POLIMORFISMI DI LUNGHEZZA DI SEQUENZE SEMPLICI (SSLP)

POLIMORFISMI DI LUNGHEZZA DI SEQUENZE SEMPLICI (SSLP) Minisatelliti Noti anche come VNTR, cioè Ripetizioni in Tandem a Numero Variabile. Sono sequenze in cui l unità ripetitiva è di circa 25 nucleotidi. La variabilità consiste nel numero di volte in cui sono ripetute. Non sono distribuite uniformemente su tutto il genoma ma più frequenti nelle regioni telomeriche. Alleli > 300 bp. Microsatelliti Noti anche come STR, cioè Ripetizioni in Tandem Semplici. Sono sequenze in cui l unità ripetitiva è più corta (2-4 nucleotidi). Sono distribuite più uniformemente in tutto il genoma, quindi più utili ai fini della applicazione in genetica. Gli alleli sono più corti rispetto a quelli dei minisatelliti (< 300 bp). Sono 6,5 x 10 5 in un genoma umano. Analisi di microsatelliti mediante PCR Il gene mutato è associato all allele 4, il gene normale all allele 7 In seguito a ricombinazione, il gene mutato risulta essere associato all allele 7 invece che all allele 4 In questo albero genealogico vengono seguiti un gene malattia dominante ed un polimorfismo di microsatelliti. Rosso gli alleli polimorfici Nero soggetti affetti Bianco soggetti sani Considerando che il soggetto II-1 è malato e ha genotipo 1/2, e che il gene in esame è strettamente associato al locus polimorfico, si possono fare 2 ipotesi: 1. il gene malato è associato all allele 1, il gene sano all allele 2 2. il gene malato è associato all allele 2, il gene sano all allele 1 ipotesi 1 ipotesi 2 I nonni sono entrambi deceduti, quindi non abbiamo informazioni sufficienti a capire quale delle due disposizioni è quella giusta. Se analizziamo la progenie, notiamo che tutti i figli malati (tranne uno) portano l allele 1, mentre i figli sani (tranne uno) portano l allele 2. In questi figli, gli alleli 3 e 4 derivano dal padre che è sano, quindi non sono rilevanti ai fini dell analisi. Figli 1. 1 malato 2. 2 sano 3. 1 malato 4. 1 malato 5. 2 sano 6. 2 - malato Ipotesi 1 allele 1 gene malato allele 2 gene sano Ipotesi 2 allele 1 gene sano allele 2 gene malato Nell ipotesi 1, il risultato effettivamente osservato verrebbe ottenuto con un unico evento di ricombinazione. La frequenza di ricombinazione è 1/6, cioè il 16,7%. Nell ipotesi 2, per ottenere il risultato osservato occorrerebbero 5 eventi di ricombinazione. Pur essendo più probabile l ipotesi 1, non si può del tutto escludere l ipotesi 2. Queste incertezze si possono esprimere utilizzando il LOD Score. Se la nonna fosse disponibile, e se si stabilisse che il suo genotipo è 1-5, si potrebbe dire con certezza che in questa famiglia l allele malattia è associato all allele 1. 21

SQUILIBRIO DA LINKAGE La mutazione compare per la prima volta in un soggetto A3, B3/A4, B4 sul cromosoma che porta gli alleli A3 e B3. Per effetto delle vicinanza del locus C rispetto al locus B, la mutazione tenderà ad essere trasmessa ai discendenti insieme all allele B3 (pochi eventi di ricombinazione tra B e C). Invece, potranno verificarsi più crossing-over tra C e A, quindi nelle generazioni il gene mutato si dissocia dall allele A3 che era presente nel cromosoma originario. Se il gene mutato è vantaggioso, si osserverà un aumento della frequenza dell aplotipo B3/C rispetto agli altri aplotipo possibili. Se la mutazione è svantaggiosa si osserverà il contrario. POLIMORFISMI DI SINGOLI NUCLEOTIDI (SNP) Posizioni del genoma in corrispondenza delle quali alcuni soggetti hanno un nucleotide (ad es. G) ed altri uno diverso (ad es. C). Presenti in gran numero nel genoma (circa 1,4 x 10 6 ). Solo alcuni generano RFLP perché la sequenza nella quale si trovano non è riconosciuta da enzimi di restrizione. Possono essere evidenziati con metodi diversi dall elettroforesi su gel. Rivelazione di SNP mediante ibridazione in soluzione Sonda specifica per un SNP, complementarietà non totale con la sequenza normale. Fluorocromo inibito, nessuna fluorescenza visibile. Perfetta complementarietà dovuta ad un SNP: quando c è ibridazione la sonda si apre. Fluorocromo attivo, forte fluorescenza visibile e misurabile per via strumentale. Rivelazione di SNP su filtro mediante oligonucleotidi allele-specifici (ASO) SNP-1 SNP-2 La sonda specifica per SNP-2 non ibridizza con SNP-1 La sonda specifica per SNP-2 ibridizza con SNP-2 Ovviamente, la sonda specifica per SNP-1 darà un risultato complementare. GENETICA DI POPOLAZIONI LEGGE DI HARDY-WEINBERG Condizioni di validità 1. Popolazione di dimensioni infinite 2. Panmissia, cioè incroci casuali 3. Assenza di mutazioni (o equilibrio) 4. Assenza di migrazione tra popolazioni 5. Assenza di selezione (tutti i genotipi hanno lo stesso successo riproduttivo) Premesse 1. Locus singolo con due alleli: A e a 2. Frequenza dell allele A = p 3. Frequenza dell allele a = q 4. p + q = 1 5. 1 q = p In una popolazione panmittica, le frequenze degli alleli e dei genotipi restano costanti di generazione in generazione e sono facilmente deducibili. E più facile che la popolazione sia panmittica per un carattere non visibile come il gruppo sanguigno. 22

EQUAZIONE DI HARDY-WEINBERG Dal momento che ciascun soggetto ha due alleli per un gene, la distribuzione dei genotipi alla generazione successiva è: (p + q) 2 cioè p 2 (AA) + 2pq (Aa) + q 2 (aa) = 1 Ogni soggetto della popolazione deriva dall unione di due gameti nei quali i due alleli A ed a possono presentarsi con probabilità p e q rispettivamente. Quindi, l intera popolazione (quadrato di lato 1) è costituita dalla somma delle frequenze dei tre genotipi possibili. In caso di dominanza completa, i genotipi AA ed Aa avranno uguale fenotipo, quindi non saranno identificabili. In questo caso, il calcolo delle frequenze può essere eseguito basandosi sui soggetti il cui genotipo è certo, vale a dire gli omozigoti per l allele recessivo aa. Esempio Su 100 soggetti è stata determinata l appartenenza al gruppo sanguigno RH. Risultati: RH + = 84 RH - = 16 Calcolo delle frequenze. 16 soggetti su 100 sono aa quindi q 2 = 16/100 quindi q = 16 / 100 = 4/10 cioè 0,4 di conseguenza p = 1 q = 1 0,4 = 0,6 In caso di codominanza, i genotipi omozigoti ed eterozigoti avranno fenotipo diverso, quindi sono facilmente identificabili. In questo caso, il calcolo delle frequenze alleliche può essere eseguito partendo dalle frequenze genotipiche e contando tutti gli alleli presenti nella popolazione. Ciò fornisce un risultato più attendibile. Esempio Su 100 soggetti è stata determinata l appartenenza al gruppo sanguigno MN (M ed N sono codominanti) Soggetti di gruppo M (quindi MM) = 32 Soggetti di gruppo MN (quindi MN) = 48 Soggetti di gruppo N (quindi NN) = 20 Gli alleli M presenti nella popolazione sono (32 x 2 + 48) / 200 = 0,56 = p Gli alleli N presenti nella popolazione sono (20 x 2 + 48) / 200 = 0,44 = q Esempio di locus con più alleli: il gruppo sanguigno AB0 sia p = la frequenza dell allele I A sia q = la frequenza dell allele I B sia r = la frequenza dell allele i e la somma delle frequenze alleliche sia p + q + r = 1 p + q = 1 La distribuzione delle frequenze genotipiche è data dalla seguente tabella: frequenza frequenza gruppo genotipo genotipo gruppo 0 ii r 2 r 2 I A I A p 2 A I A p 2 + 2pr i 2pr I B I B q 2 B I B q 2 + 2qr i 2qr AB I A I B 2pq 2pq La frequenza dei soggetti di gruppo 0 è r 2. Quindi, r equivale alla radice quadrata della frequenza dei soggetti di gruppo 0. La frequenza dei soggetti di gruppo A è p 2 + 2pr. La somma delle frequenze dei soggetti di gruppo A e di quelli di gruppo 0 è p 2 + 2pr + r 2, cioè (p + r) 2. Quindi p + r = A + 0 e di conseguenza p = A + 0 - r 23

La frequenza dei soggetti di gruppo B è q 2 + 2qr. La somma delle frequenze dei soggetti di gruppo B e di quelli di gruppo 0 è q 2 + 2qr + r 2, cioè (q + r) 2. Quindi q + r = B + 0 e di conseguenza q = B + 0 - r Esempio: in una popolazione, la frequenza dei fenotipi osservati è la seguente: gruppo A: 80 gruppo B: 26 gruppo 0: 90 gruppo AB: 6 TOTALE: 202 Calcolo della frequenza r dell allele i: soggetti ii = 90/202 quindi r = 90 / 202 r = 0,66 Calcolo della frequenza p dell allele I A : soggetti A + 0 = 170/202 quindi p + r = 170 / 202 = 0,917 p = 0,91 066 = 0,25 Calcolo della frequenza q dell allele I B : soggetti B + 0 = 116/202 quindi q + r = 116 / 202 = 0,76 q = 0,76 0,66 = 0,1 Nel caso di caratteri legati ad X, un calcolo semplificato delle frequenze alleliche può essere effettuato partendo da un campione di maschi. Ad esempio, su un campione di 100 soggetti di sesso maschile, 9 sono risultati daltonici. Poiché il gene per il daltonismo risiede sul cromosoma X e i maschi sono emizigoti per questo cromosoma, la frequenza dell allele per daltonismo viene ricavata direttamente dal numero di maschi daltonici: 9/100 è la frequenza di maschi daltonici la frequenza q dell allele d è 9/100 = 0,09 la frequenza p dell allele D è 1 0,09 = 0,91 Nella popolazione dalla quale deriva il campione di maschi, le frequenze genotipiche delle donne sono date da: p 2 = 0,91 2 = 0,83 frequenza delle donne DD 2pq = 2 x 0,91 x 0,09 = 0,164 frequenza delle donne Dd (portatrici sane) q 2 = 0,09 2 = 0,008 frequenza delle donne dd (daltoniche) Determinare se una popolazione è in equilibrio (secondo la legge di Hardy-Weinberg) per gli alleli di un determinato gene L M e L N sono due alleli codominanti che determinano il gruppo sanguigno MN. In un campione di 5961 americani di origine caucasica, si trovano le seguenti proporzioni: La differenza tra N oss e N att non è significativa (p=0,19), quindi la popolazione è in equilibrio. Coefficiente di selezione (s): probabilità di un genotipo di non riuscire a riprodursi, dovuta alla selezione naturale: s = 0 tipo più adatto s = 1 carattere letale Fitness: valore adattativo di un genotipo. Viene misurato dal suo contributo proporzionale di progenie alla generazione successiva ed è uguale a 1 s. In una malattia autosomica recessiva, ad ogni generazione si perdono sq 2 geni patologici. Se la frequenza non diminuisce è perché la perdita viene compensata da nuove mutazioni alla velocità di µ(1 sq 2 ), dove µ è il tasso di mutazione per gene per generazione. All equilibrio, sq 2 = µ(1 sq 2 ). Siccome q è piccolo, in pratica µ = sq 2. Per la maggior parte dei geni, µ = 10-5 10-7. Esempio La fibrosi cistica è una malattia rara, determinata dagli alleli F ed f, che colpisce in Italia 1/3250 neonati. Qual è la frequenza dei portatori sani (Ff)? q 2 = 1/3250 = 0,00031 q = 0,0175 p = 0,9825 F Ff = 2pq = 0,0344 cioè 1/29 24

La probabilità che due Ff si incrocino è 0,0344 x 0,0344 = 0,0012. Tra i loro figli 1/4 sarà ff 0,0012/4 = 0,0003, cioè 1/3333, molto simile al 1/3250 osservato. La fibrosi cistica in Inghilterra colpisce 1/2000 neonati. q 2 = 1/2000 = 0,0005 q = 0,022 p = 0,978 Portatori sani F Ff = 2pq = 0,043 cioè 1/23 La probabilità che due Ff si incrocino è 0,043 x 0,043 = 0,0018. Tra i loro figli 1/4 sarà ff 0,0018/4 = 0,0005, cioè 1/2000 come osservato. Per la fibrosi cistica: s = 1 q 2 = 0,0005 quindi µ = 0,0005 = 5 x 10-4 MOLTO IMPROBABILE. Il tasso di mutazione è troppo alto e ci sono prove che nuove mutazioni compaiono molto più raramente. Vantaggio dell eterozigote La frequenza relativamente elevata di alleli che determinano una ridotta fitness negli omozigoti è stata spiegando assumendo che gli eterozigoti (Aa) abbiano una fitness più elevata rispetto ad entrambi gli omozigoti (AA ed aa). Nel caso della fibrosi cistica (CF), si pensa che gli eterozigoti siano più resistenti agli effetti disidratanti di malattie che causano diarrea. Gli eterozigoti per HbS (l allele dell anemia falciforme) hanno un aumentata resistenza alla malaria. Genotipo Frequenza prima della selezione Fitness o 1 selezione Frequenza dopo la selezione AA p 2 1-t p 2 (1-t) Aa 2pq 1 2pq aa q 2 1-s q 2 (1-s) t è il coefficiente di selezione contro il genotipo AA s è il coefficiente di selezione contro il genotipo aa Dopo la selezione, le frequenze genotipiche sono cambiate. La nuova frequenza allelica viene calcolata come segue: q dopo selezione = q ds = [pq + q 2 (1 - s)]/(1 - p 2 t - q 2 s) La variazione della frequenza allelica è la differenza tra q e q ds, ovvero: variazione di q = [pq + q 2 (1 - s)]/(1 - p 2 t - q 2 s q) = pq(pt qs)/(1 - p 2 t q 2 s) In una situazione all equilibrio per vantaggio dell eterozigote, la variazione della frequenza allelica da una generazione all altra dovrebbe essere nulla. Ciò significa che deve verificarsi una delle seguenti condizioni: p = 0, o q = 0 o pt qs = 0 se pt qs = 0, allora pt = qs poiché p = 1 q, allora q eq = t/(s + t) e p eq = s/(s + t) Pertanto, all equilibrio per vantaggio dell eterozigote, le frequenze all eliche sono determinate dai coefficienti di selezione. Vantaggio dell eterozigote Nel caso della fibrosi cistica, siano s1 e s2 i coefficienti di selezione contro i genotipi FF ed ff. All equilibrio, p x s1 = q x s2, cioè s1 = q/p x s2 dato che p = 0,978; q = 0,022 e s2 = 1 s1 = 0,022 Fenotipi FF 1 s1 0,978 Ff 1-0 1,0 ff 1 s2 0 La frequenza degli alleli f verrebbe mantenuta se gli eterozigoti Ff avessero, in media, 2,3% di figli in più rispetto agli omozigoti FF. 25

In condizioni di panmissia e in assenza di selezione, le frequenze alleliche e le frequenze genotipiche non cambiano di generazione in generazione. N soggetti 350 Genotipo AA 180 Genotipo Aa 100 Genotipo aa 70 Fitness AA 1,0000 Fitness Aa 1,0000 Fitness aa 1,0000 Frequenza iniziale A 0,6571 Frequenza iniziale a 0,3429 In condizioni di selezione, gli alleli dannosi possono scomparire e quelli favorevoli fissarsi nella popolazione. N soggetti 280 Genotipo AA 100 Genotipo Aa 150 Genotipo aa 30 Fitness AA 1,0000 Fitness Aa 1,0000 Fitness aa 0,0000 Frequenza iniziale A 0,625000 Frequenza iniziale a 0,375000 Esempio di equilibrio bilanciato in una popolazione nella quale c è vantaggio dell eterozigote: N soggetti 282 Genotipo AA 100 Genotipo Aa 180 Genotipo aa 2 Fitness AA 0,9000 Fitness Aa 1,0000 Fitness aa 0,0000 Frequenza iniziale A 0,8156 Frequenza iniziale a 0,1844 EMOGLOBINE Il 70% delle proteine nella cellula è costituito da emoglobine: prelevano ossigeno a livello degli alveoli polmonari e lo portano ai tessuti periferici; sono presenti nelle cellule in forma solubile. Pseudogene: gene non più attivo. Cromosoma 16 Cromosoma 11 Tra transizione da emoglobina fetale a emoglobina adulta avviene bruscamente al momento della nascita. Esistono molte varianti dell Hb che in diversa maniera riducono l efficienza dell emoglobina. Queste varianti vengono mantenute perché rendono il globulo rosso più resistente ad alcuni parassiti come il plasmodio della malaria. 26

Numero di varianti di Hb Tipo Numero Varianti della catena alfa 199 Varianti della catena beta 335 Varianti della catena gamma: G-gamma = 38 A-gamma = 20 68 Ignote = 3 Speciali = 7 Varianti della catena delta 28 Varianti con 2 sostituzioni amminoacidiche: alfa = 1 18 beta = 17 Varianti a catene ibride 10 Varianti a catene più lunghe: al C-terminale = 9 13 al N-terminale = 4 Varianti con delezioni (15); con inserzioni (4); con delezioni ed inserzioni (3) 22 TOTALE 693 Allineamento dei prodotti dei geni alfa Allineamento dei prodotti dei geni beta delle globine Catena alfa dell emoglobina Localizzazione: 16p13.3 Dimensioni: 141 amminoacidi; 15126 Da Subunità: eterotetramero di: 2 catene alfa e 2 catene beta nell emoglobina A adulta (HbA) 2 catene alfa e 2 catene delta nell emoglobina A2 adulta (HbA2) 2 catene alfa e 2 catene epsilon nell emoglobina embrionale Gower-2 2 catene alfa e 2 catene gamma nell emoglobina fetale (HbF) Dà il colore rosso al sangue. Appartiene alla famiglia delle globine. Catena beta dell emoglobina Localizzazione: 11p15.5 Dimensioni: 146 amminoacidi; 15867 Da Funzione: coinvolta nel trasporto dell ossigeno dai polmoni ai vari tessuti periferici Subunità: eterotetramero di 2 catene alfa e 2 catene beta nell emoglobina A adulta (HbA) Ptm: il glucosio reagisce non enzimaticamente con l N terminale della catena beta per formare un legame chetoaminico stabile. Questo accade lentamente e in continuazione durante la vita di 120 giorni del globulo rosso. Il tasso di glicosidazione aumenta nei pazienti con diabete mellito. Ptm: S-nitrosilata; un gruppo di ossido nitrico è prima legato al Fe(II) (o ione ferro) e poi trasferito al Cys-93 per permettere la cattura dell O 2. Appartiene alla famiglia delle globine. Al momento dello switch da emoglobina fetale a emoglobina adulta, c è una degradazione delle catene gamma che determina l ittero. 27

PRINCIPALI VARIANTI STRUTTURALI DELL EMOGLOBINA Emoglobine con nuove proprietà fisiche HbS HbC Emoglobine instabili Hb Hammersmith Singola sostituzione nucleotidica (β 42 Phe Ser) Varianti che causano anemie emolitiche Polimerizzazione dell HbS deossigenata, cellule falciformi, occlusione vascolare ed emolisi: le cellule falciformi sono più suscettibili di rottura. Tendenza alla cristallizzazione della HbC ossigenata, cellule meno deformabili, blanda emolisi. Nei soggetti HbS:HbC fenotipo a cellule falciformi lieve. Hb instabile, precipitabile, emolisi e bassa affinità per O 2. Hb Hyde Park Singola sostituzione nucleotidica (β 92 His Tyr) Hb Kempsey Singola sostituzione nucleotidica (β 99 Asp Asn) Hb Kansas Singola sostituzione nucleotidica (β 102 Asn Thr) Emoglobine con alterato trasporto di O 2 La sostituzione rende il ferro ossidato dell eme resistente alla metemoglobina riduttasi. Questa HbM non trasporta O 2. Cianosi nei portatori. La sostituzione mantiene la Hb nella struttura ad alta affinità per O 2. Poco ossigeno ai tessuti, policitemia (se c è un ridotto apporto di ossigeno, il midollo produce più globuli rossi La sostituzione mantiene Hb nella struttura a bassa affinità per O 2. Cianosi asintomatica nei portatori. Varianti con fenotipo talassemico HbE La mutazione porta alla sintesi di una Hb anormale e ad una sintesi Singola sostituzione nucleotidica (β 26 Glu Lys) ridotta per difetto di splicing dell RNA. Talassemia lieve. Hb Lepore Sintesi ridotta, talassemia grave negli omozigoti o in soggetti che Crossing over ineguale tra i geni δ e b, proteina di fusione δβ, presentano anche alleli β-talassemici. di lunghezza pari a quella di una catena non-α TALASSEMIE Sono dovute ad un alterazione quantitativa delle α o delle β globine: α-talassemie: difetto di produzione di α-globina β-talassemie: difetto di produzione di β-globina Normale Talassemia α Talassemia β 28

Crossing-over ineguale e generazione di clusters alfa con uno e con tre geni: Talassemia minor: asintomatico. Eterozigote ββ 0 Eterozigote ββ + 29

Talassemia intermedia: sintomatico, ma non richiede trasfusione. Due mutazioni lievi Una mutazione molto lieve + α-talassemia o persistenza di HbF Talassemia maior: sintomatologia grave, richiede trasfusioni. Omozigote β 0 β 0 Eterozigote β 0 β + Mutazioni nel promotore del gene β-globinico che danno origine a talassemia-β + : La mutazione dell emoglobina E Questa mutazione dà origine sia ad un anomalia quantitativa, dovuta all attivazione di un sito donatore di splicing criptico, sia ad una qualitativa, poiché il messaggero maturo corretto contiene una lisina al posto di un acido glutammico, al codone 26. La A al codone 26 è, almeno in apparenza, sufficiente ad attivare questo sito donatore di splicing alternativo, che viene quindi utilizzato il 40% delle volte. MECCANISMO CONSEGUENZA Meccanismi molecolari responsabili di HPFH In A sono mostrate 3 delezioni HPFH che rimuovono grandi segmenti di DNA all estremità 3 del cluster β- globinico, comprendente i geni dell adulto. Tuttavia, non tutte le delezioni di questo tipo sono responsabili di HPFH, come mostrato dalle 3 mutazioni δβ-talassemia rappresentate. In B sono indicate le localizzazioni di mutazioni (numerate rispetto al sito di capping) nel promotore dei geni G γ e A γ delle globine fetali, riscontrate in individui con HPFH (indicati con la freccia sopra la linea). Queste posizioni presumibilmente indicano la posizione di importanti sequenze di controllo, ma nella maggior parte dei casi non coinvolgono i comuni elementi del promotore (CACCC, CCAAT o TATA). La barra al di sotto della sequenza indica la posizione di una piccola delezione in un paziente, che rimuove il secondo CCAAT box. 30