La validazione dei metodi microbiologici : aspetti applicativi, controllo del processo analitico e valutazione dell operatore.

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1 Validazione dei metodi e incertezza di misura nei laboratori di prova addetti al controllo di alimenti e bevande La validazione dei metodi microbiologici : aspetti applicativi, controllo del processo analitico e valutazione dell operatore. Lido Ballati ARPAT Agenzia regionale per la protezione ambientale della Toscana Direzione generale- Articolazione funzionale sistema qualità Via Nicola Porpora n FIRENZE Tel Fax E. mail : 1 / 8

2 1- Il processo analitico microbiologico ARPA Emilia Romagna ARPA Marche 1.1 La effettuazione di prove microbiologiche, intese come ricerca e quantificazione di entità microbiche ( batteri e miceti), rappresenta uno dei pilastri del controllo di qualità e/o della sicurezza igienico-sanitaria che interessano una ampia gamma di attività, quali ad esempio : la produzione, la commercializzazione ed il controllo igienico- sanitario di alimenti ( di origine animale e/o vegetale) e bevande; la produzione ; la commercializzazione ed il controllo di farmaci e cosmetici; la produzione, la commercializzazione ed il controllo di mangimi per animali;il controllo ed il monitoraggio di matrici ambientali ( acqua, suolo, aria); il controllo della potabilità dell acqua e il monitoraggio delle reti di distribuzione ; la ricerca e la diagnosi clinico-medica; la valutazione dell attività di sostanze utilizzate come batteriostatiche o battericide nella produzione di disinfettanti o antisettici usati in campo alimentare, industriale, domestico ecc. I metodi di prova microbiologici vitali, siano essi qualitativi ( presenza /assenza),che quantitativi (enumerazione) rappresentano una componente fondamentale del processo analitico (vedi fig.1). e a alla base utilizzano la capacità naturale dei microrganismi ricercati di riprodursi, in determinate condizioni ambientali e su idonei supporti (terreni colturali), in modo esponenziale ( scissione binaria) 1 allo scopo di renderli visibili ai nostri occhi e quindi poterli quantificare come UF ( unità formanti colonie) o come MPN (must probabile number -numero più probabile NPP). Nella figura n.1 è schematizzato un generico processo analitico ed ipotizzato un sistema di controllo, regolazione e possibile miglioramento di tale processo. Figura n.1 1 La scissione binaria è il processo vitale che consente ai batteri quindi incrementano il loro numero in progressione geometrica. La progressione geometrica è riferita alla popolazione del batterio duplicato, ad un determinato intervallo temporale ( tempo di generazione), come risultato della divisione binaria. In condizioni ottimali, la maggior parte dei batteri presenti in un substrato ha un tempo di generazione molto breve, ed è stimato sia compreso tra i 0-60 minuti. La formula N = n N ( N = numero batteri al tempo t-iesimo ; N = numero batteri al t 0 t o tempo zero; n=numero di replicazioni nell intervallo di tempo considerato), consente di stimare il possibile livello di concentrazione batterica raggiunto in condizioni ideali a partire dal livello ipotizzato al tempo zero. / 8

3 La rappresenzazione d insieme consente di evidenziare almeno n.4 punti critici del processo analitico ai quali prestare sempre attenzione, ed in particolare se il Laboratorio intende conformare il proprio sistema di gestione ai requisiti della norma UNI EI EN ISO/IE 1705:000 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e di taratura e conseguire l accreditamento delle prove effettuate. Sintetizzando possiamo dire che : 1) se il processo analitico messo in atto dal Laboratorio non è tenuto adeguatamente sotto controllo, ovvero non si raccolgono e gestiscono in modo corretto le informazioni ( dati output di processo ) è come eliminare dal processo i sensori, quindi di fatto non sappiamo cosa accade ; ) se il Laboratorio non organizza e definisce opportuni ed appropriati indicatori di riferimento con i quali confrontare le misure effettuate ( es. carte di controllo ecc.) e come eliminare dal processo i comparatori. In pratica le misure fatte non possono essere utilizzate né ai fini del controllo interno del processo analitico e né forniscono adeguate garanzia al cliente sulla qualità del dato prodotto; 3) se il responsabile/ i responsabili ( leadership) del Laboratorio non svolge/svolgono la loro funzione in modo efficace, ovvero non vengono prese decisioni sulla base di dati oggettivi e dei confronti effettuati è come eliminare dal processo i decisori e quindi di fatto viene a mancare il motore di regolazione del processo analitico; 4) se i problemi reali ( non conformità ) e quelli potenziali ( azioni preventive) che si presentano in Laboratorio non vengono affrontati e risolti ( azioni correttive), ovvero non si traducono in indicazioni operative per il personale che esegue l attività di prova e, ove necessario, in fornitura di risorse adeguate,significa togliere dal processo gli attuatori e quindi di fatto viene vanificata la possibilità di riportare il processo analitico sotto controllo o di migliorarlo Le attività di prova microbiologiche, al pari di altre prove biologiche, rapportandosi alla natura vivente, sono soggette a varie fonti di influenza : interne ovvero attribuibili al sistema vitale di sviluppo e crescita del /dei microrganismo/i realizzato in laboratorio, su un substrato artificiale, approssimabile a quello naturale, e al modello statistico preso a riferimento per stimare la dispersione possibile ed accettabile delle particelle microbiche nel campione sottoposto a prova; esterne dovute ad esempio all ambiente di laboratorio, alle attrezzature e materiali, alla tecnica di prova, al personale ecc. che, singolarmente considerate o in modo sinergico o antagonista tra di loro, concorrono alla variabilità complessiva di un risultato sperimentale. Una variabilità complessa e dinamica che : da un lato preclude la possibilità di associare, alle prove microbiologiche, un incertezza di misura calcolata sulla base di un approccio statistico rigorosamente metrologico; dall altro impone comunque che le diverse fonti di variabilità siano identificate, sia dimostrato che sono tenute sotto controllo e che sia valutato il loro contributo alla variabilità ( incertezza) complessiva. Per rappresentare la complessità del processo analitico microbiologico e fotografarne le possibili componenti ( fattori) di variabilità coinvolti e le loro interazioni è stato predisposto (vedi fig.) un diagramma causa - effetto, sulla base di quanto proposto da Ishikawa, comunemente noto come diagramma a lisca di pesce. 3 / 8

4 Tutte le componenti, ove possibile, devono essere tenute sotto controllo, con modalità definite dal laboratorio, e deve essere valutato il livello del loro contributo all incertezza generale del risultato di prova, rispetto al livello di probabilità ritenuto accettabile. Figura n Nell organizzazione delle attività di prova è opportuno e necessario che il Laboratorio consideri ed attui anche un appropriato controllo statistico del processo analitico in modo da corrispondere ai requisiti della norma internazionale UNI EN ISO/IE 1705 (p.to e 5.9 ). La diffusione di personal computer e la disponibilità di programmi informatici, consentono oggi di pianificare e praticare il controllo statistico alle attività di prova, superando anche quella diffidenza culturale nei confronti della statistica che per molti tempo è stata originata anche dalle difficoltà di applicazione di formule matematiche spesso complesse. Dello strumento statistico occorre conoscere e comprendere le potenzialità e valutarne, in modo puntuale e critico, la applicabilità alla realtà analitica, ma per fare questo non occorre necessariamente essere in possesso delle conoscenze statico-matematiche che sono richieste ad uno statistico di professione! Infatti come affermato da Willian John Youden 3 : Anche la norma UNI EI EN :1990, p.to si confrontava con il controllo statistico dei dati analitici specificando che : il laboratorio deve utilizzare metodi di prova e procedure adatti allo scopo delle prove fornendo, quando opportuno, una stima dell incertezza di misura calcolata mediante l uso di tecniche statistiche appropriate. 3 Dalla prefazione alla pubblicazione Statistical Methods for hemists di Willian John Youden (1951). 4 / 8

5 Molte tecniche statistiche non richiedono dimostrazione per essere accettate dallo sperimentatore, perché questi sente istintivamente che le esatte formulazioni dello statistico concordano con la sua esperienza : la sua fiducia nella potenzialità della statistica poggia su questo accordo piuttosto che sulle dimostrazioni matematiche. Si afferma spesso che le tecniche statistiche vengono usate erroneamente se chi le usa manca di una solida base teorica. E, d altra parte, è anche possibile che il matematico si smarrisca se le sue conoscenze scientifiche sono inadeguate: le applicazioni saranno erronee. onsiderazioni analoghe a quelle di Yuden, sono state inserite, 50 anni dopo, nella norma europea, UNI EI ENV : 000 Guida all espressione dell incertezza di misura, p.to 3.4.8, della quale le elaborazioni statistico -matematiche costituiscono il fondamento : Benché questa guida fornisca uno schema generale per valutare l incertezza, essa non può sostituirsi al pensiero critico, all onestà intellettuale ed alla capacità professionale. La valutazione dell incertezza non è né un compito di routine né un esercizio puramente matematico, ma dipende dalla conoscenza approfondita della natura del misurando e della misurazione. La qualità e l utilità dell incertezza attribuita al risultato di una misurazione dipendono pertanto, in definitiva, dall approfondimento, dall analisi critica e dall integrità morale di chi contribuisce ad assegnarne il valore. - Validazione dei metodi di prova microbiologici.1 La norma UNI EI EN ISO / IE 1705 :000, p.to 5.4 Metodi di prova e di taratura validazione dei metodi richiede al laboratorio deve utilizzare metodi di prova inclusi i metodi di campionamento, che soddisfino le esigenze del cliente e che siano appropriati per le prove da eseguire. Specifica inoltre che si devono utilizzare preferibilmente metodi normalizzati, ovvero pubblicati : nelle norme internazionali (ISO), nelle norme europee (EN), nelle norme nazionali (UNI), metodi pubblicati da enti riconosciuti. I metodi interni ( p.to 5.4.), metodi non normalizzati, sviluppati dal laboratorio possono essere utilizzati se sono appropriati all uso e se sono validati. La validazione di metodo è un processo pianificato e eseguito praticamente per accertare che una metodologia analitica sia ad esempio sensibile, specifica, riproducibile e robusta in relazione al tipo di determinazione/i che con un determinato metodo si intendono effettuare. La validazione di un metodo microbiologico è tale se : 1) fornisce la prova documentata che il metodo è adatto per lo scopo e il campo di applicazione ad esempio per : - rivelare la presenza /assenza ( metodo qualitativo) o - quantificare ( metodo quantitativo) il numero delle colonie di uno specifico microrganismo o gruppi di microrganismi in una determinata matrice ; 5 / 8

6 ) assicura l affidabilità durante l'uso normale, ovvero che il metodo è adatto allo scopo e assicura anche che, nell applicazione routinaria di laboratorio, le caratteristiche del metodo sono tenute sotto controllo e mantenute entro limiti specificati. La validazione di un metodo microbiologico in ragione agli obiettivi a cui intende corrispondere può essere classificata in : a) validazione primaria, b) validazione secondaria. a) Validazione primaria La validazione primaria ( definita anche convalida) è un processo sperimentale di tipo esplorativo il cui scopo è stabilire i limiti operativi e le prestazioni (performance) caratteristiche di: - un nuovo metodo; - un metodo modificato o anche di un metodo insufficientemente caratterizzato. I risultati numerici della sperimentazione, le modifiche apportate alla procedura di prova ( esempio variazioni di terreni colturali, tempi e modalità di incubazione...) e quant altro può influenzare le prestazioni del metodo devono essere descritti e dettagliati in modo non ambiguo in un apposito documento al termine della validazione. Nel caso di metodi che prevedono la ricerca e conteggio totale di microrganismi la validazione primaria è generalmente effettuata per confronto con altri metodi normalizzati in uso o per confronto con una precisione teorica predefinita in ragione allo scopo e al campo di applicazione previsto per quel metodo metodo. Un laboratorio che sviluppa internamente un metodo ( metodo interno) o modifica un metodo normalizzato esistente dovrebbe validare il metodo seguendo gli stessi passaggi previsti nella validazione primaria. E di fondamentale importanza che il personale tecnico coinvolto nella validazione primaria abbia maturato una adeguata e documentata esperienza con altri metodi microbiologici. b) Validazione secondaria La validazione secondaria ( definita anche verifica) si realizza quando in un laboratorio si utilizza un metodo sviluppato e validato ( validazione primaria) da altri. La validazione secondaria consiste nel dare evidenza che il laboratorio applicando un metodo validato è capace di corrispondere alle specifiche stabilite nella validazione primaria. La validazione secondaria in genere selezione e usa semplificandole le procedure utilizzate nella validazione primaria ma valutandone le prestazioni del metodo a lungo termine ( es, predisponendo apposite carte di controllo). Al momento molti metodi normalizzati microbiologici non riportano tutte le specifiche richieste dalla validazione primaria ( esempio dati di riproducibilità). In questo caso la partecipazione a circuiti esterni di assicurazione della qualità dove esistono, può essere un primo passo per il completamento della validazione secondaria. ampioni naturalmente contaminati, ove disponibili, rappresentano un materiale di prova ottimale per valutare se il metodo di prova è correttamente applicato e rispetta i limiti definiti nella valutazione primaria. In microbiologia, allo scopo di ridurre il tempo di risposta analitica dei metodi tradizionali, si sono sviluppati e si stanno sviluppando, in particolari settori, i cosiddetti metodi rapidi 4. Anche tali metodi devono essere validati a livello primario e secondario. Nella figura 3 è riportato uno schema di validazione di un metodo microbiologico in ragione della possibile casistica di riferimento. 4 Il confronto con un metodo normalizzato è una pratica molto utilizzata per la validazione di metodi rapidi microbiologici applicabili alla ricerca ed al conteggio di batteri patogeni in particolare quando la ricerca ed il conteggio è complessa e comporta tempi di risposta molto lunghi.in genere i metodi rapidi sono sviluppati dall organizzazione che intende produrli e commercializzarli e sono sottoposti ad approvazione da parte di organizzazioni riconosciute e competenti in materia, tipo ad esempio ANFOR Francia, che ne attesta sperimentalmente e ne certifica la rispondenza allo scopo, in confronto al un metodo normato di riferimento. 6 / 8

7 Figura n.3. Parametri caratteristici di un metodo 7 / 8

8 Di seguito è riportato il confronto tra le la definizioni di alcuni parametri di qualità comuni ai metodi di prova microbiologici ed a quelli di prova chimici. Parametro Sensibilità P = 100 P + FN Metodo microbiologico Probabilità, espressa come percentuale, che un risultato positivo sia effettivamente positivo. P = Risultato positivo FN = Falso negativo Definizione Metodo chimico apacità di discriminare tra piccole differenze nella concentrazione o quantità del misurando. Misurando = Quantità o proprietà sottoposta al processo di misurazione Specificità N = 100 N + FP Probabilità, espressa come percentuale, che un risultato negativo sia effettivamente negativo. N = Risultato negativo FP = Falso positivo apacità di misurare quantitativamente le proprietà chimiche o fisiche o biologiche di un misurando in presenza di potenziali interferenti. Robustezza La robustezza di un metodo rappresenta la capacità del metodo di non essere influenzato significativamente, per effetto di variazioni deliberate introdotte nelle sue fasi di realizzazione. Precisione Esattezza (accuratezza della media) Grado di accordo tra misure indipendenti della stessa variabile analitica. In funzione delle modalità con cui vengono replicate le prove, può essere definita come ripetibilità o come riproducibilità. La riproducibilità è valutata attraverso prove organizzate gestite da circuiti interlaboratorio. Differenza tra il valore medio ottenuto da un sufficiente numero di prove indipendenti ed il valore di riferimento accettato come reale. I materiali di riferimento a valore noto disponibili per le prove microbiologiche non sono ancora molti. Sono disponibili a livello europeo alcuni prodotti e commercializzati dal BR. Incertezza c) Parametro associato al risultato di una misurazione o prova, che caratterizza la dispersione dei dati ragionevolmente attribuibili al misurando ( Norma UNI EI EN V 13005:000 ). b) Stima che caratterizza il campo di valori entro cui giace il valore vero del misurando ( Norma ISO :4993). c) Parametro associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando. ( VIM - Vocabolario Internazionale dei termini fondamentali e generali in metrologia, 1993). Ripetibilità Limite di ripetibilità Parametro entro il quale si deve confrontare la differenza tra dati in doppio ottenuti sullo stesso campione utilizzando lo stesso metodo di prova adottato dal laboratorio. Due prove replicate onteggio su piastra ( range UF/ piastra) p + 1 K 1 kp = 1,96 p =0,95 Due prove replicate Sr = Scarto tipo di ripetibilità definito sperimentalmente dal laboratorio applicando un determinato metodo, su un campione stabile ad un determinato livello di concentrazione. X1 X t Sr t= t di student tabulato per v= n-1 e p=0,95 Nella figura 4 è invece schematizzato il concetto di precisione ed esattezza di un metodo di prova rappresentato come fosse un tiro al bersaglio. 8 / 8

9 Figura n. 4 PREISIONE = Differenza (scarto aleatorio) tra un singolo valore e la media degli n valori ESATTEZZA ( accuratezza della media) = Differenza (scostamento) tra il valore presunto vero ed il valore medio degli n. valori AURATEZZA = Differenza ( scarto) tra il valore presunto vero ed il valore singolo del misurando AURATEZZA = ESATTEZZA ± PREISIONE Scarto = scostamento ± scarto aleatorio L utilizzo di un metodo microbiologico normalizzato validato da un organizzazione riconosciuta, non assicura automaticamente la validità dei risultati. E necessario sempre definire e applicare un controllo di qualità adeguato al tipo di analisi che routinariamente vengono eseguite dal laboratorio, applicando un determinato metodo per poter assicurare la qualità dei risultati. Il controllo qualità del metodo può essere un estensione del processo analitico microbiologico per esempio in prove quantitative operando repliche a livelli differenti di concentrazione microbica o semplicemente effettuando delle valutazioni statistiche (calcoli) utilizzando i dati ottenuti nella normale attività di laboratorio se ad esempio il metodo utilizzato nella routine prevede l effettuazione di repliche. Si possono utilizzare, ove esistenti, materiali di riferimento, campioni di circuiti intercalibrazione, o campioni artificialmente contaminati con ceppi batterici di riferimento. Nella figura n.5 è riportato uno schema a blocchi di sviluppo ed utilizzo routinario di prova le possibili fasi di validazione e monitoraggio nel tempo delle prestazioni. di un metodo 9 / 8

10 Figura n. 5 Le carte di controllo costruite, ad esempio, utilizzando i limiti indicati dal metodo ( validazione primaria) o definiti a seguito di considerazioni teorico-statistiche sono uno degli strumenti principali che possono essere utilizzabili anche in microbiologia Nella figura 6 è riportato un esempio di Kp chart relativa a prove analitiche effettuate di routine in doppio predisposta utilizzando un foglio elettronico in Excel. Figura n Incertezza del risultato analitico microbiologico 10 / 8

11 Incertezza Parametro associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione dei valori ragionevolmente attribuiti al misurando. ( p.to 3.9 VIM Vocabolario Internazionale dei termini fondamentali e generali in metrologia, 1993) Incertezza tipo Incertezza del risultato di una misurazione espressa come scarto tipo. ( UNI EI ENV :000, p.to.3.1) Incertezza tipo composta Incertezza tipo del risultato di una misurazione allorquando il risultato è ottenuto mediante i valori di un certo numero di altre grandezze. Essa è uguale alla radice quadrata positiva di una somma di termini, che sono le varianze o le covarianze di quelle grandezze, pesate secondo la variazione del risultato della misurazione al variare di esse. ( UNI EI ENV13005 :000, pto.3.4). Incertezza estesa Grandezza che definisce, intorno al risultato di una misurazione, un intervallo che ci si aspetta comprendere una frazione rilevante della distribuzione di valori ragionevolmente attribuibili al misurando. ( UNI EI ENV13005 :000, pto.3.5). Per poter associare uno specifico livello di fiducia all intervallo definito dall incertezza estesa è necessario fare ipotesi, esplicite o implicite, sulla distribuzione di probabilità caratterizzata dal risultato della misurazione e dalla sua incertezza tipo composta. Il livello di fiducia che può essere attribuito a questo intervallo può essere conosciuto solo nei limiti entro i quali quelle ipotesi siano giustificate. Fattore di copertura kp E un fattore numerico utilizzato come moltiplicatore dell incertezza tipo composta per ottenere una incertezza estesa. ( UNI EI ENV13005 :000, pto.3.6). I valori del fattore di copertura Kp che genera un intervallo avente fiducia p, nel caso di distribuzione normale è di seguito riportato : Livello p ( %) Fattore di copertura Kp 68, , ,960 95,45 99,576 99, , In ambito microbiologico la valutazione statistica dei risultati scaturiti da prove quantitative, per definire il parametro di incertezza da associare al risultato, deve inevitabilmente tenere conto delle peculiarità tipiche della pratica analitica microbiologica, ovvero dei numerosi fattori di variabilità, che non rendono agevole definire quella incertezza, da associare alla misura (risultato), come normalmente viene intesa ad esempio in ambito metrologico ( prove di taratura strumentale ) o in misurazioni di tipo fisico o chimico. Nella variabilità di una misurazione microbiologica infatti entrano in gioco diversi fattori che possiamo definire come fattori naturali che conferiscono inevitabilmente una certa non ripetibilità di fondo ai risultati di prova. Rappresentano sicuramente una fonte di naturale di variabilità di una analisi microbiologica : l oggetto della ricerca analitica microbiologia che è rappresentato da cellule viventi ( cellule microbiche) naturalmente presenti o contaminanti substrati (matrici) di varia natura. 11 / 8

12 la dispersione non omogenea dei microrganismi nel campione prelevato e sottoposto ad analisi ; l impossibilità pratica di avere, pur partendo da uno stesso campione aliquote di prova assolutamente corrispondenti, per quanto riguarda le cariche microbiche presenti, qualunque sia la loro concentrazione ; l influenza che fattori naturali, di tipo fisico, chimico, biologico, possono direttamente o indirettamente rivestire, nel far si che i microrganismi non siano presenti nel campione in cui si vanno a ricercare, in un condizione ottimale, ovvero si trovino in una condizione stressata o di danneggiamento irreversibile ; la difficoltà, applicando i normali criteri analitici di evidenziare le cellule microbiche irreversibilmente danneggiate, injured cells ; I possibili effetti inibenti sulla crescita delle cellule stressate, eventualmente presenti nel campione di prova,dei terreni di coltura selettivi. Infatti tali terreni infatti facilitano le operazioni analitiche solo nel caso che i microrganismi ricercati siano presenti in condizioni ottimali sotto il profilo strutturale e funzionale. Ai fattori naturali possono aggiungersi altri fattori non naturali, in grado di accrescere ulteriormente l incertezza del risultato, fino a mettere in ragionevole dubbio la validità del risultato stesso quali ad esempio : utilizzo di metodi non appropriati al tipo di ricerca effettuata; non corretta conservazione e manipolazione dei campioni di prova; ambienti di laboratorio ( locali di prova ecc. ) inadeguati ; apparecchiature inadeguate ha fornire le prestazioni richieste; utilizzo di materiali ( terreni colturali, reagenti, reattivi ) che non offrono una sufficiente garanzia di qualità ; inadeguata conservazione di terreni, reagenti e reattivi ; comportamenti non consoni del personale o utilizzo di personale non adeguatamente formato e addestrato ecc. ecc. L effetto di alcuni fonti di variabilità quali ad esempio il volume pipettato (inoculo) oppure la pesata del campione,effettuata per preparare la sospensione, possono essere misurate direttamente e il loro contributo statistico alla variabilità può essere quindi facilmente stimato e valutato. Altri fonti di variabilità collegate ad esempio alla stabilità del campione, preparazione del campione, ecc non possono essere direttamente misurati ed il loro contributo può non essere valutabile in maniera diretta, ma la loro importanza alla variabilità dei risultati dovrebbe essere comunque considerata ( stima conservativa). In microbiologia l incertezza da associare al risultato, nel caso di utilizzo della tecnica di semina su piastra, membrana filtrante o MPN, è generalmente espressa come intervallo di fiducia ad un livello di probabilità del 95 %(p=0,95). Tale intervallo calcolato, con modalità statistiche definite ed esplicitate nel metodo o, in assenza,con modalità definite dal laboratorio deve essere opportunamente documentato e dichiarato. Sicuramente tra le componenti che possono incidere notevolmente, in positivo o in negativo, sulla qualità e garanzia di affidabilità del risultato finale e della relativa incertezza, in ragione al livello di efficienza ed efficacia raggiunto dal laboratorio nella gestione e controllo del suo Sistema Qualità, sono : a) le procedure di prova, ovvero disponibilità di metodi di prova validati (vedi paragrafo ); b) il personale ovvero disponibilità di personale qualificato e abilitato all esecuzione delle prove (vedi paragrafo 4). 1 / 8

13 Valutazione della competenza tecnica del personale 4.1 Nelle prove microbiologiche il fattore umano è sicuramente uno dei principali fattori critici da tenere sotto controllo in quanto fattore trasversale e unificante dell intero processo analitico. L operatore tecnico è infatti l esecutore di diverse ed importanti fasi di prova, quali ad esempio: campionamento, preparazione e manipolazione dei terreni colturali, conservazione, preparazione, diluizione, semina del campione, incubazione, ma è anche lo strumento, maggiormente utilizzato per la ricerca ed il conteggio dei microrganismi. Di fatto l operatore tecnico microbiologico riassume in sé due fasi importanti del processo di prova : quella preparativa e quella strumentale. Il Laboratorio, in relazione al personale al quale è affidato il compito di eseguire le prove deve: fornire evidenza oggettiva della capacità operativa dell analista mediante predisposizione di opportuna documentazione che comprovi l addestramento fornito ; sia garantito nel tempo ( monitorato ) il mantenimento della capacità operativa conseguita. 4. Il calcolo statistico relativo al conteggio su piastra è fondamentalmente basato sulla distribuzione di probabilità di Poisson, ovvero viene applicando ai conteggi UF lo stesso approccio statistico applicato al conteggio di dispersioni di particelle attuato in ambito fisico ( es. fibre di amianto, particelle radioattive ecc).applicando il modello di Poisson la valutazione della ripetibilità può essere effettuata tenendo presente che la varianza è numericamente uguale alla media dei conteggi effettuati ( nel caso di un solo conteggio al conteggio stesso), e che lo scarto tipo essendo la radice quadrata della varianza corrisponde alla radice quadrata della media. Ne consegue anche che lo scarto tipo relativo ( coefficiente di variazione), che corrisponde al rapporto tra scarto tipo e media nel caso della distribuzione di Poisson, è pari all inverso della radice quadrata della media. Nella figura n.7 sono rappresentate la distribuzione di probabilità di Poisson e quella di Gauss (o normale), nonché le formule applicabili alla distribuzione di Poisson. Figura 7 ( normale) In relazione al diametro delle piastre di Petri il range possibile di conteggio, max per piastra di diametro di circa 100 mm,è stabilito indicativamente in 300 UF/piastra. Per piastre di diametro di circa 13 / 8

14 50 mm tale limite è proporzionalmente ridotto come rapporto tra le superfici ( vedi fig. 8). Le valutazioni sono state effettuate considerando come una risoluzione ideale che corrisponde ad una singola particella che occupa una superficie di circa 5 mm. Figura 8 Per conteggi ricadenti nel range UF/mL è considerato possibile ed accettabile assimilare la distribuzione di Poisson alla distribuzione di Gauss (normale) perché questo facilita indubbiamente la valutazione statistica dei conteggi e la definizione del relativo intervallo di fiducia associato. Sotto al valore di 15 UF/mL tale semplificazione statistica non è invece consigliato praticarla. In questo caso si applica esclusivamente la distribuzione di Poisson e quindi, l intervallo di fiducia in ragione delle piastre seminate è ricavato da apposite tabelle che riportano i valori riferibili a tale distribuzione in ragione del livello di probabilità prescelto e del valore (somma) determinato. Quindi per una valutazione ed accettabilità del dato analitico microbiologico (ripetibilità) a seguito di conteggio delle UF /piastra dobbiamo considerare la possibilità di conteggi ricadenti in due possibili campi di misura : 1) conteggi fino a circa 15 UF; 3) conteggi uguali o maggiori di 15 UF fino a circa 300 UF,per piastre di circa mm di diametro. Per valutare la ripetibilità dell operatore devono essere fatte effettuare all operatore almeno due prove in parallelo sullo stesso campione, applicando lo stesso metodo di prova, in un breve intervallo di tempo. In genere è consigliato non superare i minuti come tempo utile per predisporre le piastre e porle in incubazione (condizioni di ripetibilità stretta). 4.3 Accettabilità dei conteggi inferiori a 15 UF /piastra prove in doppio Se le prove effettuate singolarmente sono inferiori a 15 UF / piastra, quindi la somma totale dei due conteggi non supera il numero di 30 UF si calcola il valore dell intervallo di fiducia al livello di probabilità del 95 % ( p=0,95) utilizzando i valori tabellati della distribuzione di Poisson. 14 / 8

15 Per effettuare tale verifica può essere utilizzata la tabella A. allegata alla norma ISO 718 :1996 Microbiology of food and animal feeling stuff. General rules for microbiological examination 5 che è riporta i dati approssimati all unità della distribuzione di Poisson. La tabella è divisa in quattro colonne : la prima riporta la somma totale delle colonie riscontrate nelle due piastre: la seconda la media dei microrganismi ovvero la somma divisa per due approssimata al numero intero. la terza e la quarta l intervallo di fiducia al 95 % espresso rispettivamente come valore numerico e in percentuale, limite minimo e limite massimo dell intervallo, approssimati al numero intero. Se i valori riscontrati e sommati singolarmente rientrano nell intervallo tabulato, ovvero nessuno dei due dati è inferiore al limite minimo o superiore al limite massimo, la ripetibilità dei dati è accettabile in quanto rientra nella dispersione casuale prevista dalla distribuzione di Poisson. Quindi il risultato analitico può essere espresso come la media dei due conteggi al quale è associato l intervallo tabulato. Esempio : Intervallo di fiducia tabulato ( p= 0,95) UF UF Somma Media Limite Limite Risultato Piastra 1 Piastra inferiore superiore Accettabile ritico ( valutare) Il valore 4 è inferiore al limite minimo dell intervallo quindi il criterio di ripetibilità non è rispettato. 4.4 Accettabilità dei conteggi superiore a 15 UF /piastra prove in doppio Se su ciascuna delle due capsule di Petri si conteggiano delle UF superiori a 15. La valutazione del rispetto del limite di ripetibilità viene praticata applicando la seguente formula che tiene conto della approssimazione della distribuzione di Poisson alla distribuzione normale: Dove : 1 e sono i conteggi effettuati sulle due piastre Kp e il valore sperimentale calcolato del fattore di copertura = K p Tale valore deve essere confrontato con quello tabulato riferibile ad una distribuzione normale, che genera un intervallo di fiducia avente il livello di probabilità p ( prescelto) riferibile ad una distribuzione normale. Per le prova microbiologiche, se non diversamente indicato, il livello p di accettabilità è stabilito al 95% ( p= 0,95) al quale corrisponde in questo caso un valore di Kp = 1,96 ( vedi tabella paragrafo 3). In ragione del livello di probabilità prescelto ( 95 %) il risultato può essere compreso all interno di dell intervallo kp<= 1,96 ; compreso nell intervallo 1,96 < Kp <,576 ( p tra il 95 % e il 99 % ) ; oltre Kp >,576 ( p > 99 %). A questi tre livelli sono associati i criteri di valutazione riportati nella sottostante tabella in relazione al valore di Kp calcolato sui dati sperimentali di ripetibilità. 5 La norma ISO 718 :1996 Microbiology of food and animal feeling stuff. General rules for microbiological examination è stata integrata dalla ISO 718:001 - Amendment 1 examination, della quale costituisce parte integrante. Microbiology of food and animal feeling stuff. General rules for microbiological 15 / 8

16 aso Valore calcolato Kp Valutazione del risultato A B Kp < 1,96 1,96 < Kp <,576 Kp >,576 I conteggi sono accettabili ed è possibile esprimere il risultato come media aritmetica delle due prove. La differenza fra i conteggi è considerata critica e quindi occorre valutare la situazione prima di esprimere il risultato come media aritmetica delle due prove. La differenza fra i conteggi è considerata anomala e le prove eseguite non vengono considerate valide. Le prove devono essere ripetute. Nota : I valori 1,96 in genere è approssimato a e il valore,576 è approssimato a,6. Esempio : aso onteggio UF/piastra 1 UF UF Kp Valore sperimentale calcolato Valutazione del risultato Risultato UF/piastra Media m UF Incertezza stimata ( IF) p = 0, ,9 Accettabile , ,13 ritico - valutare Anomalo >1,96 <,576 >,576 La stima dell incertezza (IF) da associare al conteggio medio m (caso 1 -accettabile) per determinare i limiti dell intervallo di confidenza e : 6 8 IF = ± 1, 96 m = ± 1, 96 = ± 11 UF / piastra n dove : m = media aritmetica dei due conteggi ; n = numero di prove replicate. L intervallo di confidenza della prova eseguita ( p=0,95) associato al valore : m per n= è il seguente Limite inferiore : = m 1, 96 m = = 57 UF / piastra n Limite superiore : = m + 1, 96 m = = 79 UF / piastra n Avendo verificato (caso 1) che i risultati che l operatore fornisce, a frequenza stabilita, relativi a prove eseguite in doppio rientrano nel limite di ripetibilità ritenuto accettabile, assumiamo che il comportamento dell operatore sia sotto controllo statistico, e che tale controllo garantisce quindi anche l affidabilità dei risultati di prova che nella routine sono ottenuti eseguendo una singola replica sul campione, perché così è previsto dal metodo o è stato definito dal laboratorio. Nel caso che il conteggio singolo sia inferiore a 15 UF/piastra i limiti dell intervallo di confidenza da associare al risultato di prova si ricavano dalla tabella di Poisson ( p=0,95). 16 / 8

17 La tabella A.1 allegata alla norma ISO 718 :1996 riporta i valori dell intervallo di confidenza per prova singola per conteggi compresi tra 1 e15 UF /piastra. Nel caso di conteggio superiore a 15 UF /piastra la stima dell incertezza da associare al conteggio per determinare i limiti di tale intervallo di fiducia è : IF = ±1, 96 ; ovvero la formula generale indicata per le prove in doppio si semplifica in quanto, trattandosi di una sola prova m = e n= Accettabilità dei conteggi superiore a 15 UF /piastra per prove replicate da un singolo operatore su uno stesso campione ( minimo 5). Nel caso che il numero di prove sia superiore a due per verificare che la dispersione dei dati sperimentali sia conforme alla distribuzione di Poisson si utilizza una valutazione statistica fondata sul calcolo del chi quadrato χ sperimentale che viene confrontato con quello sp del chi quadrato tabulato χ p ; ν=n-1 ad un determinato livello di probabilità p e per ( n- 1) gradi di libertà. Nella tabella sono riportati i valori del genere utilizzati : p=0,95 e p=0,98. χ p ; ν=n-1 per 6 gradi di libertà e per i livelli di probabilità p in p ,95 3,841 5,991 7,815 9,488 11,071 1,59 0,99 6,635 9,10 11,345 13,77 15,086 16,81 L indice di dispersione sperimentale di Poisson è calcolato applicando una delle due formule di seguito riportate Le formule indicate sono equivalenti ; sono riportate entrambe perché in queste due forme sono generalmente indicate nella documentazione scientifica. χ = Indice di dispersione di Poisson (sperimentale) sp a) b) χ χ sp sp = = n n i= 1 i i ( ci c c m Le formule a) e b) sono equivalenti m i ) < = χ = Indice tabulato ( chi - quadrato) χ p= 0,95; ν= n 1 n = numero di piastre inoculate contemporaneamente (repliche) ad un livello di diluizione i = valore del conteggio (UF.) riscontrato nella piastra (iesima) m = conteggio medio delle n. piastre (repliche) inoculate. Effettuando il confronto tra l'indice sperimentale con quello limite tabulato, si possono verificare tre casi : 17 / 8

18 A) χ sperimentale < χ tabulato sp p=0,95; n-1 Risultato : i conteggi sono accettabili ed è possibile esprimere il risultato come media delle n prove replicate. B) χ tabulato < χ sperimentale < χ tabulato p=0,95; n-1 sp p=0,99; n-1 Risultato : la dispersione tra i conteggi deve essere considerata critica e meritevole di approfondimento prima di esprimere il risultato come media delle n prove replicate. E consigliato verificare l eventuale presenza di dati anomali con il test di Huber ( mediana). ) χ sperimentale > χ tabulato sp p=0,99; n-1 Risultato : la dispersione tra i conteggi deve essere considerata eccessiva e le prove replicate pertanto non sono considerate valide. Esempio : Numero : 5 conteggi replicati sullo stesso campione (gradi di libertà = 4 ) aso Piastra n.1 UF Piastra n. UF Piastra n.3 UF Piastra n.4 UF Piastra n.5 UF Media UF χ speriment. alcolato applicando la formula b) χ tabulato p =0,95 v = 4 χ tabulato p =0,99 v = 4 Risultato A ,863 9,488 13,77 Accettabile 7,863 < 9,488 B ,399 9,488 13,77 B ,30 9,488 13,77 ritico 9,488 < 11,399 <13,77 valutare eventuale presenza dati anomali test di Huber ritico 9,488 < 1,30 <13,77 valutare eventuale presenza dati anomali test di Huber ,00 9,488 13,77 Anomalo 15,00 >13,77 ripetere la prova Il caso A è accettabile e quindi possiamo esprimere il risultato come valore medio ( UF / piastra), ovvero associandovi l incertezza calcolata con la formula già utilizzata nell esempio repliche in doppio : m 8 5 IF = ± 1,96 = ± 1,96 ± n 5 8 UF/piastra 18 / 8

19 Il caso è manifestamente anomalo rispetto ai limiti probabilistici definiti, quindi non è possibile esprimere nessun risultato e occorre ripetere la prova. Il caso B1 e B essendo entrambi critici è consigliato procedere alla verifica di anomalia dei dati utilizzando il test di Huber o della mediana per verificare la presenza di un conteggio anomalo. Il test di Huber è uno dei test più efficienti per eliminare i dati anomali. Per la sua applicazione si procede nel seguente modo : 1) Si calcola la mediana( M ) dei conteggi i ordinati in senso crescente. ) Si calcolano le differenze (Di ) tra i singoli conteggi e la mediana ( M ). 3) Si ordinano le differenze(di), in valore assoluto, in senso crescente. 4) Si calcola la mediana (D M ) delle differenze. 5) Si confrontano le differenze Di rispetto a D M applicando la relazione Di <= 4,5 x D M ovvero se ; valore accettabile valore anomalo D D i i 4,5 4, 5 D DM M aso B1 - Applicando il test di Huber alla serie dei dati esemplificati nel caso B1 ( ) è possibile verificare che il criterio di accettabilità è soddisfatto da tutti i conteggi, ovvero nessun conteggio si differenzia in modo netto dagli altri, quindi la prova è da ripetere ponendo maggiore attenzione nella sua esecuzione e non è possibile esprimere nessun risultato. aso B - Applicando il test di Huber alla serie dei dati esemplificati nel caso B ( ) è possibile verificare che il criterio di accettabilità non è soddisfatto per il conteggio 16. Infatti la differenza tra questo conteggio e mediana dei conteggi è Di = 35 e la mediana della differenza conteggi è D M= 7. Il rapporto D D i M 35 = = 5 essendo > 4,5 ( 7 dato anomalo) Questo conteggio si differenzia in modo netto dagli altri, può quindi essere considerato anomalo e quindi eliminato dalla serie dei conteggi. Eliminato il dato si procede ad un ulteriore verifica sui restanti n.4 conteggi confrontando Il risultato della nuova elaborazione è di seguito riportato : Numero : 4 conteggi replicati sullo stesso campione caso B ( gradi di libertà = 3 ) Piastra Piastra Piastra Piastra Media χ χ aso n.1 UF n. UF n.3 UF n.5 UF tabulato p =0,95 v = 3 UF speriment. alcolato applicando la formula b) χ tabulato p =0,99 v = 3 Risultato B on esclusione piastra n ,397 7,815 11,345 Accettabile 1,397 <7,815 Il risultato della verifica del caso B, depurato del dato anomalo, è accettabile e quindi possiamo esprimere il risultato come valore medio con associato il proprio intervallo di fiducia m = ( UF / piastra). 19 / 8

20 4.6 Verifica proporzionalità delle diluizioni ( indice di proporzionalità ) La verifica della proporzionalità della risposta analitica ( conteggi) effettuati rispetto a due o più piastre Petri seminate in parallelo per ogni livello di diluizione può essere praticata sia per la messa a punto di un metodo di prova, sia per valutare la capacità dell operatore all esecuzione corretta di questa fase di prova. La formula statistica applicata ( rif. ISO/TR :000 p.to A è : dove 1,, 3,.n sono i conteggi totali ottenuti sullo stesso campione ai corrispondenti rapporti relativi di diluizione R1,R, R3,.Rn Rn è il livello più basso della serie di diluizioni è posto uguale ad 1. Se ad esempio la serie di diluizioni decimali per tre livelli fosse la seguente : 10-1 ;10 - ; 10-3 i corrispondenti rapporti di diluizione R corrisponderebbero rispettivamente a : R 1 =100,R =10,R 3 =1. = Somma totale di tutti i conteggi e R = Somma totale di tutti i rapporti relativi. Nel caso si volesse, partendo da un campione naturalmente o artificialmente contaminato, ottenere la possibilità di poter effettuare conteggi nel range UF/piastra su oltre livelli è consigliato utilizzare diluizioni 1: ( fattore di diluizione ). Per sei diluizioni successive ottenute da un campione ( 0 ; - ; -3 ; -4 ; -8 ; -16 ; -3 ) i rispettivi rapporti relativi risultano essere rispettivamente : R 1 =3 ; R =16 R 3 = 8 R 4 = 4 R 5 = ; R 6 =1. Il risultato del G n-1 sperimentale calcolato ( che viene indicato anche con il simbolo del χ sp) è confrontato con il valore χ n-1 tabulato. Se rispettata ad un livello di probabilità p=0,95. G χ n 1 tabulato la proporzionalità della diluizione è Nella normale attività analitica di fatto il tipo di diluizione praticata è quella decimale e pertanto applicando il fattore di diluizione 10 ( nel range ) al massimo può essere indagata la proporzionalità delle diluizioni per 3 livelli successivi, solo se una diluizione (max) consente di effettuare una lettura al limite di 300 UF/piastra, la successiva (intermedia) 150 UF/piastra e quello minimo 15 UF/piastra. Nper le analisi microbiologiche su i prodotti alimentari la norma ISO 718 :1996 richiede spe due livelli di diluizione decimale successivi e la semina di due piastre per livello. Utilizzando questo disegno sperimentale nel range UF/piastra è possibile valutare durante l esecuzione della prova stessa la ripetibilità di diluizione dell operatore e la sua precisione (kp) per ciascun livello. Esempio : Livello 1 Kp Risultato Kp <= 1,96 p=0,95 Diluizione ,99 Accettabile 10 - Diluizione ,38 Accettabile 10-3 Risultato G χ n 1 tabulato Accettabile Verifica proporzionalità : G n 1 = G 1 = G1 = 498 ln + 63ln 561ln =, Dalla tabella del χ, per ν= 1 e p=0,95, si ricava che il valore di 3, / 8

21 Essendo il valore del G n 1 calcolato inferiore a quello tabulato i conteggi sono tra di loro congruenti e quindi l operatore ha eseguito correttamente la diluizione indicata dal metodo. Espressione del risultato : Per il calcolo del N di microrganismi presenti in un campione analizzato, come media ponderata N = v ( n + 0,1n ) 1 i d ponendo B = v( n + 0,1n )d 1 N = B i Dove : i somma delle colonie contate su tutte le piastre relative alle due successive diluizioni, almeno una delle quali contiene 15 colonie; V Volume di inoculo su piastra, in ml; n 1 n. di piastre inoculate con la prima diluizione; n n. di piastre inoculate con la seconda diluizione; d fattore di diluizione corrispondente alla prima soluzione analizzata La formula per calcolare l intervallo di fiducia al 95 % (δ) è la seguente : = δ B 1,9 1,96 + ± B B ISO 718 :1996, p.to d δ 1 = B = δ B Limite inferiore 1,9 1,96 + B B 1,9 1, B B Limite superiore 1 d 1 d Utilizzando i dati dell esempio N ( + 0,1 ) 561 = 0,0 = = UF /g (ml) prodotto Esprimendo il risultato con due cifre significative si avrà N =,6 x 10 4 UF/g Per stimare la validità del risultato e poter darne una interpretazione è necessario determinare l intervallo di fiducia (δ) al 95 % che caratterizza la distribuzione statistica dei microrganismi nel campione applicando la formula sopra riportata : 561 δ = +, 1,9, 1, ±, limite inferiore δ L =,4 x 10 4 e limite superiore = 1 = ( 56 ± 1) I limiti di fiducia dell intervallo sono quindi : δ U,8 x 10 4 UF/g. Nel caso che i limiti dell intervallo di fiducia venissero espressi in percentuale intorno al valore N calcolato sono compresi tra 7,9 % e + 8,6 % inclusi. 1 / 8

22 aso conferma dopo identificazione ARPA Emilia Romagna ARPA Marche Nel caso che il metodo di prova utilizzato preveda una conferma un determinato numero (A ) di colonie ( generalmente non meno di 5), prelevate da ciascuna piastra è sottoposto ad identificazione. Dopo identificazione viene calcolato per ogni piastra il numero di microrganismi identificati, (a) usando la seguente formula : b a A =, dove b i è il numero di colonie sicuramente identificate per ciascuna piastra e i è il numero totale di colonie contate precedentemente in ciascuna piastra. La formula per calcolare il N i microrganismi identificati presenti nel campione di prova come media ponderata è analoga a quella del conteggio generale sostituendo con a a ( ) a N = ponendo B = v n1 + 0,1n d = v( n1 + 0,1n ) d B Esempio ; Il conteggio diretto di un prodotto liquido ha dato i seguenti risultati : Livello 1 Kp Risultato Kp <= 1,96 p=0,95 Diluizione ,16 Accettabile Diluizione I risultati a seguito di inoculazioni per la prova di conferma, condotte su ciascuna piastra sono di seguito riportati: Piastra da 66 UF Diluizione 1 Diluizione Piastra Piastra Da 80UF da 4 UF Piastra da 7UF Prelevate Identificate a calcolato N a ( + 0,1 ) =, 10 = = -3 3 v( n1 + 0,1n ) d = UF / ml Il numero di microrganismi trovati nel campione è 5,1 x 10 4 UF/mL La formula per calcolare l intervallo di fiducia al 95 % (δ) per caratterizzazione la dispersione microbica nel a 1,9 1,96 a 1 δ = 113 1,9 1, ± δ = + ± = (5,3 ± 9,47) 10 UF/mL - 3 B B B d,,, 10 campione è la stessa riportata sopra sostituendo con a I limiti di fiducia dell intervallo sono quindi : limite inferiore δ L = 4,3 x 10 4 e limite superiore δ U = 6, x 10 4 UF/mL. Nel caso che i limiti dell intervallo di fiducia venissero espressi in percentuale intorno al valore N calcolato sono compresi tra 16,7 % e + 0,1 % inclusi. / 8

23 4.7 Valutazione ripetibilità del conteggio di un operatore. Nella valutazione dell affidabilità dei un operatore e di quella globale del laboratorio è importante conoscere quale ripetibilità di conteggio che è in grado di ottenere ogni operatore tecnico. All operatore, in ragione del metodo di prova utilizzato, vengono consegnate delle piastre, contenenti il microrganismo da identificare ed enumerare, rese disponibili in laboratorio opportunamente siglate e note al responsabile che ha organizzato la valutazione della ripetibilità del conteggio, ma anonime per l operatore. Ogni prova comporta l effettuazione di due conteggi da parte dell operatore, su una stessa piastra in tempi diversi e in condizioni di anonimato che si rinnovano ad ogni lettura. I risultati sono ricollegati tra loro e gestiti dal responsabile della valutazione che ha operato per renderli anonimi. Per una corretta valutazione statistica dei conteggi dovrebbero essere elaborati i dati ricavati da piastre opportunamente selezionate, contenenti un numero di colonie (UF/piastra) tali da coprire il range operativo del laboratorio. Dovrebbero essere comunque esclusi dall elaborazione statistica i dati ottenuti da : conteggi effettuati su piastre contenenti un numero di colonie eccedenti quantomeno il limite fisico di lettura stabilito considerando la superficie della piastra utilizzata. Ad esempio per piastre di circa 10 cm di diametro il limite è di 300 UF. conteggi effettuati su piastre con numero di colonie inferiori a 15 UF. Per ciascuna prova, è registrato il conteggio effettuato dall operatore, in doppio ed in momenti diversi, sulla stessa piastra e calcolato lo scarto tipo relativo a ciascuna prova ( u& i ) come rapporto tra lo scarto tipo tra i due conteggi ( s i ) e la loro media ( mi ). u & = i s i mi La stima della ripetibilità media di conteggio per ogni operatore ( u& m ) è data da : u& m = n & i u dove : u& i = varianza relativa media calcolata per ogni prova n = numero di prove totali effettuate. La ripetibilità di conteggio intralaboratorio ovvero lo scarto tipo relativo del laboratorio ( u& lab ), è calcolata, dopo aver preliminarmente verificato tramite il test F di Fischer, (rapporto tra varianza relativa media maggiore / varianza relativa minore e confronto tra il fattore F calcolato e quello tabulato ad un livello di probabilità p = 0,95 e tenuto conto dei gradi di libertà, posti al numeratore e al denominatore, calcolati rispetto alle prove effettuate ), che non esiste una differenza significativa tra operatori, in accordo con quanto riportato nella ISO/TR :000, p.to B... Sono indicate due modalità per la stima della ripetibilità di conteggio intralaboratorio definite come : 3 / 8