Diss: ETH 26- Okt. 1990 Diss. ETH No 9131 CHROMATIN STRUCTURE DURING TRANSCRIPTION IN THE YEAST SACCHAROMYCES CEREVISIAE A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Stefano Omari Dipl. ETH Natw. born 24. August 1962 Citizen of Locarno (Ticino) Accepted on the recommendation of P.D. Dr. Fritz Thoma, examiner Prof. Dr. Timothy Richmond, co-examiner Cat_ Prof. Dr. Theodor Koller, co-examiner 1990
RIASSUNTO Questa tesi di dottorato si occupa di due temi, concementi la relazione esistente tra struttura e funzione della cromatina nei geni attivi. Entrambi, hanno come oggetto di studio, la cellula di lievito Saccharomyces cerevisiae; un organismo eucariota che per la sua semplicitä si presta in maniera ideale per gli studi a livello biologico-molecolare. II materiale genetico di tutte le cellule eucariotiche e condensato dagli istoni, proteine che con il DNA formano i nucleosomi. La RNA polimerasi deve poter leggere il DNA; e concepibile che i nucleosomi possano restare associati con il DNA, che vengano destabilizzati o che vengano distrutti dal passaggio della polimerasi. Abbiamo analizzato questa problematica, partendo da differenti ipotesi di lavoro che abbiamo poi verificato nella cellula di lievito Saccharomyces cerevisiae. La prima presa in considerazione, e che la stabilitä dei nucleosomi durante la trascrizione dipenda dalla frequenza con la quäle il DNA viene trascritto. II gene di lievito URA3, possiede dei nucleosomi che risultano posizionati in maniera molto chiara (Thoma, 1986). Questo gene e scarsamente trascritto; per tale ragione, abbiamo sostituito il suo promotore con quello dei geni GAL1-10, con lo scopo di analizzare la stabilitä dei nuclesosomi durante la trascrizione sul gene URA3. II promotore divergente GAL1-10 e indotto qualora il medium contenga galattosio e represso se contiene glucosio quäle fönte di carbonio. Non abbiamo potuto constatare alcuna differenza tra lo stato represso dei gene artificiale e quello indotto, un risultato che suggerisce che la RNA polimerasi puö trascrivere il DNA nonostante la presenza di nucleosomi in vivo senza comprometterne la stabilitä. Un altro possibile fattore che potrebbe influenzare il destino dei nucleosomi durante la trascrizione e la sequenza dei DNA di un gene. Questa seconda ipotesi e stata vagliata con la costruzione di un altro gene artificiale, GAL-RIBURA, contenente un frammento di DNA dei gene ribosomale di Dictyostelium discoideum. Tale gene e stato analizzato in un Plasmide extracromosomale ed integrato nel genoma di lievito. La stabilitä dei nucleosomi sulla sequenza URA3 durante la
5 trascrizione e risultata immutata, mentre i nucleosomi associati con la sequenza di gene ribosomale, sono stati dissociati o destabilizzati dal passaggio della RNA polimerasi. Concludiamo perciö che le due differenti sequenze, posseggono differenti affinitä per gli istoni. Questi risultati dovrebbero essere complementati con altri esperimenti miranti a chiarificare se esista una correlazione tra attivitä di trascrizione ed affinitä di una data sequenza per gli istoni. NeH'ambito dei secondo tema svolto in questa tesi, ci siamo occupati della stabilitä dei nucleosomi esistenti nella regione dei promotore In lievito. E stato suggerito che tratti comprendenti poly(da).poly(dt) in S.cerevisiae agiscano come elementi di promotori costitutivi, esciudendo la formazione di nucleosomi (Struhl, 1985a). Abbiamo analizzato la struttura a livello di cromatina in tale regione nel locus pet56-his3-ded1 e visto che essa e priva di nucleosomi. In esperimenti effettuati in vitro, abbiamo dimostrato che frammenti di DNA contenenti il tratto poly(da).poly(dt), possono formare nucleosomi con efficienza simile ad altri che non lo comprendono. Quindi la peculiare sequenza da sola, non basta ad esciudere i nucleosomi, ma altri fattori contribuiscono a definire la regione priva di nucleosomi.
SUMMARY This thesis is divided into two main topics of research: both focus on the relationship between the structure and the function of chromatin in active genes. Both projects used as model organism the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae, a lower eucaryote that is an ideal system for chromatin studies. The DNA of all eukaryotic cells is densely packaged by histone proteins in a linear array of nucleosomes. Since the histones might interfere with the RNA-polymerases, nucleosomes might be stable, unstable or they might dissociate during transcription. We tested different working hypotheses by constructing gene fusions in the yeast Saccharomyces cerevisiae. It is conceivable that the stability of nucleosomes might depend on the rate of transcription. The URA3 gene has clearly positioned nucleosomes (Thoma, 1986) but is poorly transcribed by its own promoter. We substituted the URA3 promoter by the strong GAL1-10 promoter to test whether the transcription rate might influence the stability of the nucleosomes on the URA3 coding region. The GAL promoter is induced in media containing galactose as carbon source and repressed in glucose media. We did not observe any detectable difference in the stability of nucleosomes in the GAL-URA fusion between the repressed State and the transcriptionally active State, which suggests that the RNApolymerase II can transcribe through nucleosomes in vivo without displacing them. Alternatively, the stability of nucleosomes might depend on the DNA sequence. This hypothesis was tested in another fusion gene, GAL-RIBURA, containing a fragment of the ribosomal-rna-gene of Dictyostelium discoideum. The stability of the nucleosomes in the fusion gene was analyzed in a extrachromosomal plasmid and intrachromosomaily. The results indicated that the nucleosomes on the URA3 part remain stable while nucleosomes on the ribosomal part are displaced or destabilized by the passage of the RNA-polymerases. My preliminary conclusion is that the two DNA sequences have different affinities for the histone octamers.
In a second project, I tested the stabilty of nucleosomes assembled on the promoter region of yeast. It was suggested that poly(da)poly(dt) tracts in the yeast Saccharomyces cerevisiae act as elements of constitutive Promoters by exclusion of nucleosomes (Struhl, 1985). I have mapped the chromatin structure of the pet56-his3-ded1 region in minichromosomes and shown that the poly(da)poly(dt) tracts are located in nuclease sensitive regions. In vitro reconstitution and competition experiments demonstrated that the naturally occurring poly(da)poly(dt) tract of the DED1 promoter was able to form nucleosomes with the same efficiency as DNA-fragments missing the poly(da)-poly(dt) tract. The poly(da)-poly(dt) tract per se does not exclude nucleosomes. The competition experiments developed in this work can be used to estimate the affinity of the histone octamer of various sequences.