OOGENESI Oogenesi differisce da spermatogenesi. Oocita contiene tutti i materiali necessari (enzimi, mrna, organuli e substrati metabolici) per avviare e mantenere il metabolismo e lo sviluppo
La meiosi oogenetica differisce dalla meiosi spermatogenetica nei modi Oocita I Oocita II Polar body formation in the oocyte of the whitefish Coregonus. (A) Anaphase of first meiotic division, showing the first polar body pinching off with its chromosomes. (B) Metaphase (within the oocyte, arrow) of the second meiotic division, with the first polar body still in place. The first polar body may or may not divide again. (From Swanson et al. 1981; photographs courtesy of C. P. Swanson.) 2
La meiosi oogenetica differisce dalla meiosi spermatogenetica e nei tempi 3
OOGENESI I meccanismi dell oogenesi variano da una specie all altra in rapporto alle modalità di riproduzione. Nelle specie che producono migliaia di uova gli oogoni sono cellule staminali che si autorinnovano e persistono per tutta la vita dell organismo Nelle specie che producono un minor numero di uova gli oogoni si moltiplicano a formare un numero limitato di precursori cellulari delle uova In generale la maturazione comprende oltre alla meiosi, che spesso viene completata con la fecondazione, i seguenti processi: ACCRESCIMENTO VOLUMETRICO (auxocitosi) variabile a seconda del tipo di uova (oligolecitiche, mesolecitiche e macrolecitiche) dovuto a incremento della componente citoplasmatica e alla moltiplicazione di organuli (es. mitocondri, ribosomi) L aliquota più consistente di materiale accumulato è rappresentato dal DEUTOPLASMA o VITELLO FORMAZIONE DI INVOLUCRI (uno o più) per regolare il processo di fecondazione e proteggere l embrione nelle prime tappe dello sviluppo
La vitellogenesi inizia in diplotene della meiosi I Maggiore componente è la proteina Vitellogenina - sintetizzata nel fegato, veicolata dal sangue, attraversa le cellule follicolari. Assorbita per micropinocitosi Nell oocita maturo la Vg è scissa in fosvitina e lipovitellina. Con inclusioni lipidiche e glicogeno, queste proteine vanno a costituire le placchette vitelline (vitello per nutrizione embrione)
Tipi di uova in funzione della quantità vitello
The accumulated material in the oocyte cytoplasm includes energy sources and energy-producing organelles (the yolk and mitochondria); the enzymes and precursors for DNA, RNA, and protein syntheses; stored messenger RNAs; structural proteins; and morphogenetic regulatory factors that control early embryogenesis. Cellular components stored in the mature oocyte of Xenopus laevis Component Mitochondria 100,000 RNA polymerases 60,000 100,000 DNA polymerases 100,000 Ribosomes 200,000 trna 10,000 Histones 15,000 Approximate excess over amount in larval cells Deoxyribonucleoside triphosphates 2,500 8
Nell ovocita in maturazione la trascrizione genica è molto attiva e i suoi prodotti sono (1)necessari per il metabolismo cellulare (2)necessari per i processi specifici dell oogenesi (3)necessari per lo sviluppo embrionale precoce CHE COSA SONO I CROMOSOMI A SPAZZOLA? Negli anfibi in diplotene alcuni cromosomi estendono lunghe anse di DNA, sede di specifici geni che attivamente trascrivono gli RNA Amphibian lampbrush chromosomes are active in the diplotene germinal vesicle during first meiotic prophase. (A) A lampbrush chromosome of the salamander Notophthalmus viridescens. Extended DNA (white) loops out and is transcribed into RNA (red). (B) Localization (arrow) of histone genes on a lampbrush chromosome in an amphibian oocyte. The genes have been visualized by in situ hybridization and autoradiography. (A courtesy of M. B. Roth and J. Gall; B from Old et al. 1977, courtesy of H. G. Callan.)
Maturazione dell ovocita nell anfibio (Xenopus) - regolazione della meiosi da parte di progesterone e fecondazione Gonadotropine dall ipofisi Ovulazione Oocyte maturation is blocked in the diplotene stage of first meiotic prophase by the lack of active MPF. Progesterone activates the production of c-mos, and the c-mos protein initiates a cascade of phosphorylation that eventually phosphorylates the p34 component of MPF. This allows the MPF to become active. The MPF drives the cell cycle through the first meiotic division, but further division is blocked by CSF, a compound containing c-mos and cdk2. Upon fertilization, calcium ions released into the cytoplasm are bound by calmodulin and are used to activate two enzymes, calmodulin-dependent protein kinase II and calpain II, which inactivate and degrade CSF. Second meiosis is completed, and 10the two haploid pronuclei can fuse. At this time, cyclin B is resynthesized, allowing first cell cycle of cleavage to begin.
LA CELLULA UOVO Nell enorme massa di citoplasma si trova un nucleo voluminoso che AL MOMENTO DELLA FECONDAZIONE PUO TROVARSI IN STADI DIVERSI DI MATURAZIONE
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DOVE AVVIENE L OOGENESI? NEI MAMMIFERI QUALI SONO GLI EVENTI TEMPORALI CHE PORTANO ALLA FORMAZIONE DELLA CELLULA UOVO?
OOGENESI NEI MAMMIFERI Infundibolo Ampola
TAPPE DELL OOGENESI NEI MAMMIFERI FASE PROLIFERATIVA: nel feto 1000 oogoni di partenza si moltiplicano ripetutamente per mitosi all interno della corticale dell ovaio embrionale fino a raggiungere un massimo di 6-7 milioni al V mese di sviluppo fetale nell uomo 5 mese di sviluppo fetale Inizio I div meiotica DEGENERAZIONE E FORMAZIONE DEI FOLLICOLI PRIMORDIALI: prima della nascita molti oogoni degenerano per il processo di atresia e i rimanenti entrano nella profase della I divisione meiotica Arresto in diplotene ARRESTO DELLA I DIVISIONE MEIOTICA: in molti mammiferi gli oociti si arrestano in diplotene intorno alla nascita. In questo stato quiescente gli oociti primari rimangono fino alla pubertà, quando riprendono periodicamente la meiosi Dei 200.000-400.000 follicoli presenti alla pubertà solo 400-500 arrivano all ovulazione
FOLLICOLOGENESI MAMMIFERI: CAMBIAMENTO MORFOLOGIA Alla nascita sono presenti oociti I (diplotene profase I) circondati da uno strato di cellule follicolari appiattite: FOLLICOLI PRIMORDIALI Dalla nascita alla pubertà i follicoli I e gli oociti contenuti iniziano a crescere ma vanno incontro ad atresia Sopravvivenza dei follicoli e loro sviluppo garantiti da livelli ematici di FSH e LH raggiunti alla pubertà quando l IPOFISI diventa funzionante Anche durante il periodo fertile i follicoli vanno incontro ad atresia
FOLLICOLOGENESI MAMMIFERI: CAMBIAMENTO MORFOLOGIA L oocita maturando secerne fattori paracrini che permettono la proliferazione delle cellule follicolari. Le cellule follicolari secernono fattori di crescita e di differenziamento Oocita si accresce e i vasi sanguigni entrano nella regione del follicolo Solo alla fine dello sviluppo follicolare l oocita completa la prima divisione meiotica ed inizia la seconda. Quest ultima verrà completata solo al momento della fecondazione con l entrata dello spermatozoo
MATURAZIONE DELL OOCITO NEI MAMMIFERI (1) L ovulazione, a seconda della specie, segue un modello ben preciso: L accoppiamento stimola il rilascio di gonadotropina dall ipofisi attivando così la meiosi e gli eventi che porteranno all ovulazione (es. conigli, visoni ) Ovulazione periodica, influenzata da stimoli che agiscono sull ipotalamo a rilasciare l ormone di rilascio delle gonadotropine (FSH e LH), che stimolano le cellule follicolari a: secernere estrogeni accrescersi determinando l ovulazione
MATURAZIONE DELL OOCITO NEI MAMMIFERI (2) Nei PRIMATI la periodicità della maturazione e l espulsione dell uovo (ovulazione ciclica) costituiscono il ciclo mestruale Ovulazione ciclica comporta: Ciclo ovarico: maturazione ed espulsione oocita Ciclo uterino: maturazione dell ambiente adatto allo sviluppo della blastocisti Ciclo cervicale: consente agli spermatozoi di entrare nelle vie genitali femminili solo al momento opportuno Queste tre funzioni sono integrate dagli ormoni secreti da: Ipotalamo: ormone stimolante l ipofisi per FSH ipofisi: gonadotropine (FSH e LH) ovaio : estrogeni e progesterone
OVULAZIONE Nell ovaio umano gli oociti (diplotene - profase I) sono contenuti in un follicolo primordiale (1 strato di cellule della granulosa e 1 strato di cellule mesenchimali della teca) Dalla pubertà periodicamente gruppi di follicoli primari entrano in maturazione: aumenta il numero delle cellule della granulosa e il volume dell oocita (circa 550 volte). Influenza reciproca per la sintesi di fattori paracrini OOCITA IN DIPLOTENE TRASCRIVE I GENI PER ZP1-ZP2 E ZP3 La sopravvivenza dei follicoli e il loro differenziamento dipende da livelli ematici di gonadotropine: FSH e LH rilasciati dall ipofisi alla pubertà Nella donna, l assenza di oogoni nell ovaio riveste una importanza clinica: radiazioni ionizzanti, farmaci chemioterapici possono danneggiare oociti I provocando sterilità
OVULAZIONE I P O F I S I FASE FOLLICOLARE: Livelli degli ormoni FSH e LH che regolano la maturazione del follicolo O R M O N I S T E R O I D EI FASE LUTEINICA: Livelli di estrogeni e progesterone che regolano la maturazione dell endometrio
OVULAZIONE Fase follicolare: ipofisi rilascia FSH e i follicoli in maturazione rispondono accrescendosi FSH FSHe induce LH inducono la sintesi le cellule di recettori follicolari per alhprodurre nelle cellule estrogeni della granulosa. che determinano: proliferazione In seguito ipofisi di vasi secerne nell endometrio; LH: viene fluidificazione rimosso il blocco della muco meiosi in cervicale (passaggio diplotene. spermatozoi); aumento di recettori per FSH nelle cellule Fine granulosa meiosi I, dei inizio follicoli meiosi maturi II e e inibizionel oocita ipofisi aviene secernere ovulato FSH; Quando i livelli di estrogeni aumentano, FSH minore rispetto LH. dal 10 giorno: estrogeni aumentano seguiti dal picco di LH e picco minore di FSH: entro 10-12 h dal picco avviene l ovulazione.
OVULAZIONE I cambiamenti preovulatori che portano all OVULAZIONE comprendono: -Aumento del liquido follicolare nell antro -LH induce la produzione: Prostaglandine che provocano contrazione della muscolatura dell ovaio e aumento flusso H 2 O dai capillari ovarici collagenasi e plasminogeno per digerire la matrice extracellulare Si ha così la riduzione della zona di attacco del cumulo ooforo alla granulosa Con l ovulazione si ha il completamento della prima divisione meiotica e inizio della seconda divisione fino alla metafase II
FOLLICOLOGENESI MAMMIFERI RIASSUMENDO. FOLLICOLO PRIMORDIALE : cellule follicolari appiattite Indotti da stimolati intraovarici poco noti a diventare FOLLICOLO I: cellule follicolari cubiche che proliferano Accrescimento oocita per sintesi e accumulo RNA e proteine Oocita secerne glicoproteine (ZPs) per formare involucro acellulare interposto tra membrana plasmatica e cellule follicolari Presenza di giunzioni gap tra cellule follicolari e oolemma: trasferimento di sostanze nutritizie: oocita da 20 μm a 100 μm Durante la crescita specifici geni vengono disattivati (metilazione DNA) per garantire corretto sviluppo Si forma il FOLLICOLO MULTILAMINARE che induce le cellule del connettivo a formare la teca del follicolo Teca interna: strato cellulare interno più vascolarizzato; Teca esterna: cellule dello strato esterno più compatte per presenza di fibre collagene Cellule follicolari esprimono recettori per FSH e quelle della teca interna recettori per LH: determinano la formazione del follicolo dominante o di Graaf
Fase luteinica: le cellule restanti del follicolo formano il corpo luteo sotto influsso di LH. Corpo luteo secerne estrogeni ma soprattutto progesterone che arrivando per via ematica all utero completa la preparazione dell endometrio per l annidamento della blastociti Progesterone inibisce produzione di FSH impedendo maturazione di altri follicoli. Se l uovo non è fecondato la produzione di progesterone cessa e la mucosa uterina si sfalda. Con declino dei livelli plasmatici di progesterone l ipofisi secerne di nuovo FSH e il ciclo si ripete.
Asse ipotalamo-ipofisi-gonade
Steroide sintetico: mifepristone (RU486) Interrompe l accrescimento dell endometrio ed impedisce impianto Blocca i recettori per il progesterone nell utero RU486 is thought to compete for the progesterone receptor inside the nucleus. RU486 can bind to the progesterone site in the receptor, and the receptor-ru486 complex appears to form heterodimers with the normal progesterone-carrying progesterone receptor. When this RU486-progesterone complex binds to the progesterone-responsive enhancer elements on the DNA, transcription from this site is inhibited (Vegeto et al. 1992; Spitz and Bardin 1993). In Europe, RU486 has become a widely used alternative to surgical abortion (Palka 1989; Maurice 1991). Nella pillola contraccettiva si utilizza una combinazione di estrogeni e progesterone che inibiscono sintesi di FSH e quindi la maturazione di altri follicoli
LA CELLULA UOVO ( ovocita maturo capace di legare lo spermatozoo e essere fecondato) E UNA CELLULA SPECIALIZZATA PER RICONOSCERE ED ACCOGLIERE IL PRONUCLEO DELLO SPERMATOZOO E INIZIARE LO SVILUPPO
Il citoplasma dell uovo Il deposito citoplasmatico (variabile quantitativamente nelle diverse specie in relazione alla tipo di fecondazione e sviluppo) comprende: Proteine per fornire all embrione energia e aminoacidi (in molte specie viene accumulato vitello, la cui componente principale è la vitellogenina prodotta nel fegato e trasportata all ovaio per via circolatoria) Ribosomi e trna per effettuare sintesi proteica dopo la fecondazione RNA messaggeri (le proteine da produrre durante le fasi iniziali dello sviluppo sono codificate da messaggeri materni che rimangono quiescenti fino a fecondazione avvenuta) Fattori morfogenetici (molecole che dirigono il differenziamento, spesso localizzate in regioni differenti del citoplasma dell uovo, che con la segmentazione vengono segregate in cellule differenti). Sostanze protettive (es. filtri per le radiazioni ultraviolette) Granuli corticali si formano dal Golgi Duplicazione dei mitocondri 34
SINTESI NEGLI OOCITI DI MAMMIFERO Nei mammiferi Euteri non c è vitellogenesi in quanto le uova sono alecitiche Il periodo di accrescimento ovocitario avviene nelle settimane che precedono l ovulazione Sintesi RNA Intensa sintesi di mrna negli oociti in accrescimento (trascritti materni) Accumulo di rrna (formazione di nucleoli sovrannumerari) durante lo stadio di diplotene in cui parte del DNA viene trascritto anche se non ci sono i cromosomi a spazzola Una parte rilevante di questi mrna sono destinati a produrre proteine che modificheranno l ambiente dell utero materno per favorire l impianto della blastocisti Nel topo le cellule del trofoblasto secernono proteine che digeriscono la matrice extracellulare della parete uterina L inizio dello sviluppo embrionale dipende dai geni materni!!!!!!! Un carattere mutato portato dal genoma materno, in questa fase non può essere compensato dal genoma paterno
LA CELLULA UOVO Il citoplasma è racchiuso dalla MEMBRANA PLASMATICA capace di fondersi con la membrana dello spermatozoo e di regolare il flusso di determinati ioni al momento della fecondazione Al di sotto della membrana si trova il CORTEX, strato di citoplasma contenente actina globulare, i GRANULI CORTICALI (vescicole derivate dal Golgi contenenti enzimi idrolitici, mucopolisaccaridi, glicoproteine di adesione e proteine ialine) e i mitocondri. Enzimi e mucolpolisaccaridi: impediscono polispermia Glicoproteine ialine e di adesione sostengono i blastomeri
L actina dello strato corticale 37
INVOLUCRI OVULARI La cellula uovo è provvista di involucri protettivi distinti in 2 categorie in rapporto alla loro origine: 1. Involucri primari prodotti dall uovo stesso (es. membrana vitellina / involucro vitellino / zona pellucida) 2. Involucri secondari prodotti dalle vie genitali femminili durante il passaggio delle uova (es. involucro gelatinoso negli anfibi, albume, membrane testacee e guscio nei vertebrati terrestri) hanno permesso un miglior adattamento all ambiente
MEMBRANE PRIMARIE Rivestimento a tessitura fibrosa costituito da glicoproteine essenziali per il processo della fecondazione: legame specie specifico uovo-spermatozoo induzione reazione acrosomiale regolazione entrata spermatozoo blocco della polispermia. La membrana vitellina Uova di Anfibio Uovo di riccio di mare
La zona pellucida Uovo di criceto MAMMIFERI ZONA PELLUCIDA Corona radiata
Uovo di Xenopus ANFIBI JELLY COAT INVOLUCRI SECONDARI Uovo di pollo UCCELLI MEMBRANA VITELLINA + membrane accessorie 42
RIASSUMENDO
SPERMATOGENESI Meiosi rapida e continua Dalla meiosi derivano 4 Spermatozoi Completamento meiosi in giorni o settimane Meiosi e differenziamento procedono senza arresto. Il gamete si differenzia quando è aploide Eliminazione citoplasma Molti spermatozoi per ogni cellula di Sertoli Mancano membrane accessorie GAMETOGENESI NEI MAMMIFERI I cromosomi sessuali sono esclusi da ricombinazione e trascrizione durante la profase della I divisione OOGENESI Meiosi lenta e a tappe Dalla meiosi deriva 1 sola cellula uovo Meiosi si arresta nella profase I div meiotica, il completamento è ritardato per mesi o anni Il differenziamento avviene quando la cellula è diploide Accumulo citoplasma Molte cellule follicolari per un oocita Sono prodotte membrane accessorie Tutti i cromosomi mostrano equivalente trascrizione e ricombinazione durante profase I divisione meiotica