Il metabolismo epatico delle proteine in fisiologia e patologia

Transcript

1 Il metabolismo epatico delle proteine in fisiologia e patologia Alfredo Cantàfora Dipartimento di Medicina Clinica Università La Sapienza - Roma

2 Argomenti trattati Comparti epatocellulari Biosintesi delle proteine Struttura e funzione Traffico intracellulare Catabolismo delle proteine Molecole Chaperone Meccanismi di danno cellulare Risposta al danno cellulare

3 Distribuzione delle superfici di membrana nella cellula epatica (volume circa 5000 μm 3 ) Membrana plasmatica 2% ER rugoso 35% Totale del Reticolo ER liscio 16% endoplasmatico 51% Apparato di Golgi 7% Mitocondri 39% Membrana nucleare 0.2% Lisosomi 0.4% Perossisomi 0.4% Endosomi 0.4% Molecular biology of the cell 2 nd ed. Bruce Alberts et al. Garland Publisher, Inc. NY, 1990

4 Il Reticolo Endoplasmatico Nell epatocita può occupare fino al 50% dello spazio intracellulare

5 Sintesi proteica catalizzata dai Ribosomi

6 Sintesi proteica catalizzata dai Ribosomi La formazione di ogni legame peptidico richiede l idrolisi di 4 gruppi fosfato (da ATP e GTP) pari a cal/mole. Essendo l energia di legame di cal/mole, ogni legame peptidico comporta la perdita di cal/mole.

7 Road Map del traffico intracellulare delle proteine Ribosomi Citosol Reticolo endoplasmatico endosoma Mitocondri Perossisomi Golgi Nucleo Vescicole secretorie Lisosomi Membrana plasmatica

8 Molte proteine sono dotate di sequenze aa (signal peptide o signal patch) che le indirizzano i a specifici i organelli. In mancanza di signal peptide le proteine restano nel citosol. Ad es., la seguente sequenza del terminale amminico determina la translocazione della proteina al ER + NH 3 Met-Met Met-Ser Ser-Phe Phe-Val Val-Ser Ser-Leu Leu-Leu Leu-Leu Leu-Val Val-Gly Gly-Ile Ile- Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu - -Ala-Glu - -Gln-Leu-Thr-Lys + -Cys- Glu - -Val-Phe-Gln- La seguente sequenza del terminale carbossilico ne determina invece la ritenzione nel RE -Lys + -Asp - -Glu - -Leu-COO -

9 Il sistema Nucleo Reticolo Endoplasmatico - Golgi Citosol Vescicole secretorie

10 Il catabolismo delle proteine Le proteine strutturali tt hanno generalmente emivita it molto lunga, le proteine con funzione di segnale o con attività enzimatica sono invece degradate rapidamente.

11 Il catabolismo delle proteine Le proteine strutturali tt hanno generalmente emivita it molto lunga, le proteine con funzione di segnale o con attività enzimatica sono invece degradate rapidamente. Nel citosol l emivita della proteina dipende dal tipo di aa sul terminale amminico della molecola (Met, Ser, Thr, Ala, Val, Cys, Gly e Pro stabilizzano la proteina, gli altri aa la destabilizzano).

12 Il catabolismo delle proteine Le proteine strutturali tt hanno generalmente emivita it molto lunga, le proteine con funzione di segnale o con attività enzimatica sono invece degradate rapidamente. Nel citosol l emivita della proteina dipende dal tipo di aa sul terminale amminico della molecola (Met, Ser, Thr, Ala, Val, Cys, Gly e Pro stabilizzano la proteina, gli altri aa la destabilizzano). Si riteneva un tempo che la degradazione delle proteine fosse operata dai lisosomi. Ora si sa che un rilevante contributo è dato dal ubiquitin-dependent pathway che avviene nel proteasoma presente nel citosol.

13 Degradazione proteica ubiquitina-dipendente L ubiquitina è una proteina termostabile di 76 aa la cui estremità carbossilica può legarsi al gruppo amminico della lisina. L attacco di una singola molecola di ubiquitina è reversibile; la poli- ubiquitinazione determina invece l immediata degradazione d ad opera di proteasi ATP-dipendenti

14 Degradazione proteica ubiquitina-dipendente E1= enzima attivatore dell ubiquitina E2= enzima coniugatore dell ubiquitina E3= ubiquitina ligasi

15 Degradazione proteica ubiquitina-dipendente E1= enzima attivatore dell ubiquitina E2= enzima coniugatore dell ubiquitina E3= ubiquitina ligasi La proteina poli-ubiquitilata è soggetta all azione di proteasi ATP-dipendenti nel proteasoma

16 Il proteasoma Vista laterale Entrata substrati Vista dall alto Subunità α 150Ǻ Subunità β Subunità α 115Ǻ Prodotti di proteolisi Ø cavità interna 53 Ǻ Øf foro ingresso 13Ǻ Ǻ

17 Danno e risposta cellulare Molecole Chaperone Unfolded Protein Response Proteine e lipidi di membrana

18 Fanno soffrire le membrane del ER (e la cellula in generale): Fenomeni ischemici Stress ossidativo (apoptosi e infiammazione) Eccessivo accumulo intracellulare di lipidi (steatosi) Presenza di proteine degradate e/o denaturate nel lume del ER Anomala distribuzione dei lipidi di membrana (ad es., alto CH/PL) Prodotti di ossidazione e degradazione dei lipidi Presenza di detergenti endogeni ed esogeni (ad es., BS idrofobi) Farmaci e sostanze tossiche, naturali e sintetiche (ad es., l alcool) Disordini metabolici (ad es., diabete, obesità) Infezioni virali (ad es., HCV, HBV)

19 Il Reticolo Endoplasmatico risponde allo stress con i seguenti meccanismi: Attivazione i della risposta st alle proteine denaturate t (UPR = Unfolded d Protein Response) mediata da chaperoni proteici e molecolari Modificazione della biosintesi dei lipidi di membrana in modo da contrastare le alterazioni della composizione Attivazione dei meccanismi di anti-ossidazione Modificazione delle sostanze tossiche Attivazione dell apoptosi in caso di danno irrimediabile

20 Dov è lo chaperone? Che fa lo chaperone? Gerard ter Borch (Zwolle 1617 Deventer 1681) The dancing couple Amsterdam 1660

21 Lo Chaperone Ccntrolla che le interazioni nella coppia siano corrette Gerard ter Borch (Zwolle 1617 Deventer 1681) The dancing couple Amsterdam 1660

22 TUDCA Tauroursodesossicolato PBA Acido 4-fenil butirrico TMAO TAU Chaperoni molecolari Trimetilammina N-ossido diidrato Taurina Famiglia HSP90 HSP70 HSP40 Chaperoni proteici Funzione Rinaturazione struttura proteica e tolleranza dello stress Legame alle proteine denaturate e prevenzione loro aggregazione Consegna dei substrati proteici alle HSP70 e stimolo delle ATPasi Alcune proteine, come Hop e Ciclofillina 40, sono co-fattori degli chaperon HSP90 e HSP70.

23 Unfolded Protein Response

26 Unfolded Protein Response Aumento della biosintesi degli chaperoni e della degradazione delle UPs

28 Unfolded Protein Response Riduzione sintesi proteica, attivazione anti-ossidanti, degradazione UPs

29 Stress del RE e metabolismo lipidico cellulare I cambiamenti nella composizione dei lipidi di membrana sono mediati da proteine dotate di Sterol Sensing Domain (SSD) che agiscono, in modo indiretto e complesso, sulla trascrizione di geni muniti di Sterol Regulatory Element (SRE)

30 Membrana del ER con bassi livelli di colesterolo La proteina INSIG1, munita di SSD, perde il contatto con HMGCR e con il complesso SCAP/SREBP

31 Membrana del ER con bassi livelli di colesterolo Il complesso SCAP/SREBP lascia il RE rivestito da una coat protein e fonde col Golgi

32 Membrana del ER con bassi livelli di colesterolo L attivazione delle proteasi S1P e S2P stacca il fattore di trascrizione di SREBP che penetra nel nucleo

33 Membrana del ER con bassi livelli di colesterolo Aumenta la trascrizione dei geni muniti di SRE, tra i quali HMGCR, LDLR e INSIG1

34 Membrana del ER con bassi livelli di colesterolo La proteina INSIG1 non legata è soggetta ad un rapido turnover mediato da ubiquitilazione e degradazione proteasomica

35 Membrana del ER con alti livelli di colesterolo Gli alti livelli di CH aumentano l interazione di INSIG1 con il complesso SCAP/SREBP e con HMGCR

36 Membrana del ER con alti livelli di colesterolo Il mancato rilascio del complesso SCAP/SREBP fa crollare la trascrizione dei geni muniti di SRE

37 Membrana del ER con alti livelli di colesterolo L interazione INSIG1-HMGCR favorisce la ubiquitilazione di HMGCR e la sua degradazione proteasomica

38 La proteina INSIG1 non legata subisce una rapida degradazione proteasomica. Nel complesso, si ferma la biosintesi bosntes del colesterolo.

39 I dati sperimentali suggeriscono che INSIG1 è uno chaperone specifico per proteine che contengono lo SSD, quali: SCAP (attivatore della proteolisi di SREBP) HMGCR (enzima limitante la biosintesi del CH) NPC1 (trasportatore intracellulare del colesterolo) INSIG1 regola, quindi, l attività ità e la degradazione d di queste proteine mediante meccanismi di translocazione e ubiquitinazione

40 I principali effetti della modulazione INSIG1-mediata sul metabolismo lipidico sono dovuti al rilascio del fattore nucleare derivato da SREBP che agisce su più di 20 geni muniti di SRE, tra i quali: HMGCR (aumento biosintesi CH) LDLR (aumento captazione recettoriale CH) NPC1L1(aumento captazione non recettoriale CH) NPC1 GPAT (aumento trasporto intracellulare CH) (aumento sintesi trigliceridi a scapito dei PL) Fatty Acid synthases Fatty Acid desaturases

41 Leclercq I.A. et al. J. Hepatol. 47: , 156, 2007

42 Conclusioni 1 Metabolismo lipidico e proteico del RE s intrecciano in modo complesso e sono influenzati dalle condizioni di stress. Nell epatocita, ad es., lo stress prolungato aumenta sintesi e accumulo di colesterolo e dei lipidi intracellulari (fatty liver).

43 Conclusioni 2 In condizione one di stress moderato la sntes sintesi proteica proteca diminuisce dmnusce di poco e così pure i livelli di INSIG1. Ciò induce la stimolazione dei geni con SRE (HMGCR, NPC1L1) mediato dal processing di SREBP e una maggiore sintesi e assorbimento del colesterolo, utile a sostenere i processi di rigenerazione cellulare.

44 Conclusioni 2 In condizione one di stress moderato la sntes sintesi proteica proteca diminuisce dmnusce di poco e così pure i livelli di INSIG1. Ciò induce la stimolazione dei geni con SRE (HMGCR, NPC1L1) mediato dal processing di SREBP e una maggiore sintesi e assorbimento del colesterolo, utile a sostenere i processi di rigenerazione cellulare. In condizione di forte stress diminuiscono sintesi proteica e livelli di INSIG1. Ne consegue attivazione incontrollata di SREBP e forte stimolo dei geni con SRE. La sovrapproduzione di CH e TG (a scapito dei PL) induce l accrescimento dei lipid stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP).

45 Conclusioni 2 In condizione one di stress moderato la sntes sintesi proteica proteca diminuisce dmnusce di poco e così pure i livelli di INSIG1. Ciò induce la stimolazione dei geni con SRE (HMGCR, NPC1L1) mediato dal processing di SREBP e una maggiore sintesi e assorbimento del colesterolo, utile a sostenere i processi di rigenerazione cellulare. In condizione di forte stress diminuiscono sintesi proteica e livelli di INSIG1. Ne consegue attivazione incontrollata di SREBP e forte stimolo dei geni con SRE. La sovrapproduzione di CH e TG (a scapito dei PL) induce l accrescimento dei lipid stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP). Il prolungamento delle condizioni di stress provoca l accumulo di CH nelle membrane che blocca la regolazione della biosintesi dei lipidi idi mediata dal rilascio i del complesso SCAP/SREBP attraverso l interazione con INSIG1. Peggiora il rapporto CH/PL del RE e ne consegue l infarcimento lipidico dell epatocita.

46