e da alcune specie di mosche nere 52. Altre specie sono di solito riscontrate nel sangue. Mansonella streptocerca è di solito diagnosticata mediante il riscontro di microfilarie nei tagli cutanei. Dirofilaria immitis 53 Nell uomo sviluppano noduli a sede polmonare o ascessi sottocutanei. Le filarie migranti muoiono e causano vasculite localizzata che provoca infarti polmonari. Le altre specie causano la formazione di masse sottocutanee. La diagnosi di laboratorio si avvale degli esami bioptici. Trematodi (Distomidi) 59 Di solito la diagnosi di laboratorio è ottenuta mediante l identificazione microscopica delle uova emesse con le feci, le eccezioni sono di seguito elencate. Possono essere richiesti campioni di sangue soprattutto quando la presenza del parassita è scarsa nelle feci e nelle urine e può Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 19 di 60

20 determinare un esito negativo. Una preparazione con sospensione del campione in soluzione fisiologica seguita da una concentrazione con formolo/acetato di etile consente la dimostrazione microscopica delle uova. Distomi ematici Schistosoma Questa può essere causata da cinque specie di Schistosoma: Schistosoma haematobium, Schistosoma intercalatum, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, e Schistosoma mekongi. Questi causano la schistosomiasi 60. Le forme adulte sono presenti nei vasi portali e mesenterici, (tranne S. haematobium che è presente nel plesso venoso vescicale. Le sindromi patologiche principali includono eruzione cutanea papulare o orticaria, febbre di Katayama e sequele croniche di tipo fibrotico-ostruttive. Queste sindromi sono conseguenti e correlate a tre differenti stadi dello sviluppo nell ospite dei parassiti: cercarie, vermi maturi ed uova. La penetrazione delle cercarie determina l insorgenza di papule pruriginose, a cui segue un quadro dermatologico definito dermatite da schistosoma o prurito del nuotatore. I vermi adulti giunti a maturazione iniziano a depositare le uova e si sviluppa la febbre di Katayama o la schistosomiasi acuta. Alcune uova rimangono nell organismo dell ospite. Queste possono indurre la formazione di granulomi e danneggiamento dei tessuti che possono ostruire il flusso ematico portale verso il fegato ed il flusso circolatorio verso i polmoni, o quello urinario verso gli ureteri e la vescica. L infezione da S. haematobium solitamente esordisce con ematuria 47. L infezione cronica da S. haematobium può evolvere in cancro della vescica 54. La diagnosi di laboratorio è ottenuta con il rilievo delle uova nelle feci (urine, o liquido seminale per S. haematobium) 61. Possono inoltre essere esaminati frustoli rettali o biopsie. Sono disponibili prove sierologiche quando le uova non possono essere rilevate nei campioni clinici. La PCR è considerata molto preziosa per la diagnosi in fase iniziale di schistosomiasi 62. Distomi epatici Opistorchis sinensis (noto in precedenza come Clonorchis sinensis) Conosciuto anche come distoma cinese del fegato. La clonorchiasi è un'infezione causata da Opisthorchis sinensis. Questi possono causare ostruzione localizzata dei dotti biliari e ispessimento delle pareti in corso di infezioni gravi, nonché colangite e colangioepatite 60. Il metodo diagnostico standard è rappresentato dall'esame microscopico delle feci/aspirato duodenale che consente il riscontro delle uova. I metodi alternativi includono l ELISA, diventato il metodo più importante. La presenza del DNA da uova nelle feci può essere ottenuta utilizzando saggi PCR e LAMP, che sono particolarmente sensibili e specifici. Anche la diagnostica per immagini può essere utile e ora è ampiamente utilizzata 63. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 20 di 60

21 Opisthorchis viverrini e Opistorchis felineus Conosciuto anche come distoma cinese del fegato epatico del Sud-Est asiatico, Questi distomi epatici causano generalmente infezione. L opistorchiasi è acquisita dall uomo tramite ingestione di pesce infetto crudo o poco cotto contenente metacercarie di O. viverrini. I sintomi sviluppati includono dolore addominale, diarrea o costipazione. I sintomi, ad andamento cronico, comprendono ostruzione delle vie biliari, infiammazione e fibrosi delle vie biliari, ascessi epatici, pancreatite, e colangite suppurativa. In rari casi, causano colangiocarcinoma epatico 59. La diagnosi è come la precedente per Opisthorchis sinensis. Fasciola hepatica L infestazione sviluppa due distinte fasi cliniche, corrispondenti alla fase migratoria epatica del ciclo vitale e quella di insediamento del verme nella sede finale, il dotto biliare 80. La fase iniziale può esordire con dolore nel quadrante addominale superiore. Poi si può manifestare ostruzione biliare, Possono essere dimostrate uova nelle feci o nella bile. Sono anche disponibili prove sierologiche. Distosomi intestinali Questi includono Fasciolopsis buski, Heterophyes heterophyes, Nanophyetus salmincola, Metagonimus yokogawai e specie Echinostoma 53,60. La maggior parte delle infezioni da F. buski sono asintomatiche. Infezioni massive possono causare diarrea, dolore addominale e malassorbimento. H. heterophyes causa dolore addominale e diarrea. L infezione da specie Echinostoma è rara, ma è stata ben documentata. N. salmincola causa diarrea, dolore addominale, gonfiore ed eosinofila. Uova e parassiti possono essere dimostrati nelle feci. Distomi polmonari Specie Paragonimus Sono note circa 50 specie e sottospecie di Paragonimus, di cui oltre 13 sono in grado di infettare l uomo, causando la condizione patologica nota come, "paragonimiasi". Il più frequente è il Paragonimus westermani, noto anche come 'distosoma orientale del polmone'. L uomo è infettato quando si nutre di frutti di mare crudi o poco cotti come granchi di acqua dolce o gamberi che contengono i parassiti. I distosomi polmonari si incapsulano nel parenchima, di solito in prossimità dei bronchioli 60. Le uova sono depositate e penetrano nei bronchioli dai quali sono espettorate. Possono essere ricercate nell'espettorato o, se sono ingerite, nelle feci. I pazienti sviluppano eosinofila e possono manifestare difficoltà respiratoria, espettorare escreato brunastro e presentare emoftoe intermittente. La parassitosi evolve in bronchite cronica o in bronchiectasie con espettorazione profusa e dolore pleurico toracico. La diagnosi di laboratorio si avvale della dimostrazione microscopica di uova nell escreato o nelle feci. Altri test alternativi includono EIA e test sierologici, che sono risultati utili per la diagnosi precoce delle infezioni 64. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 21 di 60

22 Cestodi (Tenie) Generalmente la diagnosi di laboratorio dell'infestazione da cestodi è ottenuta con l identificazione microscopica delle uova emesse con le feci. Saranno specificate le eccezioni. La preparazione del campione in soluzione fisiologica, seguita dalla concentrazione con formolo-etere consente il loro rilievo microscopico. Ha pure valore diagnostico il riscontro macroscopico delle proglottidi nel campione (consultare le Appendici 5 e 7). Nell uomo, le infestazioni da cestodi si presentano con una o due modalità: tenie mature nel tratto gastro intestinale, o infestazione di una o più cisti larvali (definite idatidosi, cistocercosi, cenuriosi e sparganosi) insediate nel fegato, polmone, muscolo, cervello, occhio o in altri tessuti. Diphyllobothrium latum Noto anche come tenia del pesce, è riscontrato nelle acque fredde, limpide della Scandinavia, nel nord Europa, Giappone del nord, Canada, Alaska e Nord America. Nell uomo causa un'infezione parassitaria chiamata 'diflillobotriasi', acquisita ingerendo pesce crudo infettato dal parassita Le infestazioni sono di solito asintomatiche, il parassita può comunque raggiungere grandi dimensioni e causare ostruzione meccanica dell intestino con conseguente diarrea e dolore addominale. Infezioni prolungate e massive possono indurre carenza di vitamina B12. In alcuni casi si può manifestare sintomatologia neurologica 65. Hymenolepis nana E la tenia di più piccole dimensioni che infetta l uomo. E' nota anche come la tenia' nana 'a causa della sue dimensioni particolarmente piccole. E' l'infezione da tenia più comune degli esseri umani in tutto il mondo 65. Può causare una moderata dolenzia addominale, disagio, irritabilità, anoressia e diarrea.. Sebbene l uomo possa acquisire accidentalmente l infezione con l ingestione di coleotteri infetti (spesso presenti nei cereali disidratati) l infezione diretta è la forma più frequente e di solito si riscontra nelle comunità famigliari ed istituzionali con condizioni di scarsa igiene. Hymenolepsis diminuta, è principalmente un parassita dei topi ed occasionalmente dell uomo che si infetta con l ingestione dei coleotteri presenti nei cereali. Dipylidium caninum è di solito riscontrato nei cani e nei gatti. I bambini si infettano principalmente dopo contatto diretto con gli animali e le loro pulci. La diagnosi può essere ottenuta mediante il recupero e l'identificazione delle caratteristiche uova in un concentrato di feci con formolo-etere. Raramente nei campioni fecali si riscontrano vermi adulti e proglottidi. Taenia saginata Conosciuta anche come la tenia del manzo. È la più frequente nei paesi in via di sviluppo dove l'igiene è molto scarsa. Gli esseri umani si infettano dopo ingestione di carne cruda o poco cotta. Provoca dolenzia addominale, disagio, e i pazienti possono emettere proglottidi migrate in sede anale 65 Taenia solium Nota anche come tenia del maiale.le forme adulte provocano scarsa sintomatologia, ma le cisti larvali causano infiammazione locale 65. La loro migrazione nel sistema nervoso centrale causa crisi convulsive, idrocefalo e aracnoidite. La cistocercosi è un infezione dei tessuti causata da cisticerchi di T. solium che può svilupparsi nell uomo da un auotoinfezione da verme adulto. Il coinvolgimento del sistema nervoso centrale è definito neurocisticercosi 65. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 22 di 60

23 La diagnosi può essere ottenuta con l esame microscopico delle feci, sierologia, metodi immunodiagnostici o bioptici 66. Taenia multiceps, Taenia serialis e Taenia brauni Taenia multiceps e Taenia serialis sono più comunemente riscontrate in Europa e negli Stati Uniti, mentre Taenia brauni lo è in Africa. Queste specie causano una infezione cistica chiamata coenurosi, che di solito si sviluppano in tenie nei cani 65. La malattia sintomatica nell uomo interessa occhio, sistema nervoso centrale, tessuto sottocutaneo e muscolare. La diagnosi di laboratorio si avvale dell esame microscopico di appropriati materiali in cui si possono riscontrare i protoscolici (simili a quelli di T. solium). Spirometra mansonoides La Sparganosi è un infezione dei tessuti causata dalla Spirometra mansonoides. Si tratta di un infezione tissutale da cisti pleiocercoidi causata da numerose specie di cestodi e i sintomi includono infiammazione locale della cute nella sede d ingresso 65. Il danno dei tessuti può essere grave, particolarmente nell occhio, ed alcune forme del parassita diffondono in altre sedi corporee. La diagnosi di laboratorio si avvale esclusivamente di tecniche istologiche. Echinococcus granulosus, Echinococcus vogeli and Echinococcus multilocularis Queste tenie causano la malattia parassitaria chiamata Echinococcosi che si manifesta con due diverse modalità: echinococcosi cistica causata da Echinococcus granulosus o Echinococcus vogeli, e malattia alveolare causata da Echinococcus multilocularis 65. Le uova si schiudono per sviluppare oncosfere che penetrano nella mucosa intestinale ed entrano in circolazione. Queste si incistano nei visceri dell ospite e sviluppano le forme larvali cistiche mature. La sintomatologia è conseguente ai loro effetti di tipo meccanico ed all ingrandimento in spazi ristretti. La diagnosi di laboratorio si avvale di: 1. Radiografie e sierodiagnosi sono il fondamento della diagnosi. I test sierologici comprendono quelli immunoenzimatici (ELISA), test di emoagglutinazione indiretta e fissazione del complemento 2. Nel caso di cisti da echinococco, l esame microscopico del fluido delle cisti di pone in evidenza caratteristici i protoscolici che possono essere o non essere invaginati. Il fluido delle cisti può anche rivelare uncini liberi Nota: L aspirazione a fini diagnostici dovrebbe essere intrapresa solo in un'unità specializzata con esperienza nella gestione delle immagini di tali parassiti. 3. Esame istologico della parete cistica dopo la rimozione chirurgica Occasionalmente le cisti polmonari contenenti E. granulosus possono rompersi e i protoscolici intatti e gli uncini possono essere espulsi con l espettorato e riscontrati nei preparati microscopici. Sono inoltre disponibili test sierologici. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 23 di 60

24 Informazione Tecnica/Limitazioni Limitazioni delle SMI del RU Ricerca di parassiti in campioni diversi dal sangue Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo Contenitori per Campioni 67,68 Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE per descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve c onsentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a questi scopi''. Test Diagnostici Rapidi Sono disponibili numerosi metodi di identificazione rapida con diversa sensibilità e specificità. Queste tecniche possono avere potenziali vantaggi/svantaggi e devono pertanto essere valutate e validate prima dell'uso. I metodi molecolari (ad esempio PCR multiple) e i saggi immunoenzimatico (EIA) possono funzionare meglio rispetto ai metodi tradizionali, e devono pertanto essere presi in considerazione per l'uso, se disponibili, previa validazione per garantire un adeguata interpretazione clinica 30,69. Confezioni commerciali La qualità dei reagenti dei test disponibili in commercio può essere variabile o deteriorarsi a causa delle condizioni di conservazione; per questo motivo sono necessari i controlli preparati in laboratorio, così come quelli esterni, per determinare se la confezione è idonea. I laboratori devono utilizzare le confezioni per le analisi secondo le istruzioni del produttore. Metodi di concentrazione Dovrebbero essere esaminati campioni fecali di recente emissione, privi di formalina, in quanto non è richiesta di routine la loro concentrazione prima della colorazione. Qualora la si ritenga necessaria, dovrebbero essere utilizzati metodi modificati per ridurre al minimo le perdite di oocisti e prevenire interferenze con la loro l'adesione al vetrino e con la colorazione. Test per Toxoplasma Per i test sierologici del Toxoplasma sono disponibili in commercio numerose confezioni. Tuttavia, la loro sensibilità e specificità possono variare ampiamente da una fonte commerciale all altra. Ciò è preoccupante, perché i risultati sierologici possono influenzare le decisioni sulla continuazione o l interruzione delle gravidanze. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 24 di 60

25 Test Immunoenzimatici (EIA) I campioni (feci) per essere analizzati utilizzando EIA o altri test rapidi non devono essere concentrati prima della loro analisi, perché gli antigeni (come quelli specifici per la diagnosi di Giardia intestinalis e specie Cryptosporidium) vengono persi durante la procedura. La maggior parte degli EIA richiede l'uso di campioni di feci recenti o congelati 28. Tuttavia, sono ora disponibili in commercio alcuni kit che utilizzano per il rilevamento di antigeni campioni fecali conservati; gli utenti dovrebbero controllare le istruzioni del produttore. Conservazione dei campioni Quando le feci non possono essere esaminate entro l'intervallo di tempo prescritto è necessaria la conservazione in formalina 10%. Questi campioni possono essere conservati per alcuni mesi. Tuttavia va notato che ha degli svantaggi che comprendono: interferenza con PCR, soprattutto dopo prolungato tempo di fissazione, inadeguata conservazione della morfologia dei trofozoiti dei protozoi, nonché la non idoneità per la colorazione tricromica di determinati strisci 70. Problemi d identificazione Nelle feci si possono riscontrare numerosi artefatti microscopici che possono essere confusi con trofozoiti, (oo)cisti o uova. Per maggiori informazioni consultare Appendice 4 Problemi di microscopia La diagnosi di infezione da E. histolitica si è sempre avvalsa dell'esame microscopico su campioni di feci fresche o fissate, tuttavia, questa ha dei limiti che comprendono una sensibilità subottimale, di circa il 60%, e in secondo luogo, non è in grado di differenziare le potenziali E. histolytica patogene da quelle morfologicamente identiche ma non patogene, quali E. dispar, E. moshkovskii, e altre cisti quadrinucleate di Entamoeba 3,4. Altri svantaggi della microscopia includono generalmente l impegno gravoso quando si devono esaminare numerosi campioni e la mancanza di esperienza microscopica del personale di laboratorio. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 25 di 60

26 1 Considerazioni sulla sicurezza 67,68, Considerazioni sulla sicurezza 67,68,71-74 Usare tecnica asettica Raccogliere in appropriati contenitori con marcatura CE a tenuta ermetica i campioni e trasportarli in sacchetti di plastica sigillati, tranne i vetrini con nastro adesivo/tamponi rettali per uova di E. vermicularis che devono essere trasportati in sacchetti di plastica sigillati 1. In caso di LCR ogni piastra seminata deve essere trasportata in un robusto contenitore impermeabile con marchiatura CE. E essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti. 1.2 Procedura sul Campione 67,68,71-85 Tutti i tipi di campione Livello di Contenimento 2, se non altrimenti specificato (consultare di seguito). Le procedure di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza 77. Per tutte le ricerche parassitologiche devono essere calzati guanti monouso Fare riferimento alle attuali linee guida per la manipolazione sicura di tutti i microrganismi documentati in questa SMI. Feci E richiesto un livello di Contenimento 3 per le ricerche su specie Echinococcus e Taenia solium ma è indispensabile una cabina microbiologica di sicurezza di Classe 1). Le proglottidi di tenia non trattate con conservanti inviate al laboratorio per l identificazione sono pericolose per la possibilità di infezione accidentale e di cistocercosi 86. Si deve prestare attenzione anche con i campioni fecali che sono stati fissati in conservanti in quanto potrebbero essere potenzialmente infettivi. La fissazione con formalina può richiedere giorni o settimane per uccidere alcune cisti parassitarie o oocisti, quali, ad esempio, le uova di Ascaris lumbricoides, che possono continuare a svilupparsi ed essere infettive anche se conservate in formalina. I campioni per la microscopia devono essere preparati con formalina 10% (v/v) in acqua (non idonea per la ricerca di trofozoiti). Per ragioni di sicurezza deve essere usato etil acetato e non dietil etere per approntare le concentrazioni della soluzione formolo-etere 42. Le procedure devono essere eseguite in un area ben ventilata in assenza di sorgenti di fiamma non protetta. LCR Contenimento di Livello 3 ed è richiesta una cabina di sicurezza per l'indagine per Naegleria fowleri. Tessuti, biopsie, cisti idatidea e pus da ascessi Processare i campioni prelevati dal polmone e dalla cavità pleurica, e le cisti idatidee, in cabina di Classe 1 con scarico protetto in ambiente con Livello di Contenimento 3. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 26 di 60

27 Espettorato/lavaggio broncoalveolare Tutti i campioni devono essere processati in cabina di Classe 1 con scarico protetto in ambiente con Livello di Contenimento 3. Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con le valutazioni del rischio. 2 Prelievo del Campione 2.1 Tipi di Campione Feci, urine, vetrino con nastro adesivo/tampone perianale, LCR, bile, pus da ascessi, aspirati duodenali/digiunali, tessuti, cisti idatidea, espettorato/lavaggio broncoalveolare biopsie da coloscopia o chirurgia 2.2 Tempo Ottimale e Metodo di Prelievo 87 Per considerazioni sulla Sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1 Raccogliere il campione prima dell inizio della terapia antibiotica, se possible 87. Feci Dovrebbero essere raccolte prima della terapia antibiotica o antidiarroica, quando possibile e tra le 22:00 e la mezzanotte, o al mattino presto, prima di defecazione o il bagno. Nastro adesivo per vetrino/tampone perianale per uova di E. vermicularis 1 I campioni di feci fresche sono essenziali per la ricerca di trofozoiti Le feci possono essere inserite direttamente in un contenitore impermeabile sterile a bocca larga con marchiatura CE o possono essere trasferite da una padella asciutta e pulita o contenitore simile e poi trasferite in un contenitore impermeabile con marchiatura CE. Trasportare immediatamente i campioni appena ottenuti, senza conservanti. Le cisti non si formano una volta che il campione è stato emesso. I trofozoiti protozoari non sopravvivono se il campione si essicca. La formalina al 10% uccide i trofozoiti e li rende immobili. Se si ricercano i trofozoiti le feci liquide dovranno essere esaminate idealmente entro 30 minuti dal momento della raccolta senza l aggiunta di formalina, (di solito con una goccia di fisiologica). Se non possono essere evitati ritardi, i campioni devono essere conservati per evitare la disintegrazione dei trofozoiti. Le feci soffici (che possono contenere sia trofozoiti che cisti) dovrebbero preferibilmente essere esaminate entro 1 ora dall emissione 88. I campioni di feci formate (con meno probabilità di contenere trofozoiti) possono essere conservati prima dell accertamento per un giorno, con refrigerazione notturna, se necessaria 89. Microscopia per uova di E. vermicularis ova 1 Nastro adesivo Applicare il nastro adesivo alla regione perianale, premendo saldamente più volte il lato adesivo del nastro contro le pieghe perianali sinistra e destra; il nastro può essere avvolto attorno a un abbassalingua per facilitare il prelievo. Posizionare il nastro adesivo sul vetrino, parte adesiva verso il basso. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 27 di 60

28 Tampone perianale I campioni perianali sono i migliori se ottenuti al mattino prima di fare il bagno o la defecazione Prima di escludere l infezione da ossiuri raccogliere tre campioni in giorni consecutivi.. Per la raccolta deve essere usato un bastoncino di cotone inserito in un contenitore asciutto. Divaricare le natiche e strofinare il tampone di cotone inumidito su tutta l'area circostante l'ano, ma non inserirlo nell'orifizio. Riporre il tampone di cotone lana nel suo contenitore (non è necessario un terreno di trasporto).talvolta, può essere raccolto dal paziente un verme adulto poi inviato in acqua o soluzione fisiologica per l'identificazione. Urina (per S. haematobium) È preferibile ottenere tutte le urine emesse dalle 10 di mattino alle 2 del pomeriggio in quanto è stato dimostrato che la concentrazione massima di uova viene escreta in queste ore 90. in alternativa, può essere utile raccogliere la parte terminale dei campioni delle urine per 24. Utilizzare contenitori sterili senza acido borico. Nei pazienti con ematuria, le uova possono essere intrappolate nel sangue e muco nella parte terminale del campione di urina. Se l'urina non può essere esaminata entro un'ora dalla raccolta, si consiglia di aggiungere 1 ml di formalina non diluita per conservare tutte le uova eventualmente presenti. LCR I campioni devono essere prelevati da uno specialista, secondo i protocolli locali. Tessuti, biopsie, cisti idatidea e pus da ascessi, bile, aspirati da duodeno/digiuno I campioni devono essere prelevati da specialisti secondo i protocolli locali Espettorato/lavaggio broncoalveolare È richiesto espettorato dal tratto respiratorio inferiore ottenuto con colpi di tosse profonda. Quando la tosse è secca, prima di espettorazione possono essere utili fisioterapia, drenaggio posturale o l'inalazione di un aerosol 2.3 Quantità adeguata e numero appropriato di campioni 87 Feci Per una ricerca ottimale, raccogliere tre campioni di feci in non più di dieci giorni. Di solito si raccomanda che i campioni siano ottenuti a giorni alterni. Tranne i casi di pazienti affetti da diarrea grave o dissenteria, per i quali non dovrebbe essere analizzato più di un campione ogni 24 ore in quanto l emissione delle cisti e delle uova tende ad essere intermittente. Se si sospetta E. histolytica ed il primo dei tre campioni è negativo, prendere in considerazione l'invio a laboratori ove sono disponibili i test molecolari. Non sono previsti limiti definiti per il volume del campione richiesto, ma alcune procedure di laboratorio richiedono quantità superiori ad altre. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 28 di 60

29 Vetrino nastro adesivo/tampone perianale per uova di E. vermicularis 1 Si raccomanda il prelievo dei campioni per almeno quattro sei giorni consecutivi. Se i risultati di tutti questi campioni sono negativi il paziente può essere considerato non infestato. Nella pratica corrente, raramente si riceve più di un campione. Urine (pers. hametobium) In teoria, un volume minimo di 10mL. LCR In teoria, un volume minimo di 1 ml. Tessuti, biopsie, cisti idatidea e pus da ascessi Pus In teoria, si richiede tutto il pus ottenuto o un minimo di 1 ml. Tessuti/biopsie Quantità teorica richiesta di campione sufficiente per preparati microscopici e colture. Bile, Aspirati duodeno/digiunali In teoria, è richiesto un volume minimo di 1 ml. Espettorato/lavaggio broncoalveolare In teoria, è richiesto un volume minimo di 2 ml. 3 Trasporto,conservazione e mantenimento del campione 67, Condizioni ottimali di trasporto e conservazione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1 I campioni devono essere trasportati il più presto possibile 87. I campioni devono essere conservati secondo le linee guida del Royal College of Pathologists "Mantenimento e conservazione dei campioni patologici e loro documentazione 91. Feci Se non può essere effettuato un accertamento tempestivo delle feci, per evitare il deterioramento della morfologia dei protozoi, la schiusa delle larve del primo stadio degli anchilostomi e la crescita eccessiva dei lieviti è richiesto l uso, come conservante, di formalina al 10% in acqua 92. Nastro adesivo per vetrino/tampone perianale per uova di E. vermicularis 1 Refrigerazione o conservazione a temperatura ambiente (20-25 C) fino a 48 ore. Urine (per S. haematobium), bile, aspirati duodenali/digiunali ed espettorato/ lavaggio bronchiale Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura ambiente (20 25 C).. Tessuti, biopsie, cisti idatidea e pus da ascessi Se il campione di tessuto/biopsia è piccolo, inserirlo in acqua sterile per prevenirne l'essiccamento. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 29 di 60

30 Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla conservazione a temperatura ambiente (20 25 ). 4 Processo/procedura sul campione 67, Selezione della prova Feci Selezionare una quota rappresentativa del campione per le appropriate procedure quali la coltura per batteri patogeni (B 30 -Investigation of faecal specimens for enteric pathogens), prova per le tossine per Clostridium difficile (B 10 nvestigation of Faecal Specimens for Clostridium difficile) ed esami virologici, in funzione delle caratteristiche cliniche del paziente La concentrazione delle feci è eseguita su tutti i campioni quando è richiesta specificamente la ricerca dei parassiti, ove esistono specifiche indicazioni cliniche e quando ritenuto opportuno dal referente senior del laboratorio. Tutti i campioni fecali da soggetti sintomatici devono essere colorati per la ricerca di oocisti di Cryptosporidium 93. Colorare per microsporidi i campioni di pazienti sintomatici, HIV positivi ed immunodepressi. Nella scelta del test dovrebbero essere determinati il periodo d incubazione e il ciclo vitale delle singole infezioni parassitarie Per tutti gli altri campioni N/D 4.2 Aspetto N/D 4.3 Preparazione del Campione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla sezione 1.2. Seguire le istruzioni del produttore se si utilizzano confezioni commerciali Pre-trattamento N/D Procedura sul campione Prelevare campioni da aree fecali contenenti sangue, pus o muco per l esame diretto con preparato in sospensione o per colorazione. Quando si campionano feci formate, prelevare il materiale da sedi diverse per concentrarli, per sospenderli in liquidi e per la colorazione. Feci per la ricerca di protozoi Standard Se il campione è fresco, esaminare per trofozoiti mobili nel modo seguente Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 30 di 60

31 1. Porre una goccia di soluzione fisiologica 0.85% sulla parte sinistra di un vetrino da microscopio pulito e sulla parte destra una goccia di colorante Lugol iodato a doppia concentrazione (la distanza fra le gocce deve essere tale da consentire di posizionare i coprioggetti su ciascuna di loro). 2. Per prelevare le feci usare un bastoncino con tampone diverso per ogni preparato, prendere una piccola quantità di feci non fissate ed emulsionarle vigorosamente nella soluzione fisiologica e nel colorante di Lugol iodato. 3. Ricoprire con coprioggetto ciascun preparato del vetrino. Esaminare entrambe le aree con obiettivo a basso ingrandimento. Utilizzare l ingrandimento medio per identificare qualsiasi immagine sospetta. 4. Se opportuno, preparare strisci su vetrini da microscopio puliti per le colorazioni con auramina-fenolo e/o Giemsa (consultare TP 39 - Staining procedures). 5. Inoltre concentrare il campione usando formolo-etere* secondo la tecnica di seguito descritta. Feci per esame di Cryptosporidium Preparare uno striscio con materiale fecale di spessore sottile o medio su un vetrino da microscopio pulito e asciugare all aria. Nota: Se il campione è secco o solido può essere aggiunta formalina al 10%. 2.,Fissare con metanolo per due-tre minuti. 3. Gli strisci possono essere colorati con auramina fenolo o con la colorazione di Ziehl- Neelsen modificata (consultare TP 39 - Staining Procedures). Concentrazione formolo-etere* modificata 95,96 *Usare etil acetato (non dietil etere) in un area ben ventilata in assenza di sorgenti con fiamma non protetta Il metodo seguente è raccomandato per concentrare le feci. Sono disponibili numerose confezioni commerciali per la concentrazione delle feci che si avvalgono del metodo di Ridley Allen di seguito descritto, che è quello di scelta utilizzato dalla maggior parte dei laboratori clinici. Sono frequentemente usate confezioni commerciali per la concentrazione. 1. Prelevare un campione fecale delle dimensioni di un grosso pisello (circa 1g) con bastoncino con tampone ed emulsionare in 7 ml di formalina 10% (1 volume di formaldeide al 40% diluita in 9 volumi di acqua distillata) in un normale contenitore pulito. 2. Setacciare l intero contenuto con colino normale (colino di nailon da te o garza quadrata) e raccogliere in un recipiente idoneo. I setacci sono sciacquati abbondantemente in acqua pulita e riutilizzati. Setacciare la miscela di feci e di formalina prima della centrifugazione per eliminare i grandi pezzi di materie fecale dalla sospensione 3. Trasferire il filtrato in una provetta di vetro o di polipropilene dotata di chiusura (resistente all etere) idonea alla centrifugazione. 4. Aggiungere 3 ml di etil acetato e una piccola goccia di 0.1%Triton X 100 (contribuisce ad emulsionare il campione fecale) e passare su vortex per 15 secondi, o agitare vigorosamente per 15 secondi. 5. Centrifugare il campione a 1200 x g per 3 minuti. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 31 di 60

32 6. Allontanare lo strato lipidico con un bastoncino con tampone passandolo attorno all intera circonferenza della provetta, rimuovendo i residui lipidici dalla stessa. 7. Scartare il contenuto della provetta, lasciando che poche gocce si raccolgano sul fondo per ricoprire il sedimento rimasto. 8. Sospendere di nuovo il sedimento nel liquido rimasto. Trasferire una goccia di questo su un vetrino da microscopio pulito e applicare su di essa un coprioggetto. 9. Ad un preparato separato si può aggiungere colorante contenete iodio a doppia concentrazione per migliorare e facilitare il confronto delle caratteristiche morfologiche. 10. Ricercare con obiettivo a basso ingrandimento sull intera area del preparato; usare medio ingrandimento per rilevare le caratteristiche morfologiche. Le confezioni commerciali disponibili per la concentrazione contengono setacci con pori di varie dimensioni che influenzano la resa delle componenti parassitarie e la quantità di detriti presenti Una dimensione più grande dei pori può consentire in una resa maggiore delle componenti parassitarie, tuttavia l'incremento di detriti porta ad un deposito denso che rende più difficile l osservazione sul vetrino e le ova e le cisti possono essere quindi mascherate. Se la dimensione dei pori è troppo piccola, pur avendo un vetrino più pulito e più facile da esaminare, la resa delle componenti parassitarie sarà ridotta. Le confezioni per la concentrazione fecale disponibili in commercio devono essere validate prima dell'uso e devono essere seguite le istruzioni del produttore. Per ottimizzare il recupero dei parassiti è importante setacciare la miscela fecale formolata, utilizzare un solvente, quale l acetato di etile con triton X e centrifugare per il tempo appropriato con forza di centrifugazione idonea 98. Il recupero dei diversi stadi del parassita può essere notevolmente ridotto se non è usato un solvente come estrattore di grassi e detriti (ad esempio acetato di etile) 100. Uno studio recente suggerisce e raccomanda che x g per 3 minuti può essere una soluzione ottimale per il rilievo del parassita 100,101. Vetrino con nastro adesivo 1. Prima di esaminare il vetrino, può essere opportuno sollevare il nastro ed inserire una goccia di olio per immersione o di glicerolo/alcool al suo centro, per poi riposizionarlo. Questo accorgimento migliora la trasparenza del nastro stesso. 2. Esaminare il vetrino con obiettivo a basso ingrandimento. Tampone perianale 1. Aggiungere al contenitore sufficiente soluzione fisiologica per ricoprire il tampone e riposizionare il tappo. 2. Agitare vigorosamente. 3. Estrarre il tampone dalla soluzione fisiologica, spremerlo contro la parete del contenitore per allontanare la parte liquida. Scartare il tampone. 4. Concentrare il liquido restante con centrifugazione a 800 x g per 2 minuti. 5. Rimuovere il sopranatante con una pipetta monouso, senza agitare il sedimento. 6. Agitare la provetta per sospendere di nuovo il sedimento. 7. Usando una pipetta monouso, trasferire una goccia del sedimento su un vetrino da microscopio, applicare un coprioggetto ed esaminare l intero preparato con obiettivo a basso ingrandimento. Urine (per S. haematobium) Campioni della parte terminale delle minzioni di 24 ore 94 Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 32 di 60

33 Per volumi consistenti di urine (>25 ml) 1. Lasciare sedimentare il campione per 1 ora. 2. Decantare e scartare il sopranatante trasferendo poi il sedimento con le urine residue (circa 1 ml) in un contenitore a fondo conico per la centrifugazione. 3. Centrifugare a 500 x g per 2 minuti 4. Decantare e scartare il sopranatante miscelando poi il sedimento con una pipetta. 5. Usando l interro sedimento, trasferire 1 o 2 gocce su alcuni vetrini da microscopio e posizionare i coprioggetti. Esaminare l intero preparato di ciascun vetrino con obiettivo a basso ingrandimento. Altri campioni di urine Se il campione è già stato raccolto in un contenitore a fondo conico, procedere come specificato precedentemente dal numero 3, altrimenti, trasferire l intero materiale in un contenitore a fondo conico e procedere come specificato in precedenza. Metodo di filtrazione (raccomandato per campioni di urine privi di cellule e di cristalli) 1. Inserire 10 ml urine in una siringa, connettere poi ad un filtro Swinnex (porosità 12 µm). 2. Filtrare delicatamente le urine. 3. Inserire 20 ml di aria facilitando il transito attraverso il filtro. 4. Rimuovere la parte superiore del filtro e trasferire la membrane su un vetrino da microscopio. 5. Aggiungere una goccia di soluzione fisiologica, applicare il coprioggetto e leggere al microscopio usando un obiettivo a basso ingrandimento. LCR Dopo il ricevimento, eseguire l esame microscopico diretto il più presto possibile (con obiettivo a basso o medio ingrandimento). 2. Centrifugare il LCR 100 x g per 10minuti. 3. Trasferire il sopranatante con un a pipetta sterile, lasciandone circa 0,5mL; è richiesto un altro contenitore sterile per le prove addizionali (concentrazione proteica, prove virologiche ecc.). 4. Sospendere di nuovo il centrifugato nel restante liquido e trasferire 2 gocce al centro di una piastra di agar purificato ricoperta di batteri. 5) Quando il liquido si è assorbito incubare la piastra come descritto per il raschiamento corneale (fare riferimento a B 2 - Investigation of bacterial eye infections). NNota: L incubazione a 35 C 37 C fornisce risultati migliori per le specie Naegleria. 1 Trasferire una goccia del sedimento del centrifugato su un vetrino da microscopio pulito ed applicare su questa il coprioggetto. Osservare l intera area con obiettivo a basso ingrandimento ed a medio ingrandimento per rilevare le caratteristiche morfologiche Nota: L incubazione a 35 C 37 C fornisce risultati migliori per le specie Naegleria. Cisti idatidea e pus da ascessi Pus e contenuti di cisti idatidea (inclusa la sabbia idatidea).approntare preparati in sospensione ed asciugare all aria gli strisci per la colorazione (se richiesta) (consultare B 39 - Staining Procedures). Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 33 di 60

34 Tessuti e biopsie Oltre alle preparazioni istologiche standard eseguire strisci per apposizione, preparazioni con lieve strofinamento e per schiacciamento. 2. Inserire il campione in una piastra di Petri sterile per l esame macroscopico e selezionarne una parte per l esame microscopico. 3. Selezionare un area di aspetto diverso dal normale. Ad esempio, una parte grigia indurita o granulomatosa del polmone o un area ulcerata del tessuto intestinale. Strisci per apposizione 1. Se il campione e di dimensione sufficiente, tagliarlo ed appoggiare sul vetrino la superficie di taglio. 2. Premere di nuovo il tessuto sul vetrino da microscopio pulito, alzare e premere di nuovo. 3. Riportare il campione sul vetrino e premere di nuovo la superficie di taglio per ottenere due altre apposizioni. Ciò consente 3 deposizioni allineate in successione su 1 vetrino da microscopio. 4. Se sono disponibili alcuni campioni di tessuto, effettuare una striscia per apposizione di ciascuno di loro. 5. Lasciare asciugare all aria e fissare per 1 minuto in metanolo prima di colorare con Giemsa (consultare TP 39 - Staining Procedures). Preparazioni con schiacciamento Preparazione per schiacciamento per parassiti tissutali come Trichinella 1. Suddividere le quote di tessuti in minuti frammenti in una scatola di Petri, trasferendone uno su un vetrino da microscopio pulito. 2. Aggiungere una goccia di soluzione fisiologica sterile o di acqua distillata sterile. 3. Ricoprire con un secondo vetrino da microscopio pulito e pressare entrambi con forza. 4. Esaminare al microscopio con obiettivo a basso ingrandimento. Nota: Si deve prestare attenzione quando vengono eseguiti preparati da schiacciamento, in quanto possono rilasciare numerosissime uova che aumentano il rischio per l'operatore. Bile, aspirati duodenali/digiunali Standard 1. Centrifugare il campione a 800 x g per 2 minuti. 2. Decantare il sopranatante in disinfettante. 3. Sospendere di nuovo il sedimento del centrifugato nelle gocce restanti di sopranatante. 4. Usare il sedimento sospeso di nuovo per preparare strisci da colorare. 5. Colorare con Ziehl-Neelsen e auramina-fenolo per Cryptosporidium, Giemsa per Cyclospora cayetanesis e I. belli (consultare TP 39 - Staining Procedures), e iodio o semplici preparati in sospensione per S. stercoralis e G. lamblia. Prove supplementari Per la ricerca di microsporidi: Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 34 di 60

35 1 Centrifugare il campione a 800 x g per 2 minuti 2. Decantare il sopranatante in disinfettante 3. Sospendere di nuovo il deposito del centrifugato nelle restanti gocce di sopranatante 4. Usare il materiale risospeso per preparare uno striscio da colorare 5. Colorare con tricromica modificata (consultare TP 39 - Staining Procedures). Espettorato Per il campionamento selezionare aree viscose con colorazione ematica. 2. Trasferire 1 ml di espettorato in una provetta da centrifuga. 3. Aggiungere 1 ml di ditiotreitolo e scuotere delicatamente per circa 10 secondi. Lasciare riposare a temperature ambiente per 15 minuti. 4. Centrifugare a 1500 x g per 2 minuti. 5. Decantare il sopranatante in un raccoglitore di materiali di scarto 6. Sospendere di nuovo il sedimento nelle poche gocce di sopranatante rimaste. 7. Trasferire una goccia su un vetrino da microscopio pulito ed applicare un coprioggetto. Esaminare tutto il preparato con obiettivo a basso ingrandimento. Espettorato indotto / BAL (per P. jirovecii) Sono disponibili diversi metodi di colorazione e di identificazione per P. jirovecii. Possono essere usate colorazioni di tipo istologico, anche se i metodi d immunofluorescenza con anticorpi monoclonali sono utilizzati in numerosi laboratori microbiologici. Se si utilizzano confezioni commerciali seguire le indicazioni del produttore. Per ulteriori informazioni, cpnsultare B 57 Investigation of bronchoalveolar lavage, sputum and associated specimens. 4.4 Microscopia Consultare la Sezione per tutti i campioni 4.5 Coltura Consultare la Sezione per tutti i campioni 4.6 Identificazione Livello minimo Quando possibile, identificare i parassiti a livello di specie e loro stadio. 4.7 Prova di Sensibilità agli Antimicrobici N/D 4.8 Invio per Ricerche su Focolaio Epidemico Per informazioni riguardanti l invio per indagini su epidemie, contattare lo specifico laboratorio di riferimento.. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 35 di 60

36 4.9 Invio ai laboratori di riferimento Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms. Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati laboratori di riferimento. Contattare l appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove disponibili, tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per invio del campione: Inghilterra e Galles Scozia Irlanda del Nord 5 Procedura di Refertazione 5.1 Microscopia Refertare qualsiasi parassita osservato. Feci Includere il commento per tutti i parassiti osservati, anche di quelli che di solito non sono considerati patogeni. Tempo di refertazione microscopia Referto scritto ore, specificando, se opportuno, che sarà emesso un successivo referto. Risultati microscopici urgenti: comunicare per telefono quando disponibili. 5.2 Coltura LCR Refertare presenza o assenza di specie Acanthamoeba e/o di Naegleria fowleri. Tempo refertazione coltura LCR Referto scritto dopo 4 giorni, specificando, se appropriato, che sarà emesso un referto successivo Risultato clinicamente urgente; telefonare quando disponibile. 5.3 Test di sensibilità agli antimicrobici N/D Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 36 di 60

37 6 Notifica alla PHE 103,104 o Equivalente Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva, Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni. Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione. La denuncia secondo la Direttiva dell Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d infezione. Queste iniziative devono continuare. Nota: La linea guida dell Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt Jakob disease CJD da includere nel Notification Duties of Registered Medical Practitioners, e non al Notification Duties of Diagnostic Laboratories. Altre disposizioni sono vigenti in Scotland 105,106, Wales 107 e Northern Ireland 108. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 37 di 60

38 Appendice 1:Tipologia dei campioni e possibili parassiti identificabili Tipi di campione Bile LCR Aspirati duodenali e del digiuno Feci Aspirati epatici e spenici Cisti idatidea Pus Vetrino con nastro adesivo Escreato / BAL Tamponi Tessuti e biopsie Urine Possibile parassita presente Fasciola hepatica, Opisthorchis sinensis, specie Cryptosporidium Specie Acanthamoeba, Angiostrongylus cantonensis, Balamuthia mandrillaris, Microsporidia - Encephalitozoon cuniculi, Naegleria fowleri, qualsiasi nematode che produce VLM (Visceral Larva Migrans), cestodi, Taenia solium, specie Echinococcus Specie Cryptosporidium, Cyclospora cayetanesis, Giardia duodenalis Microsporidia - Enterocytozoon bieneusi, specie Strongyloides Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, adulti Acaris sp. vermi e uova, Balantidium coli, Blastocystis hominis, Paracapillaria philippinensis, Chilomastix mesnili, Cryptosporidium species, Cyclospora cayetanesis, Dientamoeba fragilis, Diphyllobothrium latum, specie Echinostoma, Endolimax nana, Entamoeba histolytica, altre specie Entamoeba, Enteromonas hominis, Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Giardia duodenalis, Heterophyes heterophyes, Hymenolepis nana, Iodamoeba butschlii, Cystoisospora belli, Microsporidia [Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon (Septata) intestinalis], Metagonimus yokogawai, Nanophyetes salmincola, Necator americanus, Opisthorchis sinensis, specie Paragonimus, Retortomonas intestinalis, specie Sarcocystis, specie Schistosoma, Strongyloides stercoralis, Taenia saginata vermi e uova, Taenia solium, Trichuris trichiura, specie Enterobius verme adulto e uova Entamoeba histolytica, specie Leishmania, Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica Enterobius vermicularis Ascaris lumbricoides, specie Cryptosporidium, Microsporidia, Paragonimus westermani, Strongyloides stercoralis, Pneumocystis jirovecii Trichomonas vaginalis tampone genitale Microsporidia tampone oculare Specie Acanthamoeba biopsia cerebrale, noduli e ulcere cutanee; Angiostrongylus costaricensis, specie Anisakis, specie Cryptosporidium intestine tenue e biopsia epatica; Vermi Filaria, Giardia duodenalis biopsia duodenale; Specie Leishmania biopsia linfonodi, cutanea ulcere; Specie Anncaliia, specie Nosema, Vittaforma corneae, Microsporidium africanum e Microsporidium ceylonensis Ulcera corneale Microsporidia [Pleistophora, Nosema, Trachipleistophora e specie Phocanema], specie Schistosoma, Taenia solium, Trichinella e altri nematodi tissutali biopsia muscolare Schistosoma haematobium, Microsporidia Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 38 di 60

39 Prove sierologiche Entamoeba histolytica, specie Acanthamoeba, Cysticercosis (Taenia solium), Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica, Filaria, specie Cryptosporidium, specie Leishmania, specie Schistosoma, Strongyloides stercoralis, specie Toxocara, Toxoplasma gondii, specie Trichinella, qualsiasi nematode che produce LVM (Larve Viscerali Migranti), Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 39 di 60

40 Appendice 2: Distribuzione geografica delle infezioni parassitarie Infezione / microrganismo infettante Amoebiasis/ Entamoeba histolytica Amebe a vita libera - Acanthamoeba, Naegleria sp. Flagellati: Giardiasis, Trichomoniasis Coccidi: Cryptosporidiosis/Cryptosporidium sp. Cyclosporiasis/Cyclospora sp., Microsporidi Cystosporiasis/Cystoisospora sp., Sarcocystosis/Sarcocystis sp., Toxoplasmosis/ Toxoplasma gondii, Pneumocystis jirovecii Infezioni da Nematodi (tratto-gi) Enterobius, Trichuris, Ascaris Anchilostomi Vermi uncinati: Ancylostoma duodenale Strongyloides sp. Specie Trichostrongylus Necator americanus Nematodi insoliti: Trichinellosi, Toxocariasi Gnathostomiasi (febbre e infiltrati pulmonari) Gnathostomiasi, Angiostrongylus sp. (myeloencephalitis) Capillariasi Dracunculiasi Onchocerciasi Trematodes (trematodi ematici): Schistosomiasi Trematodi ematici: Fascioliasis Opisthorchiasi Trematodi intestinali: Distribuzione geografica Ovunque Ovunque Ovunque Ovunque Ovunque particolare incidenza elevata in aree quali Mexico, Honduras, Ovunque Ovunque Ovunque Ovunque Europa, S America, India, Cina, SE Asia, Indonesia, Australia, alcune isole del Pacifico Tropici e subtropici Ovunque N e S America, Africa sub-sahariana, India, China, SE Asia, Indonesia, Australia alcune isole del Pacifico Ovunque Asia Africa, America, Asia, Australasia Africa, America, Asia, Europa Africa, Asia Africa, America (central and south), Asia Africa, America (centrale e sud), Asia Ovunque America (sud), Asia, Europa Asia Meridionale e Orientale Asia Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 40 di 60

41 Fasciolopsiasi Trematodi polmonari: Paragonimiasi/ specie Paragonimus Cestodei (Tenie): Diphyllobothrium latum Hymenolepsis nana, Taeniasis/ Taenia saginata/solium, Cystercercosis/ Taenia solium Echinococcosi/ Echinococcus sp. Sparganosi/ Spirometra mansonoides Coenurosi/ Taenia multiceps/serialis Estremo Oriente, subcontinente Indiano, Africa, alcune isole del Pacifico America (nord), Canada, Europa, Giappone, Russia, Scandinavia Ovunque Africa, America, Asia, Europa, Australasia America, Asia (particolarmente Cina e Giappone) Africa, America, Europa Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 41 di 60

42 Appendice 3: Calibrazione del microscopio per misurazione Calibrazione del microscopio per misurazione La dimensione dell uovo e della cisti è un importante peculiarità per l identificazione di molti parassiti. La dimensione può essere determinata usando un oculare micrometrico. Eseguire la calibrazione del microscopio nel modo seguente: La strumentazione richiesta comprende un oculare micrometrico e un vetrino micrometrico. 1 La scala dell oculare è suddivisa in 100 piccole parti. 2 La scala del vetrino micrometrico misura 1 mm ed è divisa in parti di 0.1 mm, ciascuna delle quali è ulteriormente suddivisa in parti di 0,01 mm. 3 Inserire l oculare micrometrico sostituendolo a quello del microscopio. 4 Porre il vetrino micrometrico sul piano portaoggetti del microscopio. 5 Mettere a fuoco con obiettivo a basso ingrandimento la scala micrometrica del vetrino. 6 Aggiustare le scale micrometrica dell oculare e quella micrometrica del vetrino in modo che appaiano parallele e sovrapposte. 7 Registrare il numero di divisioni della scala micrometrica dell oculare e quelle corrispondenti alla scala micrometrica del vetrino, ad esempio 10 segmenti della micrometrica oculare = 0,20 mm della micrometrica del vetrino. 8 Calcolare il valore di un segmento della scala micrometrica oculare nel modo seguente: 10 divisioni della micrometrica oculare = divisione micrometrica oculare = 0.20/10 = mm = 20 m Nota: Per convertire il valore calcolato (0,020 millimetri) sopra espresso in µm, dovrebbe essere moltiplicato per 1000 micron/mm per ottenere 20μm 9 Ripetere dal punto 5 per ogni obiettivo, registrare i risultati per ciascuno di loro. 10 Eseguire una sola calibrazione per ogni microscopio, suoi obiettivi ed oculare micrometrico in dotazione. Per gentile concessione di UK NEQAS Programma Didattico di Parassitologia 2003/2004; Parassiti fecali. Coordinato da Hilary Edwards Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 42 di 60

43 Appendice 4: Comuni costituenti microscopici delle feci 109 Componenti microscopici delle feci 1-4. cellule vegetali. 5. Parete spiraliforme del sistema vascolare vegetale. 6. ciuffo vegetale. 7. parete di cellulosa di cellula vegetale. 8 grano di polline. 9. bolla d aria. 10 gocce di grasso..11. fibra muscolare. 12 lieviti. 13 larva rabditiforme di Strongyloides stercoralis e 14. uovo di anchilostoma per confronto, Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 43 di 60

44 Ricerca di parassiti in campioni diversi dal sangue Appendice 5: Dimensioni comparative delle uova di elminti* *Misurazioni in micrometri (µm) Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 44 di 60

45 Appendice 6 Oocisti di coccidi/cryptogregaria/ microsporidia: Cystoisospora belli 1 Oocisti immatura (32 x 16 µm) Oocisti matura Le oocisti sono trasparenti. Si raccomanda illuminazione moderata. Per strisci diretti si può usare la colorazione Ziehl-Neelsen modificata Specie Cryptosporidium Oociste 5µm Sono raccomandate le colorazioni auramina fenolo e Ziehl-Neelsen modificata Specie Cyclospora (CLB) Non sporulate sporulate 8 10µm Nella preparazione in sospensione liquida non colorata, una morula centrale contiene alcune sfere rifrangenti. In acqua dolce la morula si divide in 2 piccole strutture. Cyclospora cayetanesis può essere osservata nelle concentrazioni formolo-etere in forma di sfere rifrangenti che non si colorano con iodio o auramina-fenolo ma presentano caratteristiche variabili all acido resistenza, assumendo o meno colorazione rosa con quella di Ziehl-Neelsen modificata. Non si colorano con auramina fenolo. Sono blu autofluorescenti a nm Specie Microsporidi 1-4 mm in funzione delle specie Anche se i microsporidi possono apparire acido-resistenti alla colorazione Ziehl- Neelsen modificata, si raccomanda la colorazione tricromica. Le spore dei Microsporidi sono ovoidali e rifrangenti e la parete delle spore assume colore rosa rosso brillante. Talvolta le spore si colorano con un cintura 'rossa che attraversa il centro della spora, oppure mostrano granuli polari; entrambe le formazioni sono di valore diagnostico. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 45 di 60

46 Ricerca di parassiti in campioni diversi dal sangue Appendice 7: Confronto fra elminti comunemente riscontrate nell uomo110 Taenia saginata (tenia del bue) Taenia solium (tenia del maiale) SEGMENTO MATURO (SIMILE IN CIASCUNA SPECIE) Segmento gravido Segmento gravido Più lungo che largo branche uterine laterali x 5-7 mm Più lungo che largo 7 12 branche uterine laterali 12 x 6 mm Aspetto di segmenti gravidi di tenia riscontrati nell uomo. T. saginata T. solium D. latum H. nana Nota: Le uova di entrambe T. solium e T. saginata sono identiche e la diagnosi è fatta dalla disponibilità delle proglottidi o dello scolice. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 46 di 60

47 Ricerca di parassiti in campioni diversi dal sangue Appendice 8: Larve di elminti charatteristiche111 Anchilostoma Strongyloides Larve filariformi Dimensione 500 x m Guaina presente Affusolate Esofago lungo un terzo del corpo Larve filariformi Dimensione 500 x ( m Guaina assente Aspetto smussato o ramificato Esofago lungo metà del corpo Larva rabditiforme Dimensione x m Profondità cavità buccale 15 m Esofago lungo un terzo del corpo con due rigonfiamenti Abbozzo genitale piccolo 7 m Poro anale a 80 m dall estremità caudale Larva rabditiformi Dimensione x m Breve cavità buccale 4 m Esofago lungo un terzo del corpo con due rigonfiamenti Abbozzo genitale grande 22 m Poro anale a 50 m dall estremità caudale Nei campioni di feci emissi di recente, le larve di più frequente osservazione sono le rabditoidi di Strongyloides stercolaris. Se le feci sono state emesse da 12 ore, le larve possono trasformarsi in larve filariformi che devono essere differenziate da quelle di anchilostoma (queste possono comparire nelle feci entro ore). Larve di elminti ANCHILOSTOMA filariforme STRONGYLOIDES rabditoide rabditoide filariforme Cavità buccale Abbozzo genitale WHO Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 47 di 60

48 Appendice 9: Identificazione di trofozoiti di amebe in strisci colorati 1 Trofozoite con o senza cromatina nucleare periferica con cromatina nucleare periferica senza cromatina nucleare periferica citoplasma grossolanamente citoplasma finemente un nucleo due nuclei in più del granulato granulato, globuli rossi in tutti I trofozoiti 50% dei trofozoiti batteri & lieviti assenti o presenti globuli rossi assenti batteri assenti nucleo con nucleo senza grandi zolle di granuli periferici granuli periferici cromatina in grande endosoma spazio chiaro Entamoeba coli dimensione >15 m endosoma piccolo. granuli periferici nel nucleo a disposizione regolare endosoma grande irregolare Dientamoeba Fragilis dimensione 5-15 m dimensione 8-15 m dimensione m Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 48 di 60

49 Ricerca di parassiti in campioni diversi dal sangue Appendice 10: Balantidiun coli trofozoite e ciste1 Caratteristiche di Trofozoite di Balantidium coli e ciste di Balantidium coli Trofozoite Ciste Ovale e rivestita di corte ciglia Sferica o ellissoidale misure di circa μm di lunghezza x μm di larghezza, ma possono raggiungere lunghezze fino a 200μm Misura da μm per μm Un citostoma a forma di imbuto può essere riscontrato in prossimità dell'estremità anteriore Contiene 1 macronucleo e 1 micronucleo Presenza di ciglia nelle giovani cisti, ma scompaiono dopo incistamento prolungato Nei preparati colorati possono essere osservati micronucleo e macronucleo Nota: le preparazioni in sospensione dei campioni di feci fresche e concentrate rivelano le caratteristiche cisti e i trofozoiti mobili. Questi sono più facili da identificare in preparati diretti strisciati da sospensioni in fisiologica rispetto a quelli di strisci fecali con colorazione permanente. Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 49 di 60

50 Ricerca parassiti in campioni diversi sal sangue Appendice 11: Identificazione di amebe e cisti flagellate Ciste con Filamenti dentro ciste flagellata Senza filamenti dentro La ciste flagellata Forma a pera 1 nucleo dimensione 4-7 µm Forma di limone 1 nucleo 1 dimensione 5-9 µm Cisti ovale Parete spessa 4 nuclei grandi masse di cromatina Cromatina nucleare periferica assente Nuclei grandi eccentrici, vacuoli colorati con iodio Cromatina nucleare periferica presente < 10 ore ore ore 1, 2, o 4 nuclei masse di glicogeno Dimensione d4-10 µm Da 1 a 4 nuclei di solito 2 nuclei Dimensione µm corpi parabasali 2-4 nuclei Posti s uns estremità cisti immatura Entoamoeba coli (Cisti matura e immatura) 1, 2, o 4 nuclei masse di glicogeno 2, 4, o 5 nuclei Con presenza di Cromatina periferica Cisti matura Cisti immatura Entoamoebaura histolytica / dispar Acanthamoeba (11-30μm) Batteriologia B 31 Emissione no: 5 Data emissione: Pagina: 50 di 60

51 Appendice 12: Identificazione di trofozoiti flagellati 1 Trofozoite con 2 o più flagelli 2 flagelli, 1 nucleo, dimensione 4-9 µm 4 flagelli 5 o più flagelli Dimensione 4-8 µm 1 nucleo Dimensione 6-20 µm, 1 nucleo 1 cistosoma 5 flagelli 1 nucleo dimensioni 4-8 µm Trofozoita a forma di pera, 4 paia di flagelli, 2 nuclei dimensioni µm Nota: Si noti che Trichomonas hominis non ha una fase cistica. (Adattato e ridisegnato, OMS, 1991) Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 51 di 60

52 Appendice 13: Microfilarie riscontrate nell Uomo 1 Con guaina Spazio cefalico Poro anale cellula R1 Senza guaina Guaina cell R 4 cell R 3 cell R 2 Anello nervoso Polo escretorio Cellule escretorie nel sangue nella cute Con guaina Senza guaina Senza guaina Nuclei estesi fino nuclei non estesi all estremità nuclei estesi fino nuclei non estesi nuclei estesi all estremità nuclei non este all estremità caudale caudale, spazio cefalico lungo all estremità caudale all estremità caudale caudale, filaria piccola, all estremità cau quanto largo coda smussata filaria piccola, sottile sottile, estremità ad uncino filaria sottile Coda gonfia con 2 nuclei distinti, spazio cefalico di doppia lunghezza rispetto al corpo Coda uniforme, spazio cefalico lungo quanto largo Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 52 di 60

53 Bibliografia Tabella di GRADE (Grading of Recommendations, Assessment, Development, and Evaluation) modificata, utilizzata dalle SMI UK nella valutazione della bibliografia Il GRADE (Grading of Recommendations, Assessment, Development, and Evaluation) è un approccio sistematico alla valutazione della bibliografia. Per le UK SMI si utilizza un metodo GRADE modificato per valutare l inclusione dei riferimenti bibliografici. Ogni riferimento bibliografico è valutato e assegnato a un grado di consistenza delle raccomandazione (A-D) e alla qualità delle prove soggiaenti(i-vi). Di seguito è presentata una tabella riassuntiva che definisce il grade che deve essere utilizzato in congiunzione con l elenco delle voci bibliografiche. Consistenza della raccomandazione Evidenza della qualità A Fortemente raccomandata I Dimostrazione da studi controllati, randomizzati, meta-analisi, e revisionati sistematicamente B Raccomandata ma possono essere accettabili altre alternative II Dimostrazione da studi non randomizzati C Debolmete recommandata: ricercare alternative III Studi non-analitici, es. casi riportati, recensioni, serie di casi D Mai consigliate IV Opinione degli esperti e ampia accettazione come buona pratica, ma con nessuna prova di studio V Richiesto dalla normativa, codice di buona pratica o norma nazionale VI Lettera o altro 1. World Health Organization Basic laboratory methods in medical parasitology, pages Geneva: World Health Organization; B, V 2. Fletcher SM, Stark D, Harkness J, Ellis J. Enteric protozoa in the developed world: a public health perspective. Clinical Microbiology Reviews 2012;25: B, III 3. Efunshile MA, Ngwu BA, Kurtzhals JA, Sahar S, Konig B, Stensvold CR. Molecular Detection of the Carriage Rate of Four Intestinal Protozoa with Real-Time Polymerase Chain Reaction: Possible Overdiagnosis of Entamoeba histolytica in Nigeria. The American journal of tropical medicine and hygiene 2015;93: B, I 4. Tanyuksel M, Petri WA. Laboratory diagnosis of amebiasis. Clinical Microbiology Reviews 2003;16: B, III 5. Fotedar R, Stark D, Beebe N, Marriott D, Ellis J, Harkness J. Laboratory diagnostic techniques for entamoeba species. Clinical Microbiology Reviews 2007;20: B, III 6. Visvesvara GS, Moura H, Schuster FL. Pathogenic and opportunistic free-living amoebae: Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, Naegleria fowleri, and Sappinia diploidea. FEMS ImmunolMedMicrobiol 2007;50:1-26. B, III Batteriologia B 31 Emissione no: 4 Data emissione: Pagina: 53 di 60

54 Ricerca di parassiiti in campioni diversi dal sangue 7. Plutzer J, Ongerth J, Karanis P. Giardia taxonomy, phylogeny and epidemiology: Facts and open questions. IntJHygEnvironHealth 2010;213: B, III 8. Gotfred-Rasmussen H, Lund M, Enemark HL, Erlandsen M, Petersen E. Comparison of sensitivity and specificity of 4 methods for detection of Giardia duodenalis in feces: immunofluorescence and PCR are superior to microscopy of concentrated iodine-stained samples. Diagnostic microbiology and infectious disease 2016;84: B, II 9. Ellam H, Verlander NQ, Lamden K, Cheesbrough JS, Durband CA, James S. Surveillance of giardiasis in Northwest England : impact of an enzyme immunoassay test. Euro surveillance : bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin 2008;13. B, II 10. Van den Bossche D, Cnops L, Verschueren J, Van Esbroeck M. Comparison of four rapid diagnostic tests, ELISA, microscopy and PCR for the detection of Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. and Entamoeba histolytica in feces. Journal of microbiological methods 2015;110: B, II 11. Minetti C CR, Beeching NJ, Probert C, Lamden K.. Giardiasis. BMJ B, III 12. Barratt JL, Harkness J, Marriott D, Ellis JT, Stark D. A review of Dientamoeba fragilis carriage in humans: several reasons why this organism should be considered in the diagnosis of gastrointestinal illness. Gut Microbes 2011;2:3-12. B, III 13. Ackers JP. Trichomonads. In: Gillespie SH, Hawkey PM, editors. Medical Parasitology - A Practical Approach. Oxford: Oxford University Press; p B, VI 14. Hobbs MM, Sena, A. C. Modern diagnosis of Trichomonas vaginalis infection. Sexually transmitted infections 2013;89: B, III 15. Association of Public Health Laboratories. Advances in Laboratory Detection of Trichomonas vaginalis. APHL B, III 16. Public Health Laboratory Service. Outbreak of cyclospora infection in North America. Commun Dis Rep CDR Wkly 1996;6:223, 6. B, III 17. Lopez AS, Bendik JM, Alliance JY, Roberts JM, da Silva AJ, Moura IN et al. Epidemiology of Cyclospora cayetanensis and other intestinal parasites in a community in Haiti. JClinMicrobiol 2003;41: B, II 18. Nichols GL, Freedman J, Pollock KG, Rumble C, Chalmers RM, Chiodini P et al. Cyclospora infection linked to travel to Mexico, June to September Euro surveillance : bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin 2015;20. B, III 19. Doller PC, Dietrich K, Filipp N, Brockmann S, Dreweck C, Vonthein R et al. Cyclosporiasis outbreak in Germany associated with the consumption of salad. EmergInfectDis 2002;8: B, II 20. Insulander M, Svenungsson B, Lebbad M, Karlsson L, de Jong B. A foodborne outbreak of Cyclospora infection in Stockholm, Sweden. FoodbornePathogDis 2010;7: B, II 21. Ortega YR, Sterling CR, Gilman RH, Cama VA, Diaz F. Cyclospora species--a new protozoan pathogen of humans. N EnglJ Med 1993;328: B, II Batteriologia B 31 Emissione no: 5 Data emissione: Pagina: 54 di 60

55 Ricerca di parassiiti in campioni diversi dal sangue 22. Navaneethan U, Venkatesh PG, Downs-Kelly E, Shen B. Isospora belli superinfection in a patient with eosinophilic gastroenteritis--a diagnostic challenge. Journal of Crohn's & colitis 2012;6: B, III 23. Ud Din N, Torka P, Hutchison RE, Riddell SW, Wright J, Gajra A. Severe Isospora (Cystoisospora) belli Diarrhea Preceding the Diagnosis of Human T-Cell-Leukemia-Virus-1- Associated T-Cell Lymphoma. Case reports in infectious diseases 2012;2012: B, III 24. ten Hove RJ, van Lieshout L, Brienen EA, Perez MA, Verweij JJ. Real-time polymerase chain reaction for detection of Isospora belli in stool samples. Diagnostic microbiology and infectious disease 2008;61: B, II 25. Desoubeaux G, Cabanne E, Franck-Martel C, Gombert M, Gyan E, Lissandre S et al. Pulmonary toxoplasmosis in immunocompromised patients with interstitial pneumonia: a singlecentre prospective study assessing PCR-based diagnosis. J Clin Pathol B, II 26. Cavalier-Smith T. Gregarine site-heterogeneous 18S rdna trees, revision of gregarine higher classification, and the evolutionary diversification of Sporozoa. European journal of protistology 2014;50: B, III 27. Casemore DP. Cryptosporidium and other protozoan parasites and the water route of infection. Health and Hygiene 1991;12: B, III 28. Chalmers RM, Atchison C, Barlow K, Young Y, Roche A, Manuel R. An audit of the laboratory diagnosis of cryptosporidiosis in England and Wales. Journal of medical microbiology 2015;64: B, II 29. Omoruyi BE, Nwodo UU, Udem CS, Okonkwo FO. Comparative diagnostic techniques for cryptosporidium infection. Molecules 2014;19: B, II 30. Chalmers RM, Campbell BM, Crouch N, Charlett A, Davies AP. Comparison of diagnostic sensitivity and specificity of seven Cryptosporidium assays used in the UK. JMedMicrobiol 2011;60: B, II 31. Chalmers RM, Campbell B, Crouch N, Davies AP. Clinical laboratory practices for detection and reporting of Cryptosporidium in community cases of diarrhoea in the United Kingdom, EuroSurveill 2010;15. B, II 32. Tan KS. New insights on classification, identification, and clinical relevance of Blastocystis spp. ClinMicrobiolRev 2008;21: B, III 33. Stenzel DJ, Boreham PF. Blastocystis hominis revisited. ClinMicrobiolRev 1996;9: B, III 34. Windsor JJ, Bamber AI, Macfarlane L. Detection of Dientamoeba fragilis and Blastocystis hominis using a simple staining method. BrJBiomedSci 2006;63:27-8. C, II 35. Coyle CM, Varughese J, Weiss LM, Tanowitz HB. Blastocystis: to treat or not to treat. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2012;54: B, II 36. Franzen C, Muller A. Microsporidiosis: human diseases and diagnosis. MicrobesInfect 2001;3: B, III 37. Capella-Gutierrez S, Marcet-Houben M, Gabaldon T. Phylogenomics supports microsporidia as the earliest diverging clade of sequenced fungi. BMCBiol 2012;10:47. B, III Batteriologia B 31 Emissione no: 5 Data emissione: Pagina: 55 di 60

56 Ricerca di parassiiti in campioni diversi dal sangue 38. Aspock H, Hassl A. Parasitic infections in HIV patients in Austria: first results of a long-term study. ZentralblBakteriol 1990;272: B, II 39. Cegielski JP, Msengi AE, Dukes CS, Mbise R, Redding-Lallinger R, Minjas JN et al. Intestinal parasites and HIV infection in Tanzanian children with chronic diarrhea. AIDS 1993;7: B, II 40. Stringer JR, Beard CB, Miller RF. Spelling Pneumocystis jirovecii. EmergInfectDis 2009;15:506. A, VI 41. Stringer JR, Beard CB, Miller RF, Wakefield AE. A new name (Pneumocystis jiroveci) for Pneumocystis from humans. EmergInfectDis 2002;8: B, III 42. Neva FA, Brown,H.W.,. Intestinal Nematodes of Human Beings. Basic Clinical Parasitology. 6th ed. London: Prentice Hall International; p B, VI 43. Durand-Joly I, Chabe M, Soula F, Delhaes L, Camus D, Dei-Cas E. Molecular diagnosis of Pneumocystis pneumonia. FEMS immunology and medical microbiology 2005;45: B, III 44. Lu JJ, Chen CH, Bartlett MS, Smith JW, Lee CH. Comparison of six different PCR methods for detection of Pneumocystis carinii. Journal of clinical microbiology 1995;33: B, II 45. Leonidas DD, Elbert BL, Zhou Z, Leffler H, Ackerman SJ, Acharya KR. Crystal structure of human Charcot-Leyden crystal protein, an eosinophil lysophospholipase, identifies it as a new member of the carbohydrate-binding family of galectins. Structure 1995;3: B, III 46. Kupper T, Spies S, Wehle K, Pfitzer P. Detection of Charcot-Leyden crystals by fluorescence microscopy of Papanicolaou-stained smears of sputum, bronchoalveolar lavage fluid, and bronchial secretions. Cytopathology 1994;5: B, II 47. Wolfe MS. Eosinophilia in the returning traveler. Infect Dis Clin North Am 1992;6: B, III 48. Mahmoud AA. Intestinal nematodes (roundworms). In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th ed.vol 2. Edinburgh: Churchill Livingstone; p B, VI 49. Phosuk I, Intapan PM, Prasongdee TK, Changtrakul Y, Sanpool O, Janwan P et al. Human Trichostrongyliasis: A Hospital Case Series. The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health 2015;46: B, III 50. Medical Parasitology. Pennsylvania: WB Saunders & Co. Ltd.; B, VI 51. Repetto SA, Ruybal P, Solana ME, Lopez C, Berini CA, Alba Soto CD et al. Comparison between PCR and larvae visualization methods for diagnosis of Strongyloides stercoralis out of endemic area: A proposed algorithm. Acta tropica 2016;157: B, II 52. Grove DI. Tissue nematodes (trichinosis, dracunculiasis, filariasis). In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th ed.vol 2. Edinburgh: Churchill Livingstone; p B, VI 53. Nash TE. Visceral larva migrans and other unusual helminth infections. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th ed.vol 2. Edinburgh: Churchill Livingstone; p B, VI 54. Neafie RC, Marty AM. Unusual infections in humans. ClinMicrobiolRev 1993;6: B, III Batteriologia B 31 Emissione no: 5 Data emissione: Pagina: 56 di 60

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58 Ricerca di parassiiti in campioni diversi dal sangue 70. Centers for Disease Control and Prevention. Laboratory Identification of Parasitic Diseases of Public Health Concern - specimen collection. Centers for Disease Control and Prevention B, VI 71. Health and Safety Executive. Safe use of pneumatic air tube transport systems for pathology specimens Department for transport. Transport of Infectious Substances, 2011 Revision World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances Home Office. Anti-terrorism, Crime and Security Act Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The Approved List of Biological Agents. Health and Safety Executive Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Infections at work: Controlling the risks. Her Majesty's Stationery Office Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Biological agents: Managing the risks in laboratories and healthcare premises. Health and Safety Executive Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Biological Agents: Managing the Risks in Laboratories and Healthcare Premises. Appendix 1.2 Transport of Infectious Substances - Revision. Health and Safety Executive Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Surveill Summ 2012;61: Health and Safety Executive. Control of Substances Hazardous to Health Regulations. The Control of Substances Hazardous to Health Regulations th ed.: HSE Books,; Health and Safety Executive. Five Steps to Risk Assessment: A Step by Step Guide to a Safer and Healthier Workplace. HSE Books, Health and Safety Executive. A Guide to Risk Assessment Requirements: Common Provisions in Health and Safety Law. HSE Books, Health Services Advisory Committee. Safe Working and the Prevention of Infection in Clinical Laboratories and Similar Facilities. HSE Books British Standards Institution (BSI). BS EN Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets British Standards Institution (BSI). BS 5726: Microbiological safety cabinets. Information to be supplied by the purchaser and to the vendor and to the installer, and siting and use of cabinets. Recommendations and guidance Warhurst DC. Diagnosis of amoebic infection. In: Gillespie SH, Hawkey PM, editors. Medical Parasitology - A Practical Approach. Oxford: Oxford University Press; p B, VI 87. Baron EJ, Miller JM, Weinstein MP, Richter SS, Gilligan PH, Thomson RB, Jr. et al. A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM). ClinInfectDis 2013;57:e22-e121. Batteriologia B 31 Emissione no: 5 Data emissione: Pagina: 58 di 60

59 Ricerca di parassiiti in campioni diversi dal sangue 88. Garcia LS. Acceptable fecal specimens for ova and parasite examinations. Clin Microbiol Newslett 1989;11: B, VI 89. Centers for Disease Control and Prevention. Laboratory Identification of Parasitic Diseases of Public Health Concern - Diagnostic Procedure. Centers for Disease Control and Prevention, B, VI 90. Marshall I. Schistosomiasis. In: Gillespie SH, Hawkey PM, editors. Medical Parasitology - A Practical Approach. Oxford: Oxford University Press; p B, VI 91. The Royal College of Pathologists. The retention and storage of pathological records and specimens (5th edition) Smith HV. Intestinal protozoa. In: Gillespie SH, Hawkey PM, editors. Medical Parasitology - A Practical Approach. Oxford: Oxford University Press; p. 96. B, VI 93. Casemore DP, Roberts C. Guidelines for screening for Cryptosporidium in stools: report of a joint working group. J Clin Pathol 1993;46:2-4. A, V 94. World Health Organization Basic laboratory methods in medical parasitology, page 18. Geneva: World Health Organization; B, V 95. Allen AV, Ridley DS. Further observations on the formol-ether concentration technique for faecal parasites. JClinPathol 1970;23: A, V 96. Uga S, Tanaka K, Iwamoto N. Evaluation and modification of the formalin-ether sedimentation technique. TropBiomed 2010;27: B, II 97. Anamnart W, Pattanawongsa A, Intapan PM, Maleewong W. Factors affecting recovery of Strongyloides stercoralis larvae: an approach to a newly modified formalin-ether concentration technique for diagnosis of strongyloidiasis. JClinMicrobiol 2010;48: B, II 98. Perry JL, Matthews JS, Miller GR. Parasite detection efficiencies of five stool concentration systems. JClinMicrobiol 1990;28: B, II 99. Becker SL, Lohourignon LK, Speich B, Rinaldi L, Knopp S, N'goran EK et al. Comparison of the Flotac-400 dual technique and the formalin-ether concentration technique for diagnosis of human intestinal protozoon infection. JClinMicrobiol 2011;49: B, I 100. Saez AC, Manser MM, Andrews N, Chiodini PL. Comparison between the Midi Parasep and Midi Parasep Solvent Free (SF) faecal parasite concentrators. JClinPathol 2011;64: B, II 101. Manser MM, Saez AC, Chiodini PL. Faecal Parasitology: Concentration Methodology Needs to be Better Standardised. PLoS neglected tropical diseases 2016;10:e B, II 102. Garcia LS. Parasitology. In: Isenberg HD, editor. Clinical Microbiology Procedures HandbookVol 1. Washington D.C.: American Society for Microbiology; p B, VI 103. Public Health England. Laboratory Reporting to Public Health England: A Guide for Diagnostic Laboratories Department of Health. Health Protection Legislation (England) Guidance Scottish Government. Public Health (Scotland) Act Batteriologia B 31 Emissione no: 5 Data emissione: Pagina: 59 di 60

60 Ricerca di parassiiti in campioni diversi dal sangue 106. Scottish Government. Public Health etc. (Scotland) Act Implementation of Part 2: Notifiable Diseases, Organisms and Health Risk States The Welsh Assembly Government. Health Protection Legislation (Wales) Guidance Home Office. Public Health Act (Northern Ireland) 1967 Chapter Guide to Human Parasitology for Medical Practitioners. London: HK Lewis & Co. Ltd.; B, VI 110. Atlas of Medical Helminthology and Protozoology. Edinburgh: Churchill Livingstone; B, VI 111. World Health Organization Basic laboratory methods in medical parasitology, pages 70. Geneva: World Health Organization; B, VI Batteriologia B 31 Emissione no: 5 Data emissione: Pagina: 60 di 60