Proliferazione cellulare: CFSE staining La CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidyl ester) e una molecola fluorescente lipofilica, in grado di diffondere liberamente attraverso la membrana cellulare. All interno della cellula i gruppi acetati sono rimossi da esterasi, convertendo la CFSE in una molecola non piu in grado di attraversare la membrana. CFSE rimane nel citoplasma della cellula per diverse settimane, e non risulta dannosa per la funzionalita cellulare. La CFSE non e trasferita alle cellule adiacenti. Tale caratteristiche vengono sfruttate per studiare la proliferazione in un modo cosi dettagliato mai raggiunto in precedenza. Tramite citofluorimetro si possono seguire fino a 8-10 divisioni cellulari. CFSE può essere utilizzata sia in vitro che in vivo: le cellule possono essere marcate con questo colorante e lasciate crescere in coltura; possono essere rimosse da un animale, colorate con CFSE, e nuovamente inserite nell animale donatore.
Proliferazione cellulare: CFSE staining Durante la divisione cellulare, ogni cellula figlia ereditera una quantita di CFSE che corrisponde esattamente alla meta di quella presente nella cellula madre, quindi la sua fluorescenza (green) sara la meta rispetto a quella della cellula da cui deriva. Ad ogni successiva divisione il livello di fluorescenza dimezzera (two fold reduction), permettendo cosi di monitorare, tramite citofluorimetria, il numero di divisioni cellulari. Dividing cells Undivided cells Uno specifico programma puo essere utilizzato per determinare quante cellule appartengono ad ogni generazione
[3H]-timidina and Bromodeoxyuridine Gli studi sulla capacita proliferativa delle cellule T fondamentalmente utilizzano: Uptake di [3H]-timidina in seguito a stimolazione con antigeni o mitogeni. Limiti: non permette di discriminare la popolazione cellulare responsabile della proliferazione misurata; non permette di discriminare tra un ciclo o diversi cicli di divisione cellulare; richiede l utilizzo di sostanze radioattive. Incorporazione di Bromodeoxyuridine (BrdU). E un anologo della timidina. In seguito ad incubazione con BrdU, le cellule che stanno sintetizzando DNA (fase S del ciclo) incorporeranno BrdU al posto della timidina nel loro DNA. Tali cellule possono essere identificate utilizzando un anticorpo Anti-BrdU, in grado di riconoscere specificatamente BrdU ma non timidina. La percentuale di cellule nella fase S del ciclo può essere determinata usando microscopia a fluorescenza o citofluorimetria. Limiti: non permette di discriminare tra un ciclo o diversi cicli di divisione cellulare; richiede l utilizzo di un anticorpo anti-brdu; richiede la permeabilizzazione delle cellule
Proliferazione cellulare: CFSE staining La tecnica basata sulla CFSE presenta numerosi vantaggi, in particolare: Non si utilizzano sostanze radioattive Non necessita l utilizzo di anticorpi Permette di studiare i livelli di proliferazione in specifiche subpopolazioni cellulari Permette di determinare contemporaneamente l espressione di altri markers (di attivazione, di funzionalità, apoptotici, ecc) Utilizzando CFSE è possibile recuperare cellule vitali da utilizzare per successive analisi.
Esempi di CFSE staining M. Connors, Nature Immunology 2002 T. Becker, J. Immunology 2005
STUDIO DELLE PROTEINE FOSFORILATE La fosforilazione di specifici residui di tirosina, serina, e treonina costituiscono uno step chiave nel controllo della attività di proteine coinvolte in numerosi processi cellulari. Tale fosforilazione è regolata da un complesso assortimento di chinasi e fosfatasi, che regolano numerosi cell signaling pathways, come quelli dell apoptosi, della crescita cellulare, del controllo del ciclo cellulare, della risposta allo stress, alle citochine, alle chemochine, ecc ecc. Molto recentemente lo studio dei livelli di fosforilazione delle proteine ha avuto un notevole impulso grazie all avvento degli anticorpi fosfo-specifici, in grado di riconoscere la proteina contro la quale sono stati generati esclusivamente se presente nella sua forma fosforilata. Questi anticorpi permettono di studiare i livelli di fosforilazione (quindi attivazione) di numerose proteine (anche se ancora per numerose proteine non è disponibile l anticorpo contro la forma fosforilata) grazie alla tecnica del Western blotting, immunoprecipitazione, microscopia a fluorescenza, ELISA.
STUDIO DELLE PROTEINE FOSFORILATE Le tecniche maggiormente utilizzate per lo studio delle proteine fosforilate (Western blotting, Immunoprecipitazione, microscopia a fluorescenza) presentano alcuni limiti. In particolare: richiedono quantità abbastanza grandi di campione sono time-consuming non producono risultati realmente quantitativi non è possibile fare analisi multiparametriche sul singolo campione
Phosphoprotein Flow Cytometry Profiling: a new revolutionary approaches to phosphoprotein analysis. This technology combines phospho-specific antibodies with the power of flow cytometry to enhance phosphoprotein study in ways not before possible. Definizione un po di parte (da BD Biosciences) ma vera!!! La citofluorimetria rappresenta una tecnica molto importante per lo studio dei livelli di fosforilazione delle proteine. Presenta diversi vantaggi rispetto alle altre tecniche: richiede piccole quantità di campione la procedura richiede poco tempo fornisce risultati quantitativi permette di analizzare la fosforilazione a livello delle singole cellule e su distinte subpopolazioni cellulari permette di effettuare l analisi multiparametrica, quindi di combinare i phosphospecific antibodies con altri markers.
Phosphoprotein Flow Cytometry Profiling NB: misurare i livelli di fosforilazione di proteine intracellulari tramite citofluorimetro non è un processo semplice. E necessaria una dettagliata ottimizzazione sia del protocollo che dei reagenti. Nel processo di ottimizzazione è inoltre necessario confermare il risultato ottenuto in citofluorimetria con quello ottenuto con metodi più tradizionali come il Western blotting. Tuttavia, una volta che il procedimento è stato ottimizzato, la citofluorimetria offre molti vantaggi rispetto ai metodi classici.
Citofluorimetria vs Western blotting Western blotting Nessuna differenza 1 2 3 Citofluorimetria DIFFERENZA
Phosphoprotein Flow Cytometry Profiling
Phosphoprotein Flow Cytometry Profiling 250 10 4 SSC-H: SSC-Height 200 150 100 50 FL3-H: CD4 PerCP 10 3 10 2 10 1 0 0 50 100 150 200 250 FSC-H: FSC-Height 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL1-H: CD8 FITC
CITOMETRIA A FLUSSO DOMANI!!! The BD FACSAriaTM cell sorter sets a new standard for high performance flow cytometry. Based on a revolutionary new design in instrumentation, this easy-to-use benchtop system delivers high-speed sorting and multicolor analysis. BD FACSAria Cell Sorting System * Cuvette flow cell for superior fluorescence sensitivity * Up to three air-cooled lasers at 488-nm, 633-nm, and 407-nm wavelengths * Digital acquisition rates of up to 70,000 events/second * Multicolor analysis of up to 15 parameters * Two- and four-way bulk sorting devices for a variety of tube sizes
CITOMETRIA A FLUSSO DOMANI!!! LSR II is fully configurable with one to four lasers: Blue laser 20 mw @ 488 nm; Violet laser 25 mw @ 407 nm; UV laser 20 mw @ 355 nm HeNe laser 18 mw @ 633 nm. La possibilita di utilizzare fino a 4 laser, e di conseguenza le numerose opzioni di fluorocromi, rende LSRII il piu completo e versatile citofluorimetro attualmente disponibile. Inoltre potendo scegliere tra un ampio numero di fluorocromi, e possibile ridurre l overlap dei segnali ed aumentare la sensibilita.
CITOMETRIA A FLUSSO DOMANI!!! Fluorocromi utilizzabili per la creazione di un pannello multiparametrico in LSR II Green FITC Alexa Fluor 488 EGFP Yellow PE EYFP
This is the emission spectra of an 11 color experiment
Analisi ad 8 colori con LSR II FITC PE PerCp APC AI700 PE- Cy7 APC- Cy7 PacBlue U FITC x PE x PerCp x APC x AI700 x PE-Cy7 x APC-Cy7 x PacBlue x Tube #1 CD45RA CD127 CD8 CD28 CD4 CCR7 CD25 CD3 Tube #2 CD45RA CD28 CD8 CD127 CD4 CCR7 CD25 CD3
DOVE ARRIVERA MARIO ROEDERER??? Nat Med 2003 Nat Rev Immunol 2004
DOVE ARRIVERA MARIO ROEDERER???