La patologia clinica

Il sangue Funzioni: Di trasporto Hb (contenuta nei globuli rossi): trasporta l'ossigeno (O 2 ) ai tessuti e preleva l'anidride carbonica (CO 2 ) trasporta sostanze nutritive (amminoacidi, zuccheri, sali minerali), e raccoglie i prodotti del metabolismo che devono essere eliminati attraverso il filtro renale trasporta ormoni, enzimi e vitamine Altro: presiede alla difesa dell'organismo (fagocitosi, risposta immunitaria)

IL PLASMA Parte liquida del sangue ph leggermente alcalino (7,4), caratteristico colore giallino costituito per il 90 % da acqua, in cui sono contenute sostanze organiche (glucidi, lipidi, proteine, ormoni, aminoacidi e vitamine ) e minerali (disciolti sottoforma ionica, cioè dissociati in ioni positivi e negativi)

Il sangue Sospensione di cellule in un liquido chiamato plasma costituisce circa 1/12 del peso corporeo di un uomo adulto (5-6 litri) costituito per il 55 % da plasma, per il 45 % da cellule (elementi figurati)

Le cellule del sangue Globuli rossi Leucociti Piastrine Granulociti Neutrofili Eosinofili Basofili Linfociti Monociti

ERITROCITI (globuli rossi) 4-6 milioni /mmc vita media 120 giorni privi di nucleo, a forma di disco biconcavo (7 x 2,5 μm ) contengono emoglobina, proteina capace di legarsi all O 2, a livello alveolare polmonare, e di cederlo a livello periferico (respirazione tessutale) forniscono O 2 ai tessuti, recuperando la CO 2 prodotta come scarto (la maggior parte della CO 2 è trasportata dal plasma sotto forma di carbonati in soluzione)

Eritrociti al microscopio a scansione

ERITROCITI (globuli rossi) La loro produzione è regolata da un ormone, la ERITROPOIETINA, prodotta dal rene in funzione del grado di ipossia Struttura: membrana lipoproteica plastica e deformabile; il citoplasma contiene emoglobina in soluzione Metabolismo: glicolisi anaerobia per il mantenimento della membrana e del gradiente osmotico Na + K +

La membrana eritrocitaria Rappresentazione schematica della membrana eritrocitaria: A) componente 3; B) glicoforina. I radicali ramificati sulla loro superficie sono carboidrati che portano gruppi sanguigni e recettori virali; C, D, E) proteine «periferiche»: C) spectrina; D) actina; E) anchirina.

I leucociti (globuli bianchi) Diversi tipi cellulari: granulociti cellule linfoidi monociti Granulocita = cellula contenente granuli nel citoplasma (a differente affinità verso i coloranti neutri, acidi) Il tipo di granulazioni distingue diversi tipi di granulociti: neutrofili, eosinofili (o acidofili), basofili. Altro elemento distintivo delle diverse cellule leucocitarie è la forma del nucleo

Formula leucocitaria Ciascun tipo di leucocita è presente nel sangue in proporzioni diverse: neutrofili 50-70 % linfociti 20-40 % monociti 3-8 % eosinofili 2-4 % basofili 0,5-1 %

Granulociti neutrofili Capaci di fagocitosi, sono presenti in grandi quantità nel pus; non rinnovano i lisosomi utilizzati nel digerire i microbi e muoiono dopo averne fagocitati alcuni

Aggrediscono i parassiti e fagocitano i complessi antigeneanticorpo

Secernono sostanze che mediano le reazioni di ipersensibilità, sostanze anticoagulanti, sostanze vasodilatatrici, come l'istamina e la serotonina

I linfociti Presenti nel sangue, negli organi e tessuti linfoidi, nella linfa Organi linfoidi : timo, midollo osseo, milza, linfonodi, tonsille palatine, placche di Peyer e tessuto linfoide dei tratti respiratorio e digerente Dimensioni leggermente superiori a quelle dei globuli rossi Nucleo compatto che occupa quasi tutto il volume cellulare La maggior parte dei linfociti circolanti nel sangue si trova allo stato di riposo Possono essere attivati in varia misura a seguito della stimolazione antigenica

I linfociti Costituenti principali del sistema immunitario Rappresentano il 25-40% dei leucociti circolanti

I monociti Grosse dimensioni ; nucleo lobulato e frequente presenza di vacuoli citoplasmatici Nel circolo ematico : 24-36 ore, poi migrano nel tessuto connettivo, dove diventano macrofagi In presenza di un focolaio infiammatorio migrano attivamente dai vasi sanguigni iniziando una intensa attività fagocitaria Producono sostanze con funzioni difensive ( lisozima, interferoni ), ed altre sostanze che modulano la funzione di altre cellule Cooperano nella difesa immunitaria, esponendo sulla membrana molecole delle sostanze digerite che presentano alle cellule specializzate (linfociti Th e B).

Le piastrine Frammenti di una cellula progenitrice detta megacariocita, hanno forma di disco (diametro 2-3 µm); rimangono in circolo per circa 10 giorni Un terzo delle piastrine del pool circolante è sequestrato nella milza Principali funzioni: proteggere l integrità dell endotelio vascolare avviare il processo di riparazione quando la parete del vaso viene danneggiata (emostasi primaria)

Le piastrine Formazione del tappo piastrinico

Tabella riassuntiva delle caratteristiche degli elementi corpuscolati del sangue

Reticolociti Globuli rossi giovani, contengono ancora residui di RNA ribosomiale, evidenziabile con i coloranti vitali (blu di cresile brillante) Da qualche anno il conteggio può essere effettuato anche con metodo automatico, mediante l uso di citofluorimetri a flusso che ne rileva la fluorescenza assunta dopo esposizione a un fluorocromo specifico per gli acidi nucleici.

Mielopoiesi EMOPOIESI - eritropoiesi - granulo-monocitopoiesi - piastrinopoiesi Linfopoiesi Ogni giorno, per ogni Kg di peso corporeo, vengono rinnovati: 3,2 miliardi di eritrociti 1,6 miliardi di granulociti 1,4 miliardi di piastrine

La mielopoiesi La emopoiesi. Le cellule staminali e la loro progenie proliferano, differenziano e maturano sotto l influenza ed il controllo di numerosi fattori microambientali ed umorali, per i quali possiedono dei recettori specifici.

La mielopoiesi Tessuto mielopoietico (midollo osseo): ha sede nelle ossa a struttura spugnosa (ossa brevi, ossa piatte, estremità prossimali delle ossa lunghe) cellula staminale totipotente: capace di automantenersi alimentando costantemente il pool delle cellule staminali commissionate hanno un programma geneticamente determinato che devono eseguire

PROERITROBLASTO ERITROPOIESI Tempo di produzione 5 giorni ERITROBLASTO BASOFILO I ERITROBLASTO BASOFILO II ERITROBLASTO POLICROMATOFILO I Il citoplasma cambia dal blu all arancione diminuzione di RNA aumento in emoglobina GLOBULI ROSSI ERITROBLASTO POLICROMATOFILO II RETICOLOCITA Nucleo sempre più piccolo Cromatina sempre più aggregata ERITROBLASTO ORTOCROMATICO

MIELOBLASTO GRANULOPOIESI PROMIELOCITO MIELOCITO METAMIELOCITO GRANULOCITO CIRCOLANTE GRANULOCITO CON NUCLEO SEGMENTATO BAND FORM Tempo di produzione 5-7 giorni

PROMEGACARIOCITA MEGACARIOCITA

La linfopoiesi Nella vita extra-uterina, le prime tappe differenziative avvengono nel midollo osseo Successivamente la maturazione avviene all interno degli organi linfoidi primari che sono il timo per i T linfociti ed il midollo osseo per i B linfociti

La linfopoiesi

Esame emocromocitometrico Indispensabile per verificare un eventuale danno ematologico primitivo o secondario a patologie di organi o apparati extra-emopoietici Comporta la determinazione di vari parametri Viene effettuato mediante l impiego di contatori automatici che consentono l esecuzione di un notevole numero di esami in breve tempo e con la massima precisione.

Approccio al paziente ematologico Raccolta accurata dell anamnesi Esame obiettivo generale (organi addominali, s. linfonodale superficiale, cavo orale, cute e mucose) Richiesta esami: primo livello (emocromo, chimica-clinica) secondo livello (agoaspirato midollare, biopsia osteomidollare, biopsia linfonodale) indagini strumentali

Esame emocromocitometrico Conteggio ed identificazione cellule ematiche Valutazione della morfologia (normale o patologica) del contenuto cellulare

Esame emocromocitometrico mediante strumenti contaglobuli Parametri valutati Numero / dimensioni (principio impedenziometrico di Coulter) Interazione con la luce o con altre onde elettromagnetiche (conta differenziale dei leucociti) Colorazioni citochimiche (mieloperossidasi) (conta differenziale dei leucociti)

Principi di base di citometria automatizzata

Citometria: sistema ottico basato su luce laser

Citometria: sistema impedenziometrico di Coulter

Gli allarmi strumentali o flags sono indicazioni tecniche che suggeriscono al laboratorista la possibile presenza di anomalie La loro presenza su di un referto ematologico non deve essere tenuta in alcun conto dal clinico, a meno che non sia stata valutata e quindi adeguatamente validata con commenti o definizioni numeriche

L ESAME EMOCROMOCITOMETRICO

Iter successivo in caso di presenza di flag all emocromo

Esame emocromocitometrico GB, WBC Indica il numero di leucociti Valori normali: 4-10 x 10 3 / μl GR, RBC (numero di eritrociti) Valori normali:maschi: 4,5-5,9 milioni/μl;femmine: 4,1-5,1milioni/μL Hb, Hgb (emoglobina): quantità (grammi) di Hb /dl di sangue. Valori normali: Maschi: 13-17,5 g/dl; Femmine: 12-16,5 g/dl Ht, Hct (ematocrito):percentuale del volume del sangue occupato dai GR (Ht :45% o 0,45 indica che il 45% del volume totale del sangue è occupato dai GR; il restante 55% è costituito dal plasma). Valori normali:maschi:38-52%; Femmine: 36-47,5%

Esame emocromocitometrico MCV Mean Corpuscular Volume= Ht x 10 N GR / μl (milioni) Valori normali: 85-95 μ 3 MCHC Mean corpuscolar hemoglobin concentration= Hb x 100 Ht Plt: numero di piastrine Valori normali: 140-400 x 10 3 / μl Formula leucocitaria: indica in termini percentuali come sono rappresentate le diverse popolazioni di globuli bianchi

La distribuzione normale

Alterazioni dei leucociti Leucocitosi / Leucopenia Alterazioni formula leucocitaria

Cause di neutrofilia Fisiologiche (esercizio, stress) Infettive (batteri, funghi, parassiti) Infiammatorie (ustioni, necrosi tissutali, collagenopatie, ipersensibilità) Metaboliche (chetoacidosi, IRA,eclampsia, avvelenamento acuto) Malattie mieloproliferative (LMCr, MFI, Policitemia)

Cause di neutropenia Malattie ematologiche (AA, LA, SMD, Neutropenia ciclica,neutropenie croniche) Farmaci Nutrizionali (Deficit B12) Infezioni (tbc, febbre tifoide, brucellosi, tularemia, morbillo,mononucleosi, epatite virale, leishmaniosi) Malattie autoimmunitarie (S. Felty, LES)

MODIFICAZIONI DELL EMOCROMO IN CORSO DI INFEZIONE PATOGENESI DELLA NEUTROPENIA Migrazione dei leucociti circolanti nella sede di infezione non accompagnata da un concomitante flusso di neutrofili dalle riserve midollari Richiesta sproporzionata di neutrofili nella sede di infezione e deplezione delle riserve midollari PATOGENESI DELLA NEUTROFILIA iperplasia della serie mieloblastica e flusso di leucociti midollari nel torrente circolatorio, correlati alla gravità dell infezione e alla presenza di piogeni

ANOMALIE DELLA CONTA LINFOCITARIA Malattie infettive (> virus) Malattie immunitarie (collagenopatie, crioglobulinemie, vasculiti) Malattie linfoproliferative (LLC, LPL, HCL, LNH) Immunodeficienze (congenite e acquisite) Malattie virali Linfoma Hodgkin Aplasia midollare Sarcoidosi Radiochemioterapia Terapia cortisonica Terapia con globulina antilinfocitaria

MODIFICAZIONI DELL EMOCROMO IN CORSO DI INFEZIONE INFEZIONI BATTERICHE SIGNIFICATIVE variazioni del numero, della morfologia e della funzione dei leucociti. INFEZIONI VIRALI MODESTE variazioni del numero e della funzione dei neutrofili e dei linfociti

MODIFICAZIONI DELL EMOCROMO IN CORSO DI INFEZIONE INFEZIONI VIRALI Fase acuta Precoce neutropenia accompagnata da linfopenia, seguita da linfocitosi assoluta e persistente; modesto aumento del numero dei monociti e modesta eosinopenia Occasionale riscontro di neutrofilia iniziale con presenza di forme immature circolanti. Risoluzione Ritorno graduale nella norma

Cause di monocitosi Monocitosi reattiva a malattia infettiva (tbc, brucellosi, endocardite, malaria, parvovirus) Monocitosi reattiva a malattia disreattiva (granulomatosi cronica, sarcoidosi) Malattia mieloproliferativa o SMD

Cause di eosinofilia Sindromi allergiche M. autoimmunitarie (poliarterite nodosa, S. Goodpasture) Infezioni parassitarie (elminti, filaria) Infezioni non parassitarie (tbc, aspergillosi) Farmaci (sulfamidici,penicillina) M. cutanee (eczema, dermatite esfoliativa, psoriasi, pemfigo) Eosinofilia essenziale M. ematologiche (sindromi mieloproliferative, linfomi)

Diminuzione ed aumento del numero delle piastrine

Aumento del numero delle piastrine

Alterazioni numeriche delle piastrine Piastrinopenie Farmaci / Tossici Virus Malattie autoimmunitarie (LES, ITP) Microangiopatie trombotiche Piastrinosi Carenza marziale Infezioni acute Neoplasie (carcinomi, mesotelioma, linfomi) Traumi Malattie infiammatorie croniche Splenectomia Malattia mieloproliferativa (LMC,MFI, Trombocitemia essenziale)

9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 Frequenza relativa Distribuzione di frequenza Hb IN 2439 donatrici 0.3 0.2 51-65 1940-56 a 1957-71 36-50 1972-89 a 18-35 a 0.1 0.0 g/dl UOC Immunoematologia e Medicina Trasfusionale Sapienza Università di Roma

Distribuzione di frequenza Hb in 7378 donatori di sesso maschile Frequenza relativa 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 0.25 51-65 a 0.20 36-50 a 0.15 18-35 a 0.10 0.05 0.00 g/dl UOC Immunoematologia e Medicina Trasfusionale Sapienza Università di Roma

Parametri eritrocitari in 7378 donatori di sesso maschile Classe età (anni) RBC HGB HCT MCV MCH MCHC RDW 51-65 N.1267 media 4,88 14,96 43,28 88,67 30,69 34,58 13,35 mediana 4,88 15 43,2 88,8 30,7 34,6 13,3 ds 0,336 0,882 2,462 3,861 1,565 0,780 0,758 36-50 N. 3651 media 4,93 14,97 43,25 87,68 30,37 34,62 13,22 mediana 4,93 15 43,2 87,7 30,4 34,6 13,1 ds 0,319 0,852 2,356 3,719 1,464 0,739 0,715 18-35 N. 2460 Media 5,02 15,11 43,70 87,06 30,13 34,58 13,06 mediana 5,01 15,1 43,7 87,2 30,2 34,5 13 ds 0,323 0,855 2,393 3,740 1,508 0,774 0,678

volume (fl) Parametri eritrocitari in 7378 donatori di sesso maschile 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 MCV HCT MCH MCHC RDW Classi di età (anni): 51-65 36-50 18-35 1940-56 MCV 1957-71 MCV 1972-89 MCV 1940-56 HCT 1957-71 HCT 1972-89 HCT 1940-56 MCH 1957-71 MCH 1972-89 MCH 1940-56 MCHC 1957-71 MCHC 1972-89 MCHC 1940-56 RDW 1957-71 RDW 1972-89 RDW 60 50 40 30 20 10 UOC Immunoematologia e Medicina Trasfusionale Sapienza Università di Roma 0

Parametri leucocitari in 7378 donatori di sesso maschile Classe età (anni) WBC (x10 9 /L) NEU (%) EOS (%) BAS (%) LYM (%) MON (%) 51-65 N. 1267 N. 1073 media 6,51 57,01 2,82 0,53 31,68 7,94 mediana 6,2 56,9 2,4 0,5 31,6 7,8 ds 1,552 6,965 1,929 0,212 6,362 1,658 36-50 N. 3651 N. 3164 media 6,54 56,27 2,74 0,54 32,35 8,07 mediana 6,3 56,3 2,3 0,5 32,1 8 ds 1,704 7,349 1,827 0,220 6,579 1,695 18-35 N. 2460 N. 2210 media 6,59 55,59 2,67 0,51 32,97 8,23 mediana 6,4 55,7 2,2 0,5 32,9 8,1 ds 1,537 7,655 1,946 0,206 6,870 1,796 UOC Immunoematologia e Medicina Trasfusionale Sapienza Università di Roma

Lo striscio di sangue

Zona marginale MONOCITI ++ I D E A L E T E S T A GRANULOCITI ++ LINFOCITI ++ Area sottile Area densa

Aspetti tecnici nell esecuzione dello striscio di sangue Sangue prelevato da non più di 6 h Utilizzare un vetrino pulito e asciutto Lo strato di cellule deve essere sottile Il vetrino deve essere asciugato all aria Colorazione panottica standard Possibili effetti di uno striscio non corretto: Colorante alterato Lettura difficoltosa Tempo di esposizione prolungato Precipitazione del colorante Insufficiente asciugatura dello striscio Scollamento del materiale al risciacquo