Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Vitigni resistenti - nuove opportunità per una viticoltura sostenibile Riccardo Velasco, PhD Direttore CREA Viticoltura ed enologia

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach 5.000 varietà (probabilmente sottostimata) nel mondo, 545 registrate nel catalogo nazionale potrebbero far pensare ad un numero più che sufficiente per una scelta varietale, tuttavia con resistenze ai patogeni

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach...non abbiamo molto materiale disponibile se non negli ultimi anni Sintomi di Peronospora (DM) (Plasmopara viticola) Sintomi di Oidio (PM) (Oidium tuckeri)

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Dalla seconda metà dell'800, tre devastanti malattie (fillossera, peronospora e oidio) provenienti dall America hanno modificato radicalmente la viticoltura Europea, che era sostenibile, completamente naturale e non inquinante. Poichè la vite di origine euroasiatica (Vitis Vinifera) oggi largamente coltivata in tutto il mondo per la produzione di vino e uva da tavola) è sensibile alla maggior parte dei patogeni si è dovuto intervenire con l'applicazione di agrofarmaci per contenere le perdite e salvare le piante.

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Prodotti di sintesi con minor ecotossicità Viticoltura di precisione (diagnosi/mappatura tramite telerilevamento) Lotta biologica (nemici naturali dei pato Elicitori di difesa, microorganismi effettivi Modelli previsionali Tecniche agronomiche Distribuzione razionale (atomizzatori a recupero) Varietà tolleranti/resistenti resistenti SOSTENIBILITA

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Cosa significa resistenza: L immunità non esiste Esistono diversi livelli di resistenza Ci sarà sempre comunque bisogno di mantenere i patogeni sotto controllo

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Il miglioramento genetico: Un attività pluriennale Impegnativa e costosa Come incrementare le probabilità di successo(?)

Il miglioramento genetico tradizionale 2. Copertura 1. Castrazione e impollinazione 3 anni da seme a seme 7. Traianto e selezione 6. Screening 5. Germinazione 3. Collezione 4. Recupero semi e vernalizzazione

Istituzioni Europee impegnate nel miglioramento genetico HGU Geisenheim JKI Geilweilerhof Siebeldingen Rep. Ceca Ungheria INRA Colmar WBI Freiburg Austria Agroscope Changins Fond. Mach CREA VE Conegliano University Udine 100 km http://www.stepmap.de/landkarte/deutschland-italien-1415470

Incrocio Convenzionale X Esempio di piramidazione di resistenze genetiche contro più patogeni (30 anni di attività) 15-25 anni New cultivar

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Varietà resistenti registrate nei cataloghi nazionali (una resistenza) Germania: Regent (r);bronner(b); Johanniter, Merzling, Solaris, Helios, Prior, Baron, Monarch, Cabernet Cortis, Cabernet Carol, Cabernet Carbon, Calandro, Felicia, Reberger, Villaris Austria: Roesler (r); Rathay (r) Italia: Regent, Bronner + altre 6, giugno 2014+10 (UniUD)

in cooperation with Sauvignon Kretos Soreli Fleurtai Sauvignon Rytos Cabernet Volos Merlot Khorus Merlot Kanthus According to Enrico Peterlunger, University Udine

Suscettibile (P) INCROCI MULTIRESISTENTI Resistente (P) Progenie (F1) 2017 Glera 10 Glera 19 2017: Muscaris, Souvignier Gris, Soreli 2018: Calardis blanc, Cabernet Cantor, Toldi, SK001, SK002 2018 110 grappoli 110 grappoli 5000 vinaccioli 11000 vinaccioli 19/02/2019 13

GERMINAZIONE E MANTENIMENTO SEMENZALI 5000 vinaccioli 2018 2017 INVERNO 110 grappoli 3-4 mesi 4000 vinaccioli germinati 3000 piante INVERNO 110 grappoli 11000 vinaccioli 3-4 mesi 6-7000? 19/02/2019 14

FENOTIPIZZAZIONE 2017. Osservazione e classificazione infezione da oidio (OIV 455 in serra) 2017. Verifica resistenza da peronospora (saggio su dischetto fogliare in laboratorio) HS S R HR R MR S MR HS HR 2018. Peronospora: saggi su disco fogliare e approfondimenti con sensori multi- e iper-spettrale 2018. Fenotipizzazione per oidio in serra funzionale alla rimozione delle più sintomatiche (CLASSI 3 E 1) da escludere da analisi molecolari. 15

IMPIANTO 2017: messa a dimora di circa 600 selezioni (di cui 200 da Glera). 2018: messa a dimora di altre 900 selezioni da Glera (tot. 1500 di cui 1100 circa da Glera) Selezioni resistenti in campo 2012-2015 2016 2017 16

Effetto additivo della resistenza in presenza di geni diversi (peronospora) Rpv1 - + + Rpv3 - - +

100 80 % genotipi 60 40 20 0 4 0 - Rpv1, - Rpv3 22 Distribuzione della resistenza in presenza di geni diversi (peronospora) 44 30 1 3 5 7 9 classe di infezione % genotipi 100 80 60 40 20 0 0 + Rpv1, - Rpv3 56 31 6 6 1 3 5 7 9 classe di infezione 100 - Rpv1, + Rpv3 100 100 + Rpv1, + Rpv3 80 70 80 % genotipi 60 40 20 0 26 4 0 0 1 3 5 7 9 classe di infezione % genotipi 60 40 20 0 0 0 0 0 1 3 5 7 9 classe di infezione

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Il miglioramento genetico moderno: Selezione assistita Identificazione di nuovi marcatori Piramidazione (concentrazione di più geni in alcuni genotipi d «élite»)

Resistance gene to markers crosses res. genotype Rpv1 Plasmopara viticola VMC72 VVIb32 Syrah x 28-8-78 28-8-78 M. rotun Rpv2 Plasmopara viticola Cabernet Sauvignon x 8624 8624 M. rotund Rpv3 Plasmopara viticola UDV-112 Regent x Lemberger Regent VVIn16 Chardonnay x Bianca Bianca UDV-305 VMC/F2 Rpv4 Plasmopara viticola VMC7h3 VMCNg2e2.1 Regent x Lemberger Regent Rpv5 Plasmopara viticola VVIo52b Cabernet Sauvignon Rpv6 Plasmopara viticola VMC8G9 Cabernet Sauvignon x Gloire de Montpellier x Gloire de Montpellier Rpv7 Plasmopara viticola UDV-097 Chardonnay x Bianca Bianca Gloire de Montpellier V. riparia Gloire de Montpellier V. riparia Rpv8 Plasmopara viticola VMC1G3.2 Moscato Bianco x V. riparia Wr63 V. riparia Rpv9 Plasmopara viticola CCoAOMT Moscato Bianco x V. riparia Wr63 V. riparia Rpv10 Plasmopara viticola V.amurensis

Resistance gene to markers crosses res. genotype Ren1 Erysiphe necator UDV-020 Nimrang x Kishmish vatkana Kishmish vatkana VMC9h4-2 VMCNg4e10.1 Ren2 Erysiphe necator CS25 Horizon x Illinois 547-1 Illinois 547-1 Ren3 Erysiphe necator UDV-015b Regent x Lemberger Regent VViv67 Ren4 Run1 Erysiphe necator VMC1g3.2 VRH3082-1-42 x Cabernet Sauvignon VMC4f3.1 VRH3082-1-42 M. rotundifolia 5-gt anthocyanin 3,5- diglucosides Gf09_01 Regent x Lemberger Regent

Regioni cromosomiche più significative per resistenze 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Rpv4 Rpv5 Rpv7 Run1 Rpv1 Ren2 Ren1 17,2 23,0 18,8 19,3 23,9 25,0 21,5 21,0 22,3 23,0 18,1 19,8 Rpv6 22,7 Rdv1 24,4 PdR1 20,3 22,1 Rpv3 XiR1 24,0 Resistenza a fillossera Resistenza a oidio Resistenza a peronospora Resistenza alla malattia di Pierce Resistenza ai nematodi 30,3 29,4

Tratti di resistenza in vite combinati con tratti qualitativi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ufgt sex Rpv4 Rpv5 5-GT Rpv7 Run1 Rpv1 Ren2 myba Ver Ren1 17,2 23,0 18,8 19,3 23,9 25,0 21,5 21,0 22,3 23,0 18,1 19,8 Rpv6 22,7 Rdv1 24,4 PdR1 20,3 22,1 Rpv3 Be size sdi XiR1 24,0 Resistenza a fillossera Resistenza a oidio Resistenza a peronospora Resistenza alla malattia di Pierce Resistenza ai nematodi qualità: Monoterpeni qualità: colore della bacca Evoluzione : invaiatura apirenia 30,3 29,4

Regione cromosomica responsabile della resistenza Marcatori molecolari Regione identificata sul cromosoma Resistenza a oidio1 Resistenza a oidio2 Resistenza a peronospora1 Resistenza a peronospora2

SELEZIONE MOLECOLARE 2017: selezione molecolare di 1050 su 1500 semenzali 2016 (precedenti alla convenzione). A B B 400 suscettibili 1050 semenzali B C A C 2018: selezione dei semenzali 2017 600 resistenti 2200 semenzali analisi in corso (circa a metà)

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Loci di resistenza nelle nuove varietà disponibili Peronospora Oidio Rpv3-1 Rpv10 Ren3 in resistenti già registrate: in varietà tradizionali: Rpv1 Rpv3-1 Rpv10 Rpv1 Rpv3-1 Rpv10 Rpv1 Rpv3-1 Rpv10 Run1 Ren1 Run1 Ren1 Run1 Ren1 Ren3 Ren3 Ren3 1&1 1&1 0&0

Numerosi i marcatori correlati alla resistenza, fonti di resistenza a: Run1, Rpv1 = resistance to oidium and peronospora invitis muscadinia Ren1 = resistance to oidium in Kishmish vatkana Ren2 = resistance to oidium in Regent Rpv3 = resistance to peronospora in Regent Rpv_X = resistance to peronospora in Solaris (Vitis amurensis)

Genotype x Genotype y F1 Run1 Rpv1 Ren1 Rpv_x F1 Rpv3 Ren1 Rpv_x Ren2 2011 Genotype z Rpv_x Rpv3 Rpv_x Run1 Rpv1 Ren1 Ren2 Genotype k 2015 Ren1 F1 F1 Ren1 Rpv3 Rpv_x Run1 Rpv1 Ren1 Ren2 Rpv3 Run1 Rpv1 Ren1 Ren2 2019 Rpv3 Rpv_x res. peronospora Run1 Rpv1 res. peronospora & oidium Rpv3 Rpv_x Run1 Ren1 Ren2 Rpv1 Ren1 Ren2 Schema di piramidazione res. oidium Marco Stefanini 2023

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Il miglioramento genetico del futuro: Screening rapido per nuove resistenze Strade alternative alla MAS Nuove tecnologie abilitanti

Incrocio Convenzionale Modifica Genetica X Trangenesi Specie estranea Cisgenesi Cisgenesi Specie affini 1.Materiale genetico trasferibile sessualmente 2.Gene trasferito nella forma nativa 3.Nessuna traccia di DNA esogeno rimannente dopo il trasferimento 15-25 anni 3 anni 3 anni

Alimentazione Agricoltura Migliore output con minore input Centro di Ricerca in Viticoltura ed Enologia Fondazione Edmund Mach Modificare le varietà esistenti: È possibile senza produrre OGM?

Genome Editing Crispr/cas9 Via plasmide Via proteina Espressione transitoria e 3 anni

Büschges, R., Hollricher, K., Panstruga, R., Simons, G., Wolter, M., Frijters, A., van Daelen, R., van der Lee, T., Diergaarde, P., Gronendijk, J., Töpsch, S., Vos, P., Salamini, F., Schulze-Lefert, P. (1997) The barley Mlo gene: a novel control element of plant pathogen resistance. Cell 88: 695-705 Mlo gene family in grapevine distribution along the 19 chromosomes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 7 mlo13 mlo12 mlo14 mlo3 mlo8 mlo7 mlo6 Ren5 Ren3 18 19 mlo2 mlo1 Orzo Mlo vs. mlo mlo17 mlo9 mlo11 mlo10 Run1 Brachetto vite suscettibile mlo16 Ren1 mlo15 mlo4 Ren2 Run2 Brachetto-mlo07 mutato

Severity: 23.7% MLO07 110k conidia/cm 2 Severity: 6.4% mlo07 100 µm 8k conidia/cm 2 50 µm

Alimentazione Agricoltura Progetto BioTech Migliore output con minore input Fondazione Edmund Mach RNA guide endonuclease + Cas9 protein Chardonnay New variety(?) (Chardonnay clone)

Alimentazione Agricoltura Progetto BioTech Migliore output con minore input Fondazione Edmund Mach Perchè è necessario oggi un adeguamento della 18/2001 NON ricadono nella definizione vigente di OGM: -Piante dove è stato eliminato il DNA transgenico (ma rimane solo il DNA cisgenico) -Piante dove è stato eliminato il transgene CRISPR/Cas9 (seconda generazione) per realizzare il genome editing (ma resta il DNA editato) o è stato utilizzato in forma transiente -Piante dove è stato eliminato il gene «early flowering» (senza che nessuna traccia di DNA transgenico sia identificabile perchè non c è) -Piante dove non è stato inserito alcun DNA esogeno ma si è editato il DNA già presente nel patrimonio genetico della pianta

Agricoltura Alimentazione Migliore output con minore input Fondazione Edmund Mach Si ringraziano: Barbara de Nardi, Marco Stefanini, Silvia Vezzulli e i molti amici della F. F Mach, Geilweilerhof (D), Pecs(H), UniUD, Colmar (F)