Corso ECM accreditato per le professioni di: Biologo, Chimico, Farmacista, Tecnico della prevenzione nell'ambiente e nei luoghi di lavoro, Tecnico sanitario di laboratorio biomedico, Veterinario DNA BARCODING PER LA TRACCIABILITÀ GENETICO-MOLECOLARE DI PRODOTTI AGRO-ALIMENTARI BREVE PREMESSA La qualità dei prodotti agro-alimentari al giorno d oggi è regolata sempre più da normative comunitarie volte a salvaguardare la salute umana e alla protezione della qualità stessa del prodotto. Una efficiente tracciabilità agro-alimentare, intesa come corrispondenza fra le specie animali e vegetali dichiarate come ingredienti del prodotto e le specie realmente utilizzate nel suo processo produttivo, risulta essere di fondamentale importanza nella lotta alle sempre più frequenti truffe alimentari. Il corso si propone di fornire ai partecipanti conoscenze di base riguardo alla tecnica del DNA barcoding per migliorare l efficienza della tracciabilità agro-alimentare. OBIETTIVI FORMATIVI Fornire aggiornamenti sulle linee guida e i protocolli della tracciabilità alimentare; Apprendere nuove tecniche molecolari che possono essere utilizzate come sistema di identificazione dei prodotti agro-alimentari anche per un operatore non specializzato ; Sviluppare capacità di base nell analisi di sequenze di DNA; Sviluppare la capacità di ricerca in banche dati molecolari pubbliche; METODOLOGIA DIDATTICA Le lezioni frontali relative alle linee guida e ai protocolli della tracciabilità alimentare e quelle relative alle metodiche del DNA barcoding saranno integrate da esercitazioni pratiche mirate all apprendimento delle tecniche di analisi bio-molecolare.
Il supporto di un laboratorio attrezzato per le analisi genetiche permetterà di sperimentare direttamente quanto appreso durante le lezioni frontali. Ad ogni partecipante sarà fornito il materiale a supporto delle lezioni e dell attività di laboratorio, tra cui una dispensa, corredata da bibliografia. DESTINATARI AZIENDA CATEGORIA PROFESSIONALE NUMERO PARTECIPANTI Biologo, Chimico, Farmacista, Tecnico della prevenzione nell'ambiente e nei luoghi di lavoro, Tecnico Max 25 sanitario di laboratorio biomedico, Veterinario TOTALE PARTECIPANTI Max 25 PROGRAMMA GIORNO 10 MARZO 2012 ORARIO CONTENUTI DOCENTI/RELATORI Ore 08:30 08:45 Registrazione dei partecipanti Ore 08:45 09:00 Presentazione del corso Dott.ssa Enrica Capelli Ore 09:00 10:15 Introduzione alla tracciabilità Dott. Augusto Gentilli agro-alimentare Ore 10:15 11:30 Il DNA-barcoding Dott. Maurizio Casiraghi Ore 11:30 11:45 Coffee break Ore 11:45 12:45 Applicazioni DNA-barcoding Dott. Maurizio Casiraghi Ore 12:45 13:00 Confronto dibattito Ore 13:00 14:00 Pausa pranzo Ore 14:00 16:00 Esercitazione di laboratorio genetico Ore 16:00 16:15 Coffee break Ore 16:15 18:15 Esercitazione di laboratorio genetico Ore 18:15 18:30 Prova finale Dott.ssa Adriana Bellati Dott.ssa Adriana Bellati
ABSTRACT DELLE RELAZIONI INTRODUZIONE ALLA TRACCIABILITÀ AGRO-ALIMENTARE Augusto Gentilli Questi ultimi anni hanno visto un fortissimo aumento dell attenzione dei consumatori nei confronti della qualità dei prodotti enogastronomici. Questa nuova tendenza ha avuto come conseguenza, più che positiva, il proliferare di marchi di qualità talvolta riconosciuti in ambito internazionale (DOP, IGP, DOCG, DOC, IGT, STG) altri a livello nazionale o locale (Presidi Slow Food, De.Co., prodotti dei Parchi, ecc); a questi si aggiungono i prodotti biologici o biodinamici certificati da Enti privati autorizzati. Un tale aumento di marchi e conseguenti disciplinari di produzione ha, purtroppo, portato talvolta con sé l impossibilità di verificare il rispetto delle norme produttive previste dai disciplinari stessi nonché l impossibilità da parte del consumatore di essere garantito, non solo sulla salubrità del prodotto, ma anche sul corretto costo in relazione alle caratteristiche organolettiche e produttive dello stesso. Si rende quindi evidente che la messa a punto di tecniche veloci, sicure e standardizzate per verificare almeno alcuni di tali aspetti sarebbe di grande aiuto e sostegno sia per i consumatori sia per i produttori che si preoccupano realmente di fornire prodotti di alta qualità. In tal senso l approccio più adatto attualmente disponibile sembra essere quello biomolecolare e, in particolare, la tecnica del DNA barcoding. Tale tecnica rende possibile, ad esempio, non solo la determinazione esatta della specie a cui appartengono determinate carni (vacca, zebù, capra, pecora, tonno, nasello, ecc.) ma anche l identificazione della razza (ad esempio fassona, chianina, limousine). È evidente l importanza di poter riconoscere, ad esempio, una bresaola IGP prodotta legalmente con carne di zebù da una artigianale derivante da carni di razze bovine autoctone e di qualità. Inoltre, recenti ricerche stanno mettendo a punto nuove tecniche anche per prodotti lavorati in cui siano potenzialmente presenti una o più varietà di una determinata materia prima (ad esempio formaggi di latte misto vaccino e caprino come il bitto DOP oppure vini monovitigno quali il Brunello di Montalcino DOCG che dovrebbe essere prodotto con il solo Sangiovese grosso ma che è noto essere talvolta ingentilito mediante l aggiunta di merlot o di altri vitigni internazionali.). Considerato l elevato costo di alcuni di questi prodotti è fondamentale tutelare i diritti sia dei consumatori sia dei produttori seri che, con sacrifici e fatica, portano avanti onestamente politiche di qualità.
DNA-BARCODING E APPLICAZIONI Maurizio Casiraghi Il DNA barcoding è una tecnica molecolare che ambisce al difficile scopo di identificare le specie biologiche. Sebbene esistessero già tecniche molecolari per l identificazione degli organismi viventi, il canadese Paul H.Hebert propose l approccio DNA barcoding nel 2003, puntando sull analogia tra il codice a barre di un prodotto del supermercato e il DNA contenuto nelle cellule di un organismo vivente. Ovviamente non esiste un codice a barre nel DNA, ma la serie di basi azotate che ne costituiscono la catena possono essere lette e interpretate in maniera tale da discriminare due specie. Questa tematica è particolarmente attuale nel mondo della biologia, perché i ricercatori cercano metodi per identificare le specie da almeno 250 anni. Non sorprende quindi che una tecnica che si propone come la modalità per identificare le specie attiri su di se molto interesse. A partire dal 2003 si sono spese molte parole sul DNA barcoding. La comunità scientifica si è divisa non solo tra sostenitori e detrattori del metodo, ma una terza fascia si è rapidamente diffusa. Si tratta di coloro che non lavorano direttamente con il DNA barcoding e che hanno un idea vaga di cosa si tratti. Questa terza fascia è estremamente eterogenea. È composta da chi, per esempio, si è occupato di filogenesi e filogeografia e ritiene che il DNA barcoding sia un sottoprodotto di queste discipline. Oppure vi ritroviamo un buon numero di genetisti che ancora si interrogano stupefatti sul perché sia necessario cercare uno o pochi marcatori universali per identificare le specie. O ancora annoveriamo quelli che sono convinti che il DNA barcoding sia magicamente in grado di identificare nuove specie (che è poi uno dei grandi proclami dei promulgatori della tecnica). La cosa paradossale è che tutte queste posizioni sono in qualche modo giustificabili, perché esiste una certa confusione anche tra chi la tecnica la utilizza. Quale posizione prendere in questo mare magnum? Il DNA barcoding è una tecnica con dei vantaggi e dei limiti. La grande innovazione non è la capacità discriminatoria e quindi il potere di identificazione delle specie. Il DNA barcoding non è perfetto, perché un sistema perfetto non esiste. Abbiamo tecniche molecolari che sono più sensibili del DNA barcoding. La vera forza del DNA barcoding è che si tratta del più grande e generale sistema discriminatorio che ha introdotto dei rilevanti automatismi e schematizzazioni nella tassonomia. Il tentativo di fornire delle metodiche universali di catalogazione dei reperti biologici, di analisi del dato, di fruizione dei risultati è la vera forza del sistema. Il DNA barcoding è la tecnica ideale per un non addetto ai lavori. L esperto deve mettere a punto il sistema, ma poi è un profano l ideale utilizzatore. Pensiamo a una persona che conosce
abbastanza bene le piante, sa identificare molte specie della flora locale, ma un giorno trova qualche cosa che assomiglia a un insetto su una foglia. Che cos è? Nel passato si doveva rivolgere a un esperto, ma oggi, perfino lui può utilizzare la tecnica generalista del DNA barcoding. Riuscirà a identificare l insetto? Potrebbe, ma potrebbe anche solo andarci vicino. L immagine è quella delle matrioske (la serie di bambole contenuta una nell altra): con la nostra tecnica ci aspettiamo di identificare la bambolina più piccola (la specie?), ma a volte con il DNA barcoding ci fermiamo al livello più alto. Come giudichiamo questo: un successo o un insuccesso? Nella logica DNA barcoding qualunque cosa riduca la nostra incertezza sul piano identificativo rappresenta un risultato apprezzabile. TECNICHE DI CAMPIONAMENTO E ANALISI DNA BARCODING Adriana Bellati L analisi DNA barcoding si basa sulla tecnica di PCR (Reazione di Polimerizzazione a Catena del DNA) che richiede solo piccolissime quantità di DNA di partenza, rendendo possibile l impiego di qualsiasi tipo di campione biologico: sangue, tessuto, liquidi biologici, bulbo pilifero, ecc. Tuttavia, il principale rischio consiste nella possibilità di contaminare il campione, e quindi il DNA da analizzare, già durante la fase di raccolta, o di frammentarlo eccessivamente in seguito a errata manipolazione. Ogni campione biologico è infatti soggetto a degradazione se non adeguatamente conservato. Sebbene il DNA sia molto più stabile di enzimi e proteine in generale, esso è comunque soggetto a degradazione, sia a causa dell azione digestiva delle endonucleasi, enzimi litici normalmente presenti nelle cellule che sono attivi in fase di morte cellulare, sia a causa di agenti esterni biologici (come muffe, funghi, batteri) e fisici (come luce solare, ultravioletta, temperatura e umidità). La quantità di DNA che può essere recuperata da un campione dipende strettamente dalle modalità di conservazione dello stesso. La rigorosa applicazione delle corrette modalità di prelievo, trasporto, trattamento e conservazione del campione è perciò condizione preliminare ed essenziale per garantire l attendibilità dei risultati ottenuti con le tecniche di biologia molecolare. La prima parte dell esercitazione verterà sulle modalità di prelievo e conservazione dei campioni biologici per poter eseguire con successo l analisi DNA barcoding. Utilizzo di guanti, sterilizzazione della strumentazione, modalità di conservazione (congelamento, ETOH assoluto, Silica gel). Verranno quindi presentate le più tradizionali tecniche di estrazione del DNA, amplificazione e sequenziamento del gene Citocromo c ossidasi I (cox I), con il supporto di strumentazione da laboratorio e proiezione di presentazioni in power point che ripercorrono le diverse fasi dei suddetti procedimenti di analisi molecolare. Infine, l ultima parte dell esercitazione sarà dedicata a un aspetto critico dell analisi DNA barcoding, ossia l interpretazione dei risultati ottenuti in laboratorio e l assegnazione del campione di interesse alla corretta specie su base molecolare. A tal proposito, verranno forniti ai partecipanti i
fondamentali rudimenti per l utilizzo dei software bioinformatici dedicati e per la consultazione delle banche dati molecolari primarie disponibili on-line (GenBank, EMBL, DDBJ) e del Barcode of Life Data System (BOLD). In particolare, verranno presentati i principali formati per la visualizzazione delle sequenze nucleotidiche ottenute mediante sequenziamento e per la submission del dato (es. FASTA), i più importanti descrittori per procedere alla ricerca delle sequenze depositate in banca dati e i tradizionali tools per operare correttamente la ricerca di similarità tra sequenze (es. BLAST). RESPONSABILE SCIENTIFICO Enrica Capelli: Ricercatrice presso il Dipartimento di Scienze della Terra e dell Ambiente, Università degli Studi di Pavia DOCENTI Casiraghi Maurizio: Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università degli Studi di Milano Bicocca Gentilli Augusto: Professore a contratto presso la Facoltà di Scienze MM. FF. NN. dell'università degli Studi di Pavia - Membro della Federazione Italiana Sommelier Albergatori Ristoratori (FISAR) Bellati Adriana: dottoranda in Ecologia Sperimentale e Geobotanica presso Dipartimento di Scienze della Terra e dell Ambiente, Università degli Studi di Pavia TUTOR Ghitti Michele: Dipartimento di Scienze della Terra e dell Ambiente, Università degli Studi di Pavia Cocca Walter: Dipartimento di Scienze della Terra e dell Ambiente, Università degli Studi di Pavia Provider: Ufficio ECM - Dipartimento di Scienze del Farmaco Università degli Studi di Pavia V.le Taramelli 12-27100 Pavia Responsabile Prof. Tiziana Modena Tel. 0382 987384 - Cell. 3398866844 Fax 0382 987931 segreteria@ecmunipv.it www.ecmunipv.it