MICROSCOPIA 1 IL MICROSCOPIO OTTICO Il microscopio ottico composto, comunemente chiamato microscopio, è uno strumento che permette di osservare oggetti non percettibili ad occhio nudo consentendone l ingrandimento. E costituito dalla combinazione di due sistemi di lenti convergenti: l oculare (vicino all occhio dell osservatore) e l obiettivo (prossimo all oggetto). Il campione da osservare viene posto davanti all obiettivo, che ne fornisce un immagine reale, capovolta ed ingrandita. L immagine viene poi fatta cadere, a distanza opportuna, davanti all oculare, che a sua volta dà un altra immagine virtuale ingrandita e capovolta rispetto all originale. In pratica non vi sono solo due lenti, ma una combinazione di più lenti che, oltre ad ingrandire l immagine, corregge e riduce le aberrazioni. 1- oculari 2- obiettivo 3- tavolino porta oggetti 4- vite micrometrica 5- vite macrometrica 6- condensatore con diaframma 7- vite regolatrice del tavolino 8- oggetto da osservare 9- lente obiettivo 10- immagine reale ingrandita e capovolta 11- lente oculare 12- immagine virtuale ingrandita e capovolta rispetto all originale
Come si nota dalla fotografia obiettivo ed oculare sono inseriti all estremità di un tubo metallico, chiamato tubo ottico, appoggiato su un sostegno detto stativo, che regge anche il tavolino porta oggetti dove viene posto il campione da osservare. La distanza tra obiettivo e campione si può variare con un movimento a cremagliera del tubo, regolato da due viti, quella macrometrica per spostamenti rapidi e quella micrometrica per la messa a fuoco. Una vite posta al di sotto del tavolino consente lo spostamento del preparato da osservare. Sempre inferiormente al tavolino si trova anche il condensatore, che fa convergere sull oggetto la luce prodotta da una lampadina incorporata nel microscopio. Il condensatore è munito di un diaframma regolabile, che varia l intensità luminosa. Vicino all interruttore della lampadina c è un variatore di tensione che regola la quantità di luce emessa dalla lampadina. Gli obiettivi, di cui è dotato un microscopio, sono di solito più di uno, per dare la possibilità all operatore di lavorare con ingrandimenti diversi. Per conoscere l ingrandimento degli oculari e degli obiettivi è sufficiente leggere il numero associato ad una x (unità di misura in diametri) riportato su ciascuna lente. L ingrandimento totale del microscopio è il prodotto dell ingrandimento dell oculare moltiplicato per quello dell obiettivo. L ingrandimento è solo una delle principali caratteristiche di un microscopio. Un altra caratteristica fondamentale è il potere di risoluzione ossia la capacità che possiede uno strumento di distinguere due oggetti vicini. Il microscopio ottico ha un potere di risoluzione di 0,2 µm, cioè non può distinguere dettagli posti ad una distanza inferiore a 0,2 µm. Tale limite è determinato dal mezzo che si usa per ingrandire l immagine, che in questo caso è la luce (bianca), come indica la parola ottico. Il potere di risoluzione è proporzionale alla lunghezza d onda della luce. Il microscopio ottico ha una risoluzione 1.000 volte più grande di quello dell occhio umano che è di circa 0,2 mm. 2 COME SI USA IL MICROSCOPIO 1. Mettere il vetrino sul tavolino porta oggetti e fissarlo con le apposite graffette; accendere la luce. 2. Regolare la distanza interpupillare dei due oculari avvicinandoli o allontanandoli in modo da osservare un unico campo luminoso. 3. Osservare con l obiettivo più piccolo(4x). L utilizzo di questo obiettivo permette un campo visivo più vasto e consente la selezione rapida delle zone meglio riuscite. La prima messa a fuoco del campione viene fatta con la vite macrometrica, che avvicina il tavolino porta oggetti all obiettivo fino a che non si intravede l immagine, quindi si completa la messa a fuoco utilizzando la vite micrometrica. 4. Effettuare la regolazione della differenza tra l acutezza visiva degli occhi. Chiudere l occhio sinistro e mettere il preparato a fuoco osservando con l occhio destro utilizzando la vite micrometrica. Chiudere poi l occhio destro e, osservando con l occhio sinistro, mettere a fuoco utilizzando l anello di rettifica del fuoco presente sull oculare. 5. Aggiustare l intensità della luminosità del campo usando il variatore di tensione, non usare il diaframma 6. Regolare il diaframma, chiudendolo o aprendolo lentamente, fintanto che l immagine non ha raggiunto il contrasto ottimale. Questa operazione va fatta ogni volta che si cambia obiettivo. 7. Inserire gradualmente gli obiettivi ad ingrandimento superiore secondo l esigenza dell osservazione. Quando dall obiettivo 4x si passa agli obiettivi 10x e 40x il fuoco sostanzialmente non cambia, perciò, per ottimizzare l immagine, basterà usare la vite micrometrica. Quando si mette a fuoco si possono osservare bene tutte le strutture presenti su un piano; tutto ciò che si trova sotto o sopra questo piano è invisibile. Per vedere l oggetto nella sua tridimensionalità si deve muovere con piccoli spostamenti la vite micrometrica (fochettatura), in modo da osservare i piani posti superiormente o inferiormente a quello di riferimento.
8. Al termine del lavoro, riposizionare l obiettivo 4x, spegnere la lampada e pulire il tavolino porta oggetti. 3 PULIZIA DELLE LENTI Per pulire gli oculari e gli obiettivi è necessario prima di tutto rimuovere la polvere con un soffietto, quindi con un cotton fioc imbevuto di alcol al 70% si detergono le lenti con un movimento a spirale. TECNICA DI PREPARAZIONE DI UN VETRINO A FRESCO Questa semplice tecnica consente la preparazione di vetrini senza l utilizzo di coloranti. Nel caso si voglia seguire questa metodica è necessario che il campione offra un contrasto sufficiente per evidenziare le diverse parti. Ad esempio, cellule vegetali già naturalmente colorate, come quelle che contengono i cloroplasti o i cromoplasti, non richiedono alcuna colorazione, anzi, se colorate, l immagine risulta poco chiara e di difficile interpretazione. Materiali: Vetrino portaoggetti e coprioggetto Acqua distillata Strumenti per maneggiare e prelevare il campione da osservare: pinzette, forbici ecc.. Campione da osservare Procedimento: Preparare il campione da osservare facendo attenzione che sia di piccole dimensioni ( deve essere più piccolo del coprioggetto) e sottile ( deve essere trasparente per fare passare la luce del microscopio). Appoggiare sul vetrino il preparato cercando di distenderlo il più possibile ( il campione è sottile e si piega facilmente) Lasciare cadere sul preparato 1 o 2 gocce di acqua distillata. Coprire il preparato con il coprioggetto: appoggiare un lato del coprioggetto sul vetrino, quindi lasciarlo cadere lentamente. Questo accorgimento limita la formazione di bolle d aria, nel caso queste si formino ugualmente con le pinzette picchiettare leggermente sul coprioggetto ed asciugare con la carta da filtro l acqua che potrebbe fuoriuscire dal coprioggetto Mettere il vetrino sul tavolino portaoggetti ed osservare. TECNICA DI PREPARAZIONE DI UN VETRINO COLORATO Questa tecnica, a differenza di quella precedente, fa uso del colorante ed è indicata in tutti quei casi in cui il campione non possiede contrasto. Il tipo di colorante va scelto in base alle diverse esigenze dell osservazione. Materiali: Vetrino portaoggetti e coprioggetto Acqua distillata Strumenti per maneggiare e prelevare il campione da osservare: pinzette, forbici ecc.. Campione da osservare Colorante
Procedimento: Preparare il campione da osservare facendo attenzione che sia di piccole dimensioni ( deve essere più piccolo del coprioggetto) e sottile ( deve essere trasparente per fare passare la luce del microscopio). Mettere il campione in un recipiente tipo lente a orologio o piastra ed aggiungere 1 o 2 gocce di colorante. Attendere il tempo di fissaggio che dipende dal tipo di colorante utilizzato. Il fissaggio è il tempo che occorre al colorante per essere assorbito dal preparato. Lavare il campione in acqua di fonte per eliminare l eccesso di colorante. Appoggiare sul vetrino il campione cercando di distenderlo il più possibile ( il campione è sottile e si piega facilmente) Lasciare cadere sul campione 1 o 2 gocce di acqua distillata. Coprire il campione con il coprioggetto: appoggiare un lato del coprioggetto sul vetrino, quindi lasciarlo cadere lentamente. Questo accorgimento limita la formazione di bolle d aria, nel caso queste si formino ugualmente, con le pinzette picchiettare leggermente sul coprioggetto ed asciugare con la carta da filtro l acqua che potrebbe fuoriuscire dal coprioggetto. Mettere il vetrino sul tavolino portaoggetti ed osservare. N.B. I vetrini preparati con questa tecnica non si possono conservare, nel caso si voglia mantenerli per qualche ora si possono chiuderei bordi del coprioggetto con smalto trasparente per unghie. 4 COLORANTI Per osservare semplici preparati vegetali si usano coloranti che per le loro caratteristiche chimiche evidenziano selettivamente alcune parti cellulari. Coloranti più utilizzati Eosina Rosso neutro Ematossilina Blu di metilene Blu di toluidina Lugol Carminio acetico Parti colorate citoplasma citoplasma nucleo nucleo e parete cellulare nucleo granuli di amido cromosomi IMMAGINI Striscio ematico con granulocita neutrofilo. Sezione trasversale di tessuto in cui sono evidenti il canale di Havers, le lacune ossee ed i canalicoli ossei.
IL MICROSCOPIO ELETTRONICO 5 Nel microscopio elettronico la radiazione utilizzata per "illuminare" il campione da osservare è costituita da un fascio di elettroni, fatto convergere per mezzo di lenti elettromagnetiche. L'immagine ottenuta può essere visualizzata direttamente su un monitor o essere fissata fotograficamente. Il potere risolutivo è più di mille volte superiore a quello dei microscopi ottici. Con il microscopio elettronico è possibile distinguere strutture che hanno dimensioni inferiori al nanometro (1 milionesimo di millimetro). A seconda che l'immagine sia prodotta dagli elettroni trasmessi da un preparato ultrasottile, oppure da quelli riflessi dalla superficie scabrosa di un campione, si distinguono il microscopio elettronico in trasmissione (TEM) e quello a scansione (SEM). IMMAGINI Linfocita B infettato dal virus dell\rquote epatite C (indicato dalle frecce) visto al TEM. Cellula di colon umano infettata da un batterio vista al SEM.