Manuale Operativo delle Procedure in Microbiologia

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1 AZIENDA OSPEDALIERA - COSENZA PRESIDIO OSPEDALIERO DELL ANNUNZIATA Laboratorio di Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare Direttore : Dr. Cristina Giraldi Manuale Operativo delle Procedure in Microbiologia Redatto Validato Dott. ssa Saveria Dodaro Dott. ssa Cristina Giraldi Dott. ssa Paolina Cavalcanti Dott. ssa Maria Agnese Filia Dott. ssa Daniela Perugini Tecnico Bice Casazzone Tecnico Nadia Elia Tecnico Carmela Gaccione Tecnico Paola Pingitore Revisionato il

2 INDICE pag Coltura su terreno liquido pag Coltura su terreno solido pag Coltura dei tamponi con terreno di trasporto pag Spermiocoltura pag Coprocoltura pag Urinocoltura pag Coltura del bronco aspirato da cannula di aspirazione pag Coltura dell escreato pag Coltura del bronco aspirato e del broncolavaggio pag Coltura dell aspirato esofageo pag Coltura di squame cutanee e raglage ungueali pag Conta e coltura del liquido peritoneale pag Esame chimico fisico del L.C.R. pag Emocoltura pag Inserimento dei campioni pag Ripasso dei flaconi positivi pag Coltura quantitativa e semiquantitativa dei cateteri venosi pag Ricerca di Micoplasma e Ureaplasma pag Immunofluorescenza diretta pag E.L.I.S.A. pag Immunocromatografia pag Agglutinazine al lattice pag Microscopia pag Esame microscopico a fresco pag Esame microscopico con soluzione di Lugol pag Esame microscopico con Bleu di Lattofenolo pag Esame microscopico previa colorazione di Gram pag Esame microscopico previa colorazione di May Grunwald Giemsa pag Esame microscopico previa colorazione di Ziehl-Neelsen pag Esame microscopico previa colorazione con Auramina-Rodamina pag Polymerase Chain Reaction pag Immunoblot pag Identificazione dei microrganismi pag Prove di chemiosensibilità dei microrganismi pag Ricerca micobatteri pag Ricerca Chlamydia pn., Legionella pn., Micoplasma pn. su mater. respiratorio pag. 16 Figure pag. 17 Elenco allegati pag

3 1. Coltura su terreno liquido. - liquido sinoviale; - liquido pleurico; - liquido pericardio; - liquido ascitico; - drenaggio; - ascesso; - pus; - protesi (eccetto i cateteri venosi, trattati nel capitolo 6) Prelevare con una pipetta sterile circa 2 ml del campione ed inocularlo in un tubo di brodo Thioglicollato. In caso di protesi di piccole dimensioni inserire l intero pezzo nel brodo. Eseguire questa operazione in prossimità della fiamma del becco Bunsen per ridurre il rischio di contaminazione Avvitare strettamente il tappo a vite del brodo e miscelare delicatamente per inversione Allentare il tappo a vite ed incubare in termostato a 37 C in aria. N.B. In caso di protesi di grandi dimensioni versare il contenuto di due tubi di brodo Thioglicollato nel contenitore in cui si trova la protesi stessa

4 2. Coltura su terreno solido. La tipologia di piastre da utilizzare, insieme alle modalità di incubazione per i diversi campioni biologici sono indicate nell allegato Coltura dei tamponi con terreno di trasporto. - tampone faringeo; - tampone auricolare; - tampone nasale; - tampone oculare; - aspirato gastrico; - tampone orale; - tampone cutaneo; - tampone anale; - tampone da ferita; - drenaggio; - ascesso; - pus; - secreto uretrale; - secreto vaginale; - secreto prostatico; - secreto balano-prepuziale Strisciare il tampone su una piccola superficie (circa 1 cm 2 ) di ciascuna piastra (figura 1) Con un ansa sterile distribuire uniformemente il materiale depositato col tampone ricoprendo circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso Spermiocoltura Con un ansa sterile prelevare una goccia di sperma e distribuirlo uniformemente ricoprendo circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso

5 2.3. Coprocoltura Intingere un tampone sterile nelle feci (sia liquide che formate), quindi strisciare il tampone su una piccola superficie (circa 1 cm 2 ) di ciascuna piastra (figura 1) Con un ansa sterile distribuire uniformemente il materiale depositato col tampone ricoprendo circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso Urinocoltura Miscelare gentilmente il campione senza farlo venire a contatto con il tappo del contenitore ed evitando la formazione di schiuma Immergere nell urina l estremità di un ansa calibrata da 10 μl (di colore bleu) appena al di sotto della superficie e depositare la goccia al centro della piastra (figura 4) Con la stessa ansa eseguire 2-3 passaggi sulla goccia lungo il diametro della piastra (figura 5) e poi eseguire una strisciata continua lungo tutta la piastra con movimenti perpendicolari al diametro della piastra (figura 6) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso Coltura del broncoaspirato da cannula di aspirazione Dopo aver sterilizzato una forbice mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen, tagliare il tubo (compreso l involucro di carta plastificata che l ricopre) in prossimità di una raccolta di materiale Facendo attenzione a non toccare l involucro esterno, inserire un tampone piccolo (usato per i prelievi uretrali e/o nasali) nella cannula ruotandolo delicatamente così da prelevare il materiale respiratorio Stemperare il materiale prelevato in 1 ml di soluzione fisiologica sterile Aggiungere un egual volume di fluidificante pronto uso (Sputagest) (frigo A) e vortexare Incubare minuti in termostato quindi vortexare Prelevare mcl di campione ed effettuare il citospot Prelevare 1 ml del campione e diluirlo in 9 ml di soluzione fisiologica sterile Di quest ultimo campione diluito prelevare con un ansa sterile da 10 mcl (ansa bleu) o con una pipetta 10 mcl di materiale e depositarlo su tutte le piastre come in figura 1. Distribuire lo stesso con un ansa sterile ricoprendo circa 1/5 della superficie delle piastre (figura 2). Sempre - 4 -

6 con la stessa ansa eseguire delle strisce in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 7) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso Coltura dell escreato Aggiungere al campione un egual volume di fluidificante pronto uso (Sputagest) (frigo A) e vortexare Incubare minuti in termostato quindi vortexare Prelevare mcl di campione ed effettuare il citospot Con un ansa sterile da 10 mcl (ansa bleu) o con una pipetta prelevare 10 mcl di materiale e depositarlo su tutte le piastre come in figura 1. Distribuire lo stesso con un ansa sterile ricoprendo circa 1/5 della superficie delle piastre (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 7) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso Coltura del broncoaspirato e del broncolavaggio Se necessaria la fluidificazione procedere come per l escreato (da a ) Se il campione è già sufficientemente fluido procedere senza fluidificazione (da a ) 2.8. Coltura dell aspirato esofageo Centrifugare il campione a 1500 rpm per 15 minuti Eliminare il surnatante Con un ansa sterile prelevare una goccia di materiale e distribuirlo uniformemente ricoprendo circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso Coltura di squame cutanee e raglage ungueali Depositare le squame prelevate sulle piastre Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso l alto

7 3. Conta e coltura del liquido peritoneale Disinfettare accuratamente la sacca e con una siringa prelevare circa 20 ml di liquido Eseguire la conta dei globuli bianchi in camera di Burker Se la conta è 100/mm 3, inoculare circa 2 ml del campione in un tubo di brodo Thioglicollato. Eseguire questa operazione in prossimità della fiamma del becco Bunsen per ridurre il rischio di contaminazione Avvitare strettamente il tappo a vite del brodo e miscelare delicatamente per inversione Allentare il tappo a vite ed incubare in termostato a 37 C in aria Se la conta è > 100/mm 3, centrifugare 50 ml di liquido a 3000 rpm per 10 minuti Eliminare il surnatante ed eseguire l esame microscopico previa colorazione di Gram Risospendere il sedimento in 10 ml di acqua distillata sterile e agitare vigorosamente al vortex Centrifugare a 3000 rpm per 10 minuti Eliminare il surnatante e risospendere il sedimento con circa 200 μl di acqua distillata sterile Con un ansa sterile prelevare una goccia di materiale e distribuirlo uniformemente ricoprendo circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso

8 4. Esame chimico-fisico del L.C.R Stampare il foglio di lavoro (PDL -> Stampa Microbiologia -> Liquor Ceflorachidiano -> Selezione -> Stampa) ed annotare l aspetto del L.C.R Eseguire la conta dei globuli bianchi in camera di Burker ed annotarle sul PDL Centrifugare a 3000 rpm per 10 minuti Separare il surnatante dal sedimento Utilizzare circa 200 μl di surnatante per il dosaggio del glucosio in Laboratorio Analisi Utilizzare circa 800 μl di surnatante per il dosaggio di IgG e Albumina mediante metodo nefelometrico (per tale procedura si rimanda al manuale del settore di competenza della nefelometria) Se il L.C.R. è limpido e nei limiti di cellularità normale risospendere il sedimento con una piccola quantità di surnatante ed inocularlo in un tubo di brodo. Eseguire questa operazione in prossimità della fiamma del becco Bunsen per ridurre il rischio di contaminazione Avvitare strettamente il tappo a vite del brodo e miscelare delicatamente per inversione Allentare il tappo a vite ed incubare in termostato a 37 C in aria Con un ansa sterile prelevare una goccia di materiale e distribuirlo uniformemente ricoprendo circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso Se il L.C.R. è torbido e con valori anormali di cellule, eseguire sul sedimento l esame microscopico (Gram e May Grumwald Giemsa). Tale procedura è indicata nel capitolo 12 (12.4. e 12.6.) Se necessario eseguire la ricerca di antigeni batterici seguendo la metodica indicata sul Manuale delle urgenze

9 5. Emocoltura Inserimento dei campioni Stampare il foglio di lavoro, numerare i flaconi (numero/giorno) ed applicare il bar-code di ciascun flacone sul foglio di lavoro Aprire gli sportelli dello strumento BACTEC 9240 (prima il destro e poi il sinistro) e utilizzando il lettore di bar-code selezionare la voce Inserimento dei flaconi presente all interno dello sportello Leggere il bar-code del flacone ed inserirlo in corrispondenza del led luminoso che si accende Ripetere la procedura per tutti i flaconi da inserire quindi riporre il lettore di bar-code e chiudere gli sportelli Ripasso dei flaconi postivi Aprire gli sportelli dello strumento BACTEC 9240 (prima il destro e poi il sinistro) e utilizzando il lettore di bar-code selezionare la voce Rimozione dei flaconi positivi presente all interno dello sportello Rimuovere i flaconi corrispondenti ai led rossi e leggere il bar-code di ciascun flacone rimosso Riporre il lettore di bar-code e chiudere gli sportelli Trascrivere sul foglio di lavoro all interno del registro la positività e il tipo di flacone (Ped s, Aerobic, Anaerobic, Mycosis) Prelevare mediante siringa circa 1 ml di brodocoltura Depositare una goccia su un vetrino per eseguire l esame microscopico (a fresco e con colorazione di Gram) ed una goccia su ciascuna piastra indicata nell allegato Con un ansa sterile distribuire la goccia uniformemente ricoprendo circa 1/5 della superficie della piastra (figura 2). Sempre con la stessa ansa eseguire delle strisce parallele in maniera tale da ridurre progressivamente la carica microbica (figura 3) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso

10 6. Coltura quantitativa e semiquantitativa dei cateteri venosi Coltura semiquantitativa Posizionare il catetere al centro della prima piastra, se troppo lungo tagliare una parte (opposta alla punta) Con un ansa sterile far rotolare 5-6 volte il catetere sulla superficie della piastra di agar sangue Coltura quantitativa Posizionare il catetere nella provetta contenente il brodo di coltura., con la punta rivolta verso il basso Tappare la provetta e sonicare per 1 minuto e vortexare per 30 secondi Immergere nel brodo l estremità di un ansa calibrata da 10 μl (di colore bleu) appena al di sotto della superficie e depositare la goccia al centro della piastra agar sangue (figura 4) Con la stessa ansa eseguire 2-3 passaggi sulla goccia lungo il diametro della piastra (figura 5) e poi eseguire una strisciata continua lungo tutta la piastra con movimenti perpendicolari al diametro della piastra (figura 6) Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso e la provetta con il brodo di coltura dopo averla ritappata. 7. Ricerca di Micoplasma e Ureaplasma. - urine (secondo getto); - sperma; - secreto uretrale; - secreto vaginale; - secreto prostatico. Per tale procedura si rimanda alle istruzioni del kit diagnostico attualmente in uso (allegato 2). 8. Immunofluorescenza diretta. Per tali procedure si rimanda alle istruzioni dei kit diagnostici attualmente in uso (allegati). - escreato o broncoaspirato per la ricerca di Pneumocistis carinii (allegato 3); - aspirato naso-faringeo per la ricerca di Virus Respiratorio Sinciziale (allegato 4); - aspirato naso-faringeo per la ricerca di Adenovirus (allegato 5); - aspirato naso-faringeo o secrezione congiuntivale per la ricerca di Chlamydia trachomatis (allegato 6)

11 9. Immunoenzimatica (E.I.A.) Per tali procedure si rimanda alle istruzioni dei kit diagnostici attualmente in uso (allegati). - feci per la ricerca dell antigene di Helicobacter pylori (allegato 7); - urine per la ricerca dell antigene di Legionella pneumophila (allegato 8); - feci per la ricerca di Astrovirus (allegato 27); - feci per la ricerca di Norovirus (allegato 27). 10. Immunocromatografia. Per tali procedure si rimanda alle istruzioni dei kit diagnostici attualmente in uso (allegati). - feci per la ricerca di Rotavirus (allegato 9); - feci per la ricerca di Adenovirus (allegato 9); - aspirato naso-faringeo per la ricerca di Virus Respiratorio Sinciziale (RSV) (allegato 10); - aspirato naso-faringeo per la ricerca di Adenovirus (allegato 10); - feci per la ricerca della Tossina A di Clostridium difficile (allegato 11); - feci per la ricerca dell Antigene di Clostridium difficile (allegato 11); - urine per la ricerca dell Antigene di Streptococcus pneumoniae (allegato 25); - urine per la ricerca dell Antigene di Legionella pneumophila (allegato 25); - sangue intero per la ricerca di Plasmodium sp. (allegato 26). 11. Agglutinazione al lattice. Per tali procedure si rimanda alle istruzioni dei kit diagnostici attualmente in uso (allegati). - L.C.R. per la ricerca di antigeni batterici in caso di meningite (allegato 12) - siero o L.C.R. o BAL per la ricerca dell antigene di Criptococcus neoformans (allegato 13); - colonie isolate su piastra per l identificazione di gruppo degli Streptococchi β-emolitici (allegato 14); - colonie isolate su piastra per l identificazione di Staphylococcus aureus (allegato 15); - colonie isolate su piastra per l identificazione di Staphylococcus aureus Meticillino Resistente (allegato 16); - colonie isolate su piastra per l identificazione di gruppo delle Salmonelle (allegato 17)

12 12. Microscopia Esame microscopico a fresco. Si esegue per la ricerca di lieviti e Trichomonas vaginalis sui seguenti campioni: - sedimenti urinari; - sperma; - secreto uretrale; - secreto vaginale; - secreto prostatico Prelevare una piccola quantità di materiale e depositarla su un vetrino portaoggetto Coprire con un vetrino coprioggetto Osservare al microscopio prima a 10X e poi a 40X Esame microscopico con soluzione di Lugol. Si esegue per la ricerca di parassiti sui seguenti campioni: - feci stemperate in soluzione fisiologica; - aspirato duodenale centrifugato Prelevare una piccola quantità di materiale e depositarla su un vetrino portaoggetto Coprire con un vetrino coprioggetto Osservare al microscopio prima a 10X e poi a 40X Esame microscopico con Bleu di Lattofenolo. - colonie isolate su piastra per l identificazione dei funghi filamentosi Depositare una goccia di Beu di Lattofenolo su un vetrino portaoggetto Utilizzando un pezzetto di nastro adesivo trasparente prelevare la parte superficiale di alcune colonie Far aderire il nastro adesivo sul vetrino portaoggetti evitando la formazione di bolle d aria Osservare al microscopio prima a 10X e poi a 40X

13 12.4. Esame microscopico previa colorazione di Gram. - tampone nasale per la ricerca di Bordetella pertussis; - biopsia gastrica per la ricerca di Helycobagter pylori; - tampone ferita per la ricerca di Clostridium tetani; - colonie isolate su piastra per l identificazione dei microrganismi isolati; - L.C.R. patologici per la ricerca di microrganismi; - flaconi di emocolture positive Strisciare il tampone nasale direttamente su un vetrino portaoggetto. In caso di biopsia gastrica tagliuzzare il frammento con un bisturi sterile e depositarlo su un vetrino portaoggetti. In caso di colonie isolate su piastra depositare una piccola goccia di acqua distillata sterile su un vetrino portaoggetti e stemperarvi accuratamente la colonia. In caso di L.C.R. patologici ed emocolture positive depositarne una piccola goccia su un vetrino portaoggetti Lasciare asciugare all aria e fissare mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen Colorare il vetrino preparato secondo il metodo di Gram (allegato 18) ed osservare al microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione Microscopia dopo colorazione di May Grunwald Giemsa. - midollo osseo o granuloma cutaneo per la ricerca di Leishmania sp.; - sangue per la ricerca di Plasmodium sp.; - L.C.R. patologici per la differenziazione dei globuli bianchi In caso di midollo osseo o sangue allestire almeno due strisci ematologici. In caso di granuloma cutaneo allestire i vetrini direttamente con il prelievo sulla cute. In caso di L.C.R. patologici depositarne una piccola goccia su un vetrino portaoggetti Lasciare asciugare all aria Colorare il vetrino preparato secondo il metodo di May Grunwald Giemsa (allegato 19) ed osservare al microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione

14 12.6. Esame microscopico previa colorazione di Ziehl-Neelsen. - tampone nasale per la ricerca di Bacillo di Hansen; - tutti i campioni biologici per la ricerca di Micobatteri; - colonie su terreno solido o liquido per l identificazione di Micobatteri. Per tale procedura si rimanda al capitolo Esame microscopico previa colorazione con Auramina-Rodamina. - tutti i campioni biologici per la ricerca di Micobatteri. Per tale procedura si rimanda al capitolo Polymerase Chain Reaction Si esegue con metodo semi-automatizzato sui seguenti campioni: - secreto uretrale, secreto vaginale, secreto prostatico per la ricerca di Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae mediante sistema Probetec fornito dalla Becton-Dickinson (; - secreto prostatico, sperma e urine (primo getto) per la ricerca di Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae mediante Real Time PCR fornito dalla Ditta Nanogen; - escreato, broncoaspirato, broncolavaggio, liquido pleurico, colonie su terreno solido o liquido per la ricerca di Mycobacterium Tuberculosis Complex mediante Real Time PCR fornito dalla Ditta Nanogen; - escreato, broncoaspirato, bronco lavaggio per la ricerca di Micoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydiophila pneumoniae mediante Real Time PCR fornito dalla Ditta Nanogen; Per tali procedure si rimanda alle istruzioni del sistema diagnostico attualmente in uso (vedi manuale tecnico reperibile nel settore di batteriologia e di biologia molecolare) Si esegue con metodo manuale sui seguenti campioni: - colonie su terreno solido o liquido utilizzato per la ricerca dei Micobatteri (allegato 20). 14. Immunoblot. - DNA amplificato da colonie su terreno solido o liquido per l identificazione dei Micobatteri (allegato 21)

15 15. Identificazione dei microrganismi. Si esegue sulle colonie isolate su piastra con metodi automatizzati e semi-automatizzati Identificazione di germi comuni (batteri e lieviti) e di germi esigenti (Anaerobi, Emofili, Neisserie, Corinebatteri, Campylobacter) mediante sistema automatizzato VITEK 2. Per tali procedure si rimanda alle istruzioni del sistema diagnostico attualmente in uso (vedi manuale tecnico reperibile nel settore di batteriologia). 16. Prove di chemiosensibilità dei microrganismi. Si esegue sulle colonie isolate su piastra con metodi automatizzati e manuali Antibiogramma di germi comuni (batteri) mediante sistema automatizzato VITEK 2. Per tali procedure si rimanda alle istruzioni del sistema diagnostico attualmente in uso (vedi manuale tecnico reperibile nel settore di batteriologia) Antibiogramma di germi esigenti (Anaerobi, Emofili, Neisserie, Lieviti) mediante sistema semiautomatizzato API-ATB. Per tali procedure si rimanda alle istruzioni del sistema diagnostico attualmente in uso (vedi manuale tecnico reperibile nel settore di batteriologia) Antibiogramma di germi particolari (S. pyogenes, S. pneumoniae, S. viridans, Lieviti) mediante metodo manuale secondo Kirby-Bauer su piastra. La tipologia di piastre e di antibiotici da utilizzare, insieme alle modalità di interpretazione degli aloni di inibizione e delle M.I.C. per i diversi microrganismi sono indicate nell allegato Preparare una provette sterile con circa 2 ml di soluzione fisiologica sterile Con un tampone sterile prelevare una o più colonie isolate su piastra e stemperarle nella soluzione fisiologica fino a raggiungere una torbidità pari a 0,5 MacFarland Intingere un nuovo tampone sterile nella sospensione batterica, eliminare l eccesso di liquido sulla parete della provetta e strisciare su tutta la piastra in tre direzioni (orizzontale, verticale e diagonale) avendo cura di ricoprire l intera superficie del terreno così da consentire la crescita confluente delle colonie Con una pinzetta sterile prelevare i singoli antibiotici (strisce o dischetti) e posizionarli sulle piastre premendo delicatamente per farli aderire bene Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso

16 17. Ricerca micobatteri. - escreato fluidificato; - broncolavaggio fluidificato; - liquido pleurico; - liquido ascitico; - drenaggio; - ascesso; - pus; - sperma; - urine (almeno 50 ml); - L.C.R. (semina diretta solo su terreno liquido, vedi 17.13) Stampare il foglio di lavoro, numerare (numero/giorno e mese) un provettone da 50 ml (Falcon con tappo a vite di colore bleu o rosso) Versare il campione nel provettone e centrifugare a 3000 rpm per 20 minuti Eliminare il surnatante Raccogliere parte del sedimento con un ansa calibrata da 1 μl (di colore bianco) e strisciare il materiale su due vetrini portaoggetto Lasciare asciugare all aria e fissare mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen Colorare il primo vetrino preparato secondo il metodo di Ziehl-Neelsen (allegato 23) ed osservare al microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione Colorare il secondo vetrino preparato con la colorazione a fluorescenza (allegato 24) ed osservare al microscopio prima a 10X e poi a 40X Risospendere il sedimento con 10 ml di tampone fosfato sterile, aggiungere 10 ml di decontaminante e vortexare Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti Aggiungere 30 ml di tampone fosfato sterile e miscelare per inversione Centrifugare a 3000 rpm per 20 minuti Eliminare il surnatante Utilizzando una pipetta Pasteur monouso risospendere il sedimento con circa 1,5 ml di tampone fosfato sterile miscelando accuratamente ma evitando la formazione di aerosol Con la stessa pipetta monouso prelevare 0,5 ml di campione ed inocularlo in una provetta di terreno liquido MGIT precedentemente addizionata con 0,8 ml di Supplement ed etichettata con il numero identificativo del campione

17 Avvitare strettamente il tappo Con la stessa pipetta monouso inoculare 3 gocce di campione in un tubo di terreno solido Lowenstein-Jensen etichettato con il numero identificativo del campione avendo cura di far distribuire il liquido su tutta la superficie del terreno Lasciare il tappo leggermente allentato per consentire l evaporazione del liquido Aprire il primo cassetto nell incubatore-lettore BACTEC Selezionare l icona di inserimento dei campioni (freccia rivolta verso il basso) Leggere il bar-code della provetta di terreno liquido ed inserirla in corrispondenza del led luminoso che si accende Ripetere la procedura per tutte le provette da inserire quindi selezionare l icona di uscita e chiudere il cassetto Incubare il tubo di terreno solido in posizione orizzontale per favorire il contatto del campione con tutta la superficie del terreno Dopo una settimana sollevare il tubo di terreno, stringere il tappo per evitare l essiccamento del terreno e proseguire l incubazione in posizione verticale Conservare il residuo del campione rimasto nel provettone in congelatore a -20 C. N.B.: Per la ricerca di Bacillo di Hansen strisciare il tampone nasale direttamente su un vetrino portaoggetti. Lasciare asciugare all aria e fissare mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen. Colorare il vetrino preparato secondo il metodo di Ziehl-Neelsen (allegato 23) ed osservare al microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione. In caso di sospetta positività del terreno solido depositare una piccola goccia di acqua distillata sterile su un vetrino portaoggetti e stemperarvi accuratamente la colonia. In caso di sospetta positività terreno liquido depositare una piccola goccia su un vetrino portaoggetto. Lasciare asciugare all aria e fissare mediante passaggi ripetuti sulla fiamma del becco Bunsen. Colorare il vetrino preparato secondo il metodo di Ziehl-Neelsen (allegato 23) ed osservare al microscopio prima a 10X e poi a 100X in immersione

18 Figure Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura

19 Elenco allegati. 1. Terreni da utilizzare per i diversi campioni biologici 2. Ricerca Micoplasma e Ureaplasma 3. Immunofluorescenza diretta per la ricerca di Pneumocistis carinii 4. Immunofluorescenza diretta per la ricerca di Chlamydia trachomatis 5. E.I.A. per la ricerca dell antigene di Helicobacter pilori 6. E.I.A. per la ricerca dell antigene di Legionella pneumophila 7. Immunocromatografia per la ricerca di Rotavirus, Adenovirus nelle feci 8. Immunocromatografia per la ricerca di Adenovirus, RSV nell aspirato naso-faringeo 9. Immunocromatografia per la ricerca dell Antigene e della Tossina A di Clostridium difficile 10. Agglutinazione al lattice per la ricerca di antigeni batterici in caso di meningite 11. Agglutinazione al lattice per la ricerca dell antigene di Criptococcus neoformans 12. Agglutinazione al lattice per l identificazione di gruppo degli Streptococchi β-emolitici 13. Agglutinazione al lattice per l identificazione di Staphylococcus aureus 14. Agglutinazione al lattice per l identificazione di gruppo delle Salmonella 15. Colorazione di Gram 16. Colorazione di May Grunwald Giemsa 17. Immunoblot per l identificazione dei Micobatteri 18. Antibiogramma secondo Kirby-Bauer 19. Colorazione di Ziehl-Neelsen 20. Immunocromatografia per la ricerca dell Antigene di Pneumococco e Legionella nelle urine 21. Immunocromatografia per la ricerca di Plasmodium sp. nel sangue 22. E.I.A. per la ricerca di Astrovirus, Norovirus nelle feci