Vecchie e nuove PAT: dai ruminanti agli insetti?

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1 Vecchie e nuove PAT: dai ruminanti agli insetti? Daniela Marchis daniela.marchis@izsto.it Alessandro Benedetto alessandro.benedetto@izsto.it

2 IL CONTESTO

3 Regolamento CE 882/2004 (prossimamente.. Reg.(UE) 625/2017) Laboratori Europei di Riferimento- EURL Laboratori Nazionali di Riferimento NRL In Italia Laboratori Ufficiali II.ZZ.SS

4 Regolamenti EU Feed ban è la misura-base insieme alla rimozione del MSR per prevenire I rischi di trasmissione di BSE Divieto di somministrazione di proteine animali trasformate (PAT) agli animali ad uso zootecnico. PAT prodotte da carcasse di ruminanti, alcune delle quali infette, sono state ritenute responsabili della via di trasmissione della BSE

5 Regolamento (EU) No 142/2011 Allegato I: Farina di carne ed ossa o MEAT AND BONE MEAL (MBM): deriva da SOA Categoria 1 e Categoria 2 Proteine Animali Trasformate (PAT): derivano da SOA Categoria 3 (incluse farina di sangue e farina di pesce ) Tseroad map II (rev. 10) : PAT e MBM poichéla possibilitàdi trasmissione di una TSE da non ruminante a non ruminante èmolto improbabile le PAT di non ruminante possono costituire una fonte di proteine di elevata qualitàda utilizzarsi nell'alimentazione dei non ruminanti, evitando il riciclo intraspecie.

6 Proteine animali consentite nell'alimentazione degli animali da reddito: (Reg. EU 56/2013) Ruminanti: -Latte, prodotti a base di latte e colostro - Uova e ovoprodotti -Collagene and gelatina derivati da non-ruminanti -Proteine idrolizzate derivate da parti di non ruminante e da zoccoli e pelli di ruminante - Farine di pesce come sostitutivi del latte in ruminanti non svezzati (milk replacers).

7 Proteine animali consentite nell'alimentazione degli animali da reddito: (Reg. EU 56/2013) Non ruminanti - Tutto quanto consentito per i ruminanti -Farina di pesce -Fosfato dicalcicoe tricalcicodi OA - Prodotti a base di sangue di non ruminanti. Acquacultura: - Tutto quanto consentito per I non ruminanti - PAT di animali terrestri non ruminanti (pollo, suino)

8 Metodi ufficiali: Regolamento (UE) 51/2013 e SOPs collegate, preparate da EURL-AP and pubblicate sul web ( 1. Microscopia ottica 2. RealTime-PCR(al momento applicabile solo per mangimi per pesci e ingredienti per mangimi per pesci )

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11 CAMPIONI DI CAMPO (campioni ufficiali PNAA): RealTime-PCR: Molti campioni di mangimi per pesci sono risultati positivi per la presenza di DNA di ruminante Elevato rischio di cross contaminazioni durante il trasporto dei SOA, se le procedure di pulizia, autorizzate dall'ac, non sono rispettate La scarsa attenzione alla prevenzione di questo rischio può creare problemi a tutto il sistema di controllo

12 Problemi:

13 Inoltre: RealTime-PCRnon consente di discriminare tra DNA di ruminante derivato da latte o prodotti a base di latte (autorizzati per tutte le specie) e DNA di ruminante derivato da PAT di ruminante (NON autorizzato nell'alimentazione degli animali da reddito ) I non ruminanti non sono suscettibili alle TSE....MA La produzione di elevati volumi di mangime di non ruminante contenenti PAT rappresenta un rischio poichèle cross contaminazioni tra mangimi per non ruminanti e mangimi per ruminanti non possono essere escluse.

14 Ru et al.

15 Le farine di insetto costituiscono una buona alternativa 8 Ottobre 2015 Parere EFSA sui rischi microbiologici e chimici in seguito alla produzione e al consumo di insetti in alimenti ad uso umano e zootecnico. TSE W.G. Meeting in Bruxelles 26 Settembre 2016: presentazione del Document SANTE/10539/2016 Rev1 Le farine di insetto saranno da considerarsi Proteine Animali Trasformate (PAT)

16 MOLTI PROGETTI EUROPEI DEGLI ULTIMI 5 ANNI: ECODIPTERA Università di Alicante SUPRO2 WageningenUR BIOCONVAL Technical University of Denmark DESIRABLE Ynsect PROTEINSECT FERA UK PROINSECTLIFE Università degli Studi di Torino PIAS Università degli Studi di Torino, 2013 CHITINSECT VITO INDIFI Università degli Studi di Napoli Federico II INBIOPROFEED Università dell Insubria

17 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta PROGETTO EDIBLE INSECTS NUTRIRE IL PIANETA CON NUOVE FONTI SOSTENIBILI AREE TEMATICHE 1 Nutrire Il Pianeta In Modo Sostenibile 2 Allevamento Di Insetti Commestibili: Ricerca, Opportunitàe Cautele 3 Aspetti Alimentari e Nutrizionali 4 Legislazione e Valutazione Del Rischio 5 Comunicazione e Informazione

18 CONCLUSIONI... mercato simile alla farina di pesce e di soia Notevoli risparmi di energia e di terra e diminuzione della dipendenza dai mercati non europei Ridotti tempi di crescita ed elevata efficienza di conversionedegli alimenti in proteine animali minor impatto sull agroecosistema Per Giovani Imprese e Start Up una concreta possibilitàdi produrre in modo sostenibile

19 Sicurezza dei mangimi Contaminanti : metalli pesanti, micotossine, pesticidi, additivi, ecc Bioaccumulano alcuni contaminanti Non esprimono la proteina prionica Trasmissione del prione solo dal substrato contaminato (Corona etal.2006)

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23 Prossime modifiche legislative 1. Utilizzo solo di proteine processate 2. Lista positiva di specie di insetto consentite (6 specie al momento) (controllo di etichetta e tracciabilità per evitare frodi)

24 For an easier reading, the amendments to Annex IV to Regulation (EC) No 999/2001 envisaged in the draft text SANTE/10539/2016 Rev 7 are presented below in a consolidated version of Annex IV to Regulation (EC) No 999/2001. ANNEX IV ANIMAL FEEDING CHAPTER I Extensions of the prohibition provided for in Article 7(1) IN DISCUSSIONE

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26 Nota Ministeriale n Del Allevamento ed uso degli insetti per la produzione di mangimi

27 - Insetti come materie prime nei mangimi: Regolamento (UE) 68/2013 (invertebrati terrestri in tutti gli stadi di vita, freschi, congelati, essiccati) - PAT di insetto: definite dal Reg.(UE) 142/2011, Allegato I punto 5 - «proteine animali trasformate»: proteine animali ottenute interamente da materiali di categoria 3 e trattate, conformemente all'allegato X, capo II, sezione 1, del presente regolamento (incluse le farine di sangue e di pesce), in modo da renderle adatte all'utilizzazione diretta come materie prime per mangimi o a qualsiasi altra utilizzazione negli alimenti per animali, compresi quelli per animali da compagnia, o all'utilizzazione in fertilizzanti organici o ammendanti; tuttavia non comprendono i prodotti sanguigni, il latte, i prodotti a base di latte, i prodotti derivati dal latte, il colostro, i prodotti a base di colostro, i fanghi di centrifugazione o di separazione, la gelatina, le proteine idrolizzate e il fosfato bicalcico, le uova e i prodotti a base di uova, il fosfato tricalcicoe il collagene

28 - Insetti come materie prime nei mangimi: Regolamento (UE) 68/2013 (invertebrati terrestri in tutti gli stadi di vita, freschi, congelati, essiccati) - PAT di insetto: definite dal Reg.(UE) 142/2011, Allegato I punto 5 - «proteine animali trasformate»: proteine animali ottenute interamente da materiali di categoria 3 e trattate, conformemente all'allegato X, capo II, sezione 1, del presente regolamento (incluse le farine di sangue e di pesce), in modo da renderle adatte all'utilizzazione diretta come materie prime per mangimi o a qualsiasi altra utilizzazione negli alimenti per animali, compresi quelli per animali da compagnia, o all'utilizzazione in fertilizzanti organici o ammendanti - Categoria 3 : definita in Reg.1069/2009 art. 10 lettera l: invertebrati acquatici e terrestri, diversi dalle specie patogene per l uomo o per gli animali

29 - Insetti come materie prime nei mangimi: Requisiti Reg.(UE) 142/2011, Allegato X, Capo II, Sezione I Prescrizioni specifiche applicabili alle proteine animali trasformate (materie prime, metodi di trasformazione, immagazzinaggio) - No specie patogene - No vettori patogeni per uomo, animali o piante - Rispetto criteri ambientali e salvaguardia specie autoctone Rispetto criteri microbiologici e chimici previsti per materie prime per mangimi (Pacchetto Igiene; Direttiva 2002/32/CE)

30 Gli insetti sono animali da allevamento: -Si applica il feedban(no SOA di ruminante, no PAT, tranne farine di pesce, no prodotti a base di sangue) -No utilizzo di rifiuti come substrato (liquami, rifiuti domestici, rifiuti urbani, rifiuti di cucina e ristorazione) Ex alimenti : Reg.(UE) 142/2011 Allegato X, Capo II, Parte III, sezione 10: prodotti OA, o prodotti contenenti OA non piùdestinati al consumo umano per motivi commerciali o per problemi di fabbricazione o difetti di condizionamento o altri difetti che non presentano rischi per lasalute pubblica o animale, possono essere immessi sul mercato come alimenti per animali d'allevamento, purché: a) il materiale non sia costituito da e non sia stato a contatto con materiali di origine animale non trasformati b) b) siano state prese tutte le precauzioni per impedire la contaminazione del materiale

31 - Al momento: Le PAT di insettosono utilizzabili SOLO per le specie in cui non è applicato il feedban(pet, animali ornamentali, animali da pelliccia, animali da laboratorio, zoo) Gli insetti vivi non sono PAT e non sono SOA Utilizzabili per animali differenti da quelli ad uso zootecnico

32 Occorreinoltremodificarel allegatoiv del Reg. 999/2001, perchèal momentoi SOA per produzione di PAT possono essere raccolti solo neimacellie neilaboratoridi sezionamento

33 Hermetia illucens (black soldier fly, mosca soldato) Tenebrio molitor (mealworm, verme della farina) Alphitobius diaperinus (lesser mealworm, tenebrione) Acheta domesticus (house cricket, grillo domestico) Gryllodes sigillatus (banded cricket, grillo sigillatus) Gryllus assimilis (field cricket, grillo silente)

34 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta IZS PLV-UNITO-InRIM Utilizzo degli insetti come fonte proteica sostenibile nei mangimi: uno studio di fattibilità Ricerca corrente IZSPLV 08/13 RC

35 Partners: IZSPLV (Daniela Marchis) UNITO (Laura Gasco) InRIM(Andrea Mario Rossi)

36 Utilizzo degli insetti come fonte proteica sostenibile nei mangimi: uno studio di fattibilità Terminata il 30 settembre Determinazione e quantificazione di Pbin larve di T.molitorallevate su substrati contaminati, con valutazione del potenziale bioaccumulo 2. Studio di metodiche per l identificazione degli insetti nei mangimi

37 Bioaccumulation of heavy metals in insects: preliminary data Amato G.,Ceppa L., GiovanniniT., Rizzi M., Squadrone S., Abete M.C., GascoL., MeneguzM., MarchisD. Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta, Via Bologna, Torino, Italy University of Turin, Department of Agriculture, Forestry and Food ( DISAFA ) Grugliasco, Italy

38 MATERIALI & METODI Tenebrio Molitor larve (10 giorni) Substrato Crusca di grano 25 larve per gruppo 4 Gruppi allevati su substrato contaminato 6 mg/kg (ppm) Pb (limite di legge 10 mg/kg) 2 Gruppi di controllo (allevati su substrato non contaminato) Tutti i gruppi sono stati analizzati in AAS per la ricerca dei metalli pesanti (Pb, Be, Al, Co, Cd, Hg, Sn, Sb, Tl).

39 MATERIALI & METODI Tenebrio Molitor larve (10 giorni) Gruppo A: larve raccolte a larve raccolte a metà ciclo larvale (20 giorni) Gruppo B: larve tenute sul substrato contaminato fino a metà ciclo larvale, poi su substrato non contaminato per 6 giorni Gruppo C: larve allevate sul substrato contaminato fino a metà ciclo larvale, poi su substrato non contaminato fino a fine ciclo larvale (~40 giorni) Gruppo D: larve tenute sul substrato contaminato fino a fine ciclo larvale Gruppo E: gruppo di controllo. Larve allevate su substrato non contaminato e raccolte a metà ciclo larvale. Gruppo F: gruppo di controllo. Larve allevate su substrato non contaminato e raccolte a fine ciclo larvale.

40 RISULTATI & DISCUSSIONE Substrato Crusca di grano: Al elevato (170 ppm) Cd a basso dosaggio (0.43 ppm), Pb assente. Larve: Al (1.7 ppm) e una quantità molto bassa di Cd (0.053 ppm) rilevati in tutti e 6 i gruppi, dovuto alla contaminazione naturale del substrato Pb rilevato in tutti i gruppi di larve allevate su substrato contaminato (Gruppo A=0.48 ppm, Gruppo B=0.030 ppm, Gruppo C=0.028 ppm, Gruppo D=0.35 ppm). 6 giorni di decontaminazione sembrano essere sufficienti per determinare una diminuzione del bioaccumulo di Pb: valori di Pb in gruppo C e gruppo D non sono significativamente differenti Pb non rilevabile nei gruppi di controllo. Nel Gruppo D è stata rilevata una contaminazione da Pb inferiore al Gruppo A, sebbene fosse stato allevato solo su substrato contaminato per 40 giorni Le larve adulte sembrano accumulare meno i metalli rispetto alle larve giovani, come accade nei molluschi

41 2. Studio di metodiche per l identificazione degli insetti nei mangimi Quali metodiche? Microscopia ottica PCR DNA Spettrometria di massa Spettroscopia

42 MICROSCOPIA OTTICA

43 Potenziali difficoltà Interferenza con pesci e animali terrestri? Diversità di morfologia di insetti appartenenti ad ordini diversi e con fisiologia differente? Metamorfosi? Il metodo ufficiale in microscopia ottica è idoneo? Test su farine di insetto industriali? LOD nei mangimi?

44 Insetti (fonte : Wikipedia) [ ] sono una classe di animali appartenenti al grande phylum degli Arthropoda. Questa classe rappresenta il più grande tra i raggruppamenti di animali che popolano la Terra, annoverando oltre un milione di specie, pari ai cinque sesti dell'intero regno animale. Niente frammenti ossei.. Nessuna confusione! No sedimento..no concentrazione!

45 Insetti Esoscheletro Altamente organizzato facile da riconoscere ( Non sempre.. (Source : Hackman, 1971)

46 Insetti Metamorfosi Tenebrio e Hermetia sono specie olometaboliche.. La cuticola è poco differenziata (Source : D.F. Erezyilmaz, 2006)

47 Insetti Microscopia ottica per PAT di insetto: 1. Realistico concentrazione, 3 tipo di materiale, LOD Protocollo ad hoc (revisione del Reg. 51/2013) 2. Mix di diverse tecniche microscopiche 3. Colorazione specifica per il tegumento? Es. chlorazol black

48 Tenebrio molitor Hermetia illucens. Sviluppo di una metodica Real Time -PCR per la determinazione di T. molitor nei mangimi. Caratterizzazione delle farine di insetto attraverso la microscopia ottica, SEM, e spettroscopia Ramane NIR

49 Tenebrio molitor& Hermetia illucens larvae Microscopia ottica A fresco Istologia: H & E, Gomori Microscopia confocale Scanning Electron Microscopy(SEM) Spettroscopia Raman Spettroscopia NearInfraredRadiation(NIR)

50 Tenebrio molitor larvae Microscopia ottica a fresco Tegumento

51 Tenebrio molitor larvae Microscopia ottica a fresco Tegumento

52 Hermetia illucens larvae Microscopia ottica a fresco Tegumento

53 Tenebrio molitor larvae Microscopia ottica a fresco Trachee e spiracoli

54 Hermetia illucens larvae Microscopia ottica a fresco Trachee e tracheole

55 Tenebrio molitor larvae Microscopia ottica a fresco Tracheole

56 Tenebrio molitor larvae Microscopia a contrasto interferenziale (DIC)

57 Tenebrio molitor larvae Microscopia ottica a fresco fibre muscolari

58 Tenebrio molitor larvae Fissativo: formalina Processazione: 24h Colorazione: H&E -Identificazione del tessuto muscolare - Introflessioni tegumento - Mucosa del canale intestinale

59 Hermetia Illucens A B Confronto fra le due colorazioni istologiche (HE in A e tricromica di Gomoriin B)

60 Hermetia Illucens Porzioni dell albero tracheale (indicate da frecce) Colorazione Tricromica.

61 A B Confronto fra fibre muscolari di Krill(A) e di insetto Hermetia Illucens(B).

62 Tenebrio molitor larvae Microscopia confocale Introflessione del tegumento

63 Tenebrio molitor larvae SEM Struttura esterna

64 Tenebrio molitor larvae SEM Sezione longitudinale

65 Tenebrio molitor larvae SEM Sezione trasversale

66 Tenebrio molitor larvae SEM Sezione trasversale

67 Acheta domesticus larvae SEM Sezione trasversale

68 Acheta domesticus larvae SEM Sezione trasversale

69 Acheta domesticus larvae SEM Sezione trasversale

70 Problematiche Utilizzo di metodi molecolari per determinare le specie di insetto usate nelle formulazioni mangimistiche Svariate migliaia di specie di insetti differenti difficoltà notevole nel trovare sequenze genetiche comuni a tutte queste specie Per molte specie, alcune delle quali di interesse mangimistico, la disponibilità di sequenze disponibili su database pubblici è molto scarsa (esempio H. illucens) Il genoma degli insetti molto ricco di A-T difficoltà ulteriore a disegnare primer/probe idonei La disponibilità di DNA certificato da così tante diverse specie di insetti è scarsa

71 Utilizzo di metodi molecolari per determinare le specie di insetto usate nelle formulazioni mangimistiche Tra gli obbiettivi del progetto: Disegno e studio di vari saggi Real Time PCR per specie di insetto utilizzabili come fonte proteica nei mangimi - 3 Specie considerate (Tenebrio molitor, Hermetia illucens, Bombyx mori) - Ricerca di target nucleari ad alto numero di copie/genoma - Contemplare anche l utilizzo di sonde Taqman MGB per ridurre le dimensioni degli ampliconi e semplificare il disegno del saggio

72 Utilizzo di metodi molecolari per determinare le specie di insetto usate nelle formulazioni mangimistiche Esempi di Target Universali gene codificante il 18S rrna DNA mitocondriale 2 classici geni multicopia:

73 Utilizzo di metodi molecolari per determinare le specie di insetto usate nelle formulazioni mangimistiche -Disegno in-silico di un test Real-TimePCR per la determinazione di DNA T.molitornei mangimi e negli ingredienti per mangimi (Software Bioedit ) -Il genomadi T.molitorèpoco annotato in bibliografia -L'allineamento delle sequenze di T.molitor versustarget omologhi per altre specie (crostacei, pesci, ruminanti, pollame, suini) ha permesso una prima validazionein silico per la specificità. -Due saggi validati, entrambi contro target nucleari

74 Utilizzo di metodi molecolari per determinare le specie di insetto usate nelle formulazioni mangimistiche - Estrazione DNA T. Molitor e DNA di altre specie per studi di specificità Kit Wizard for Food (Promega), modificato secondo SOP EURL - AP (Versione 1.1, 2014)

75 Utilizzo di metodi molecolari per determinare le specie di insetto usate nelle formulazioni mangimistiche -Amplificazione T.MolitorDNA (StepOne TM Real-TimePCR System) Tenebrio molitor Satellite DNA - Lo studio prosegue in collaborazione con EURL AP

76 Raman Spettroscopia su farine di insetto e di krill (VibrationalSpectroscopiccharacterisation) Tenebrio molitor, Bombyx mori, Acheta domesticus vs Krill NXR FT-Raman Nicolet(Thermo Fischer Sientific), laser 1064 nm, risolution 8 cm-1, 128 scan. Ramanspectra statisticalanalysis software TQ AnalystTM8.0. Tenebrio Baco Grillo Krill

77 Spettri Ramandi Insetto Identificazione dei gruppi funzionali

78 Spettri Raman: Tenebrio molitor, Bombyx mori, Acheta domesticus and Krill TF-Ramanspectra(meanvalues)

79 Raman Spectra score plot analysis Tenebrio molitor, Bombyx mori, Acheta domesticus vs Krill Raman spectroscopy Test set validation of DA model 7.6 % misclassified during cross validation 24.2 % misclassified during test set validation Species Sensitivity Selectivity Raman Raman Tenebrio 100 % 83 % Bombyx 100 % 57 % Acheta 64 % 100 % Scores plot Krill 30 % 86 %

80 Spettri NIR (Near Infrared spectroscopy) : Tenebrio molitor, Bombyx mori, Acheta domesticus and Krill Lo spettro di Krill potrebbe essere confuso con quello di insetto se non si considerasse la calibrazione con la farina di pesce Infatti la maggior somiglianza è con lo spettro della farina di pesce NIR spectra(mean values) krill vs DA Model Assigned class Distance to assigned class Feed-insect Insect 2 Tenebrio-Acheta-Bombyx Bombyx 2 Feed-fish-bovine Fish 1 NIR spectroscopy

81 Near Infrared spectroscopy analysis: Tenebrio molitor, Bombyx mori, Acheta domesticus NIR spectroscopy Species Sensitivity Selectivity Tenebrio 91 % 100 % Bombyx 100 % 89 % Acheta 97 % 100 % Scores plot 0.02% misclassified during cross validation 4 % misclassified during test set validation

82 Research group: IZSPLV Daniela Marchis Cristiano Corona Silvia Grifoni Luciano Ceppa Giusi Amato Stefania Squadrone Marco Rizzi Tiziana Giovannini Alessandro Benedetto UNITO Laura Gasco Ivo Zoccarato Carola Lussiana Manuela Renna Achille Schiavone Marco Meneguz ISPA-CNR: Francesco Gai InRIM Andrea Mario Rossi Luisa Mandrile Andrea Giovannozzi Chiara Portesi

83 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta Work in progress... Grazie per l'attenzione