Il checkpoint del fuso mitotico (Pietro Perini-gruppo ciclo cellulare) 1) Prima di approfondire la funzione del checkpoint del fuso mitotico, è opportuno ricordare quali sono le caratteristiche e le funzioni principali del fuso mitotico. La sua funzione è quella di permettere la corretta segregazione dei cromatidi fratelli. Essi restano attaccati per mezzo del cinetocoro fino alla metafase, e la loro segregazione decreta l inizio dell anafase. La formazione del fuso avviene comunque in modo graduale sin dall inizio del processo mitotico. Passando alla struttura del fuso mitotico, è opportuno ricordare che in metafase i microtubuli originano dai poli mitotici e si legano al centromero dei cromatidi fratelli per mezzo dei cinetocori. 2) Dopo l introduzione relativa al fuso mitotico, si passa ora ad analizzare nello specifico l argomento che approfondirò: il checkpoint del fuso mitotico. Esso avviene tra la fine della metafase e l inizio dell anafase ovvero, come ricordato poc anzi, all inizio del processo di separazione dei cromatidi fratelli verso i corrispettivi poli mitotici. In altre parole, il checkpoint del fuso controlla il corretto svolgimento della segregazione cromosomica, aspetto fondamentale per garantire alle due cellule figlie lo stesso assetto cromosomico. La funzione del checkpoint viene esplicata grazie alla generazione del segnale di wait anaphase, qualora si fosse in presenza di alterazioni a carico del processo di segregazione cromosomica. Il segnale di wait anaphase viene mantenuto finche non siano state ripristinate le corrette condizioni per procedere verso l anafase, ovvero finché non sia possibile una corretta segregazione dei cromatidi fratelli. E perciò abbastanza intuitivo dedurre che ogni alterazione a carico del checkpoint del fuso mitotico porti ad aneuploidia, ovvero ad alterazioni del numero dei cromosomi: infatti, se la segregazione dei cromatidi fratelli non avvenisse nel modo corretto, e la cellula non venisse informata di questa anomalia, l anafase potrebbe procedere anche in assenza delle migliori condizioni, e a ciò conseguirebbe un aumento della percentuale di errore del numero dei cromosomi. 3) Ma quali sono gli aspetti controllati dal checkpoint del fuso mitotico? Gli studi effettuati sino a questo punto ne hanno evidenziati due: l attaccamento dei microtubuli ai cinetocori e la tensione esercitata sui cinetocori dopo l attaccamento bipolare dei microtubuli. Per attaccamento bipolare si intende il legame tra microtubuli di un fuso polare e un solo cinetocoro del centromero. E opportuno ricordare che il primo aspetto è l unico dei due ad essere stato comprovato grazie ad esprimenti inconfutabili, mentre il secondo aspetto è
stato ipotizzato, ma mancano prove certe relative alla sua importanza nel processo. 4) Dopo aver trattato gli aspetti generali è opportuno analizzare con maggiore precisione gli aspetti del checkpoint, partendo dagli elementi che lo costituiscono. La tabella illustrata sulla slide mette in evidenza che le proteine che intervengono nel checkpoint sono molteplici, e lo stesso si può affermare riguardo alle loro funzioni. La proteina meglio caratterizzata è Mad2, ritenuta ad oggi uno degli elementi più importanti del checkpoint. Il processo però non vede coinvolte solo le singole proteine, ma anche i complessi che tra esse si formano. In quest ottica è importante ricordare che il complesso Bub3-BubR1 svolge la stessa funzione di Mad2, sebbene non siano ancora chiare le modalità della sua attività. Le funzioni dei diversi elementi verranno trattate in modo più specifico nelle prossime slides. 5) Focalizzandosi sulla funzione di Mad2 (e di riflesso sul complesso Bub3- BubR1 che, come detto in precedenza, ha funzione analoga a quella di Mad2), la figura permette di comprendere come viene generato il segnale di wait anaphase: se uno od entrambi i microtubuli del fuso non sono attaccati ai cinetocori corrispondenti, Mad2 e Bub3-BubR1 formano un complesso con Cdc20 inattivandolo. Quest ultimo è un fattore attivante APC (anaphase promoting complex), un ubiquitina ligasi che è responsabile della degradazione di alcuni elementi implicati nel controllo della progressione in anafase. In particolare, APC legato a Cdc20 poliubiquitina la Securina che in wait anaphase è legata alla Separasi. La rottura del complesso securina- Separasi permette alla Separasi stessa di degradare la Coesina, proteina che, se presente in forma fosforilata, mantiene assemblato il cinetocoro. Questo evento disassembla il cinetocoro permettendo la separazione dei cromatidi fratelli, e ciò corrisponde appunto all inizio dell anafase. 6) A questo punto è lecito chiedersi come viene regolata la formazione del complesso Mad2/Bub3-BubR1/Cdc20. Che cosa sta alla base del processo? Come ho già accennato nel punto 3, un aspetto fondamentale regolato dal checkpoint del fuso mitotico è l attaccamento dei microtubuli del fuso ai cinetocori. A livello molecolare avviene un turnover di Mad2 (illustrato in figura A), che accoppia questo aspetto con l attivazione di APC. Mad2 è presente nel citoplasma cellulare in forma inattiva. Quando il cinetocoro non è legato al microtubulo, Mad2 inattivo può legarsi ad esso grazie all interazione con Mad1, proteina del cinetocoro. La conseguenza del legame è la formazione ed il rilascio di Mad2 attivato che può complessare con Cdc20, rendendo quest ultimo fattore non disponibile per il legame con APC. Nella Figura B è invece illustrato ciò che avviene in presenza del legame microtubulocinetocoro: Mad2 inattivo non può legarsi al cinetocoro, che è occupato dal microtubulo. Questo aspetto impedisce la formazione di Mad2 attivato, e
perciò Cdc20 è libero di interagire con Apc attivandolo. Ciò determina l inizio dell anafase. 7) Due interazioni di Mad2 sono il cuore del checkpoint del fuso mitotico: la prima è l interazione con Mad1, che permette il reclutamento di Mad2 nei cinetocori. La seconda è l interazione con cdc20 che, come si è già detto in precedenza, genera il segnale di wait anaphase. La figura espone ciò che avviene a livello molecolare. Il primo passo verso la comprensione di questo meccanismo è coinciso con la scoperta dell altissima omologia di sequenza che caratterizza una porzione legante di Mad2 delle molecole Mad1 e Cdc20. Per spiegare l interazione con esse, e dunque il funzionamento di Mad2 è stato proposto il seguente modello molecolare, denominato safety belt (cintura di sicurezza): Mad2 ha una sequenza particolare nella porzione C-terminale. Questa porzione agisce come una cintura di sicurezza, permettendo prima l entrata delle molecole che interagiscono con Mad2, e in seguito l uscita delle stesse vincolata a determinate condizioni. In riferimento al ciclo di Mad2, ciò che avviene inizialmente è che la cintura di sicurezza si apra permettendo l interazione con Mad1 (ovvero il reclutamento di Mad2 da parte del cinetocoro non legato al microtubulo). La chiusura della porzione C-terminale di Mad2 impedisce l allontanamento da Mad1, ed avviene una modificazione conformazionale che porta alla chiusura di Mad2. In presenza di Cdc20, con un processo ancora da chiarire, avviene apertura della tasca di Mad2, rilascio di Mad1 e interazione con Cdc20, che rimpiazza Mad1. Si verifica una nuova chiusura di Mad2 che rende Cdc20 inaccessibile per APC. E ben evidente la doppia funzione di Mad2: esso è un componente sia del segnale di wait anaphase, sia della macchina catalica richiesta per generare lo stesso. 8) Dopo avere esposto i processi generali e molecolari che stanno alla base del segnale di wait anaphase, è opportuno elencare quali sono i fattori responsabili del suo silenziamento. E intuitivo, infatti, che qualora esistano le condizioni sufficienti per la progressione in anafase del processo mitotico, il suddetto segnale debba essere interrotto. La conseguenza di ciò è la separazione dei cromatidi fratelli che coincide con l inizio dell anafase. Il fattore più importante che permette l interruzione del segnale di wait anaphase è indubbiamente l avvenuto attaccamento bipolare tra i microtubuli e i cinetocori. In altre parole, entrambi i cinetocori devono essere attaccati ai cinetocori. Il secondo fattore è un ulteriore implementazione del primo (esporrò nelle prossime slides il perché): dev essere presente la tensione esercitata dai microtubuli sui cinetocori, dopo che sia avvenuto l attaccamento bipolare. Esiste poi un terzo fattore che non è stato ancora caratterizzato al meglio: dopo l avvenuto contatto tra microtubuli del fuso e cinecori, alcune molecole del cinetocoro migrano verso il polo generatore del fuso, agendo da regolatori della sua attività.
9) Il primo fattore è già stato esposto in precedenza. In aggiunta a quanto detto, è utile ricordare che le molecole costituenti la porzione del cinetocoro che interviene nell attaccamento ai microtubuli sono da considerare come vere e proprie costituenti del checkpoint del fuso, in quanto sono influenzate da attività regolatoria. Tra esse, particolarmente importante è la dineina. Sono presenti due piattaforme, e i microtubuli interagiscono esclusivamente con la piattaforma esterna. 10) Il secondo fattore importante per l interruzione del segnale di wait anaphase è la tensione esercitata dai microtubuli. Sebbene non esistano prove dirette che ne confermino l esistenza, l ipotesi della sua importanza resta valida: potrebbe infatti avvenire che un microtubulo si leghi ad entrambi i cinetocori, ed è intuitivo che da ciò deriverebbe aneuploidia in quanto entrambi i cromatidi fratelli migrerebbero verso lo stesso polo mitotico. La tensione esercitata che determini il segnale di stop deve essere perciò di intensità sufficiente, ma soprattutto deve avvenire in due direzioni opposte tra loro: ciascuna di esse permette l avvicinamento ad un polo del fuso mitotico. 11) Il terzo fattore che interviene nel silenziamento del segnale è la migrazione dal cinecoro al polo del fuso di alcune molecole facenti parte del checkpoint del fuso mitotico, sfruttando il microtubulo come binario per il movimento dineinico. Come evidenziato dalla figura, le proteine coinvolte sono molteplici: Zw10 e Rod sono coinvolte nella localizzazione della dineina a livello del cinetocoro, CENP-E interagisce con BubR1 e con i microtubuli, ed infine è interessante notare che avviene una migrazione anche di Mad2, la molecola centrale del checkpoint. Intuitivamente, ciò potrebbe essere spiegato come un up-take della stessa Mad2 per diminuirne la disponibilità a livello dei cinetocori. 12) In conclusione, risulta evidente che il checkpoint del fuso mitotico ricopre una notevole importanza all interno del ciclo cellulare e della sua regolazione, in quanto a controlla un processo fondamentale quale è la mitosi. La conoscenza del processo rimane però limitata, e sono in corso attualmente diversi studi che cercano di ampliare le conoscenze attualmente note. In primis, è lecito chiedersi se il segnale di wait anaphase agisca solo su APC oppure se esso venga anche inviato ad un centro di controllo. La domanda è giustificata dal fatto che un solo segnale di wait anaphase (a carico di un solo cromosoma) è sufficiente per interrompere l anafase in tutta la cellula. Un altro aspetto da chiarire è poi come venga stabilizzato il complesso Cdc20, vale a dire come avvengono i meccanismi molecolari del processo (si ricordino i punti in ombra del modello a cintura di sicurezza). Un altro passaggio importante consisterebbe nel fare luce sulla vera natura del complesso Mad2/BubR1- Bub3/Cdc20. Mad2 e Bub3-BubR1 agiscono in competizione o si forma effettivamente un complesso a 4 molecole? Chiarire questi aspetti potrebbe
permettere di capire a fondo i meccanismi del checkpoint del fuso mitotico, e ciò potrebbe essere un aiuto per risolvere, almeno in parte, l aneuploidia, alterazione che a volte ha conseguenze gravi per l organismo, come testimoniano diverse patologie che da essa derivano.
Checkpoint del Fuso Mitotico
Il fuso mitotico La funzione del fuso mitotico è di permettere la corretta segregazione dei cromatidi fratelli La sua attività viene esplicata durante la metafase e soprattutto durante l anafase E composto dai microtubuli, che originano dai poli mitotici e si legano al centromero dei cromatidi per mezzo dei cinetocori
Il checkpoint del fuso mitotico Avviene nei cinetocori tra la metafase e l anafase Controlla il corretto svolgimento della segregazione cromosomica In presenza di alterazioni genera il segnale di wait anaphase Il segnale di wait anaphase viene mantenuto finchè non ci siano le condizioni per procedere all anafase Una qualsiasi alterazione a carico del checkpoint causa aneuploidia
Aspetti controllati dal checkpoint L attaccamento dei microtubuli ai cinetocori La tensione esercitata sui cinetocori dopo l attaccamento bipolare dei microtubuli
Elementi del checkpoint
Ruolo di Mad2 nel checkpoint
Il turnover di Mad2 nel checkpoint
Interazione di Mad2 con i suoi partner
Cosa determina il silenziamento del segnale di wait anaphase? L avvenuto attaccamento bipolare tra microtubuli e cinetocori La tensione esercitata dai microtubuli dopo l attaccamento bipolare La migrazione di alcune molecole del checkpoint dai cinetocori al polo del fuso
Attaccamento microtubulocinetocoro
La tensione esercitata dai microtubuli nel checkpoint
Migrazione di molecole del checkpoint verso il polo del fuso
Aspetti del checkpoint da chiarire Il segnale di wait anaphase inibisce direttamente APC o viene inviato ad un centro di controllo? Come viene stabilizzato il complesso Mad2-Cdc20? Mad2 e BubR1-Bub3 complessano con cdc20 o agiscono su esso in modo separato?