Cosa sono i microrganismi?

Cosa sono i microrganismi? Le prime forme di vita comparse nel pianeta Forme di vita unicellulari Autonome, in grado di metabolizzare, riprodursi differenziarsi, comunicare, evolvere Dotate di piccole dimensioni Visibili solo al microscopio

Classificazione alghe Protisti superiori (eucarioti) protozoi Regno dei protisti miceti Protisti inferiori (procarioti) batteri

Differenze tra procarioti e eucarioti Caratteristiche Procarioti Eucarioti Dimensioni 0,3-2μm > 5μm Organizzazione genetica Nucleo circondato da membrana Assente Presente DNA complessato agli istoni Assente Presente Numero di cromosomi Uno Più di uno DNA extracromosomiale Plasmidi Mitocondriale Geni Contigui o riuniti in operoni Discontinui Divisione per mitosi Assente Presente Citoplasma Reticolo endoplasmico Assente Presente Apparato del Golgi Assente Presente Mitocondri Assenti Presenti Lisosomi Assenti Presenti Ribosomi 70 S 80 S Membrana citoplasmatica Assenza di steroli Presenza di steroli Parete cellulare Formata Se presente, da peptodoglicano formata da polisaccaridi

Forma dei batteri La forma è una condizione: Fissa Geneticamente determinata Conferita dalla parete cellulare

Forma dei batteri Cocchi: forma rotondeggiante

Forma dei batteri Bacilli: forma a bastoncello

Forma dei batteri Spirilli: forma a spirale

Forma dei batteri Vibrioni: forma a virgola

Disposizione dei batteri Indica il modo con il quale le cellule, riproducendosi, si dispongono nello spazio mantenendo o meno uno stretto rapporto di continuità. E condizionata dal modo in cui si susseguono nello spazio i diversi piani di divisione cellulare in successive generazioni

Disposizioni più frequenti Diplococchi (cocchi uniti a coppie) Cocchi Streptococchi (cocchi uniti a catenelle) Stafilococchi (cocchi uniti in ammassi irregolari) Tetradi (cocchi uniti in gruppi di quattro) Sarcine (cocchi uniti in gruppi di otto, forma cubica) Bacilli Diplobacilli (bastoncelli uniti a coppie) Streptobacilli (bastoncelli uniti a catenelle)

Disposizioni più frequenti (alcuni esempi) Diplococchi Streptococchi Stafilococchi Tetradi Diplobacilli (bastoncelli uniti a coppie) Streptobacilli (bastoncelli uniti a catenelle)

Colorazione di Gram Colorazione più importante e usata in batteriologia. Prende il nome dal patologo danese che la mise a punto. Permette di distinguere i batteri in Gram+ e Gram-. Colorazione differenziale. Utilizzando differenti coloranti in tempi successivi, individua differenze strutturali della cellula batterica. Le differenze strutturali riguardano la parete cellulare. I batteri Gram+ si colorano in viola. I batteri Gram- si colorano in rosso.

Colorazione di Gram (esecuzione) Si allestisce il preparato Si versa sul preparato una soluzione di cristalvioletto Si allontana il colorante e si versa sul vetrino un mordenzante: il liquido di Lugol (i mordenzanti sono sostanze che formano un composto insolubile con il colorante facilitandone l unione col substrato) Si tratta il vetrino con una soluzione decolorante formata da alcool e acetone Si applica un colorante di contrasto: la fuxina (rossa) I batteri Gram+ trattengono il primo colorante risultando colorati in violetto, i batteri Gram- si decolorano assumendo la colorazione rossa di contrasto

Colorazione di Gram (esecuzione) Gram positivi Gram negativi Fissazione Cristal violetto Liq. di Lugol Decolorazione Colorazione di contrasto

Colorazione di Gram (esempi) Gram + Gram -

A cosa è dovuto il diverso comportamento dei batteri nella colorazione di Gram? E dovuto ad una diversa permeabilità degli involucri cellulari che è maggiore (tale da consentire l asportazione del complesso cristalvioletto-liquido di lugol da parte del decolorante) nei batteri Gram negativi e minore nei Gram positivi che in tal modo trattengono il primo colorante. La Gram positività e la Gram negatività, dovuta alla differente architettura molecolare della parete, è espressione di una dicotomia evolutiva dal profondo significato clinico.

Struttura della cellula procariotica Il carattere citologico più importante è rappresentato dalle piccole dimensioni e dall assenza di compartimenti intracellulari separati da membrane. Pilo o fimbria Membrana Parete Capsula Citoplasma Flagello Sost. nucleare Mesosoma Ribosomi Caratteristica è la struttura cromosomica, estremamente semplice, immersa direttamente (senza interposizione di membrana nucleare) nel citoplasma.

Cromosoma batterico (sostanza nucleare) Si trova all interno del citoplasma. Appare come un materiale filamentoso, costituito da DNA immerso nel citoplasma non separato da alcuna membrana. Viene considerato l equivalente di un cromosoma (cromosoma batterico o cromonema). E fortemente raggomitolato la sua lunghezza, se disteso, supera di 1000 volte la lunghezza della cellula. E privo di estremi liberi, presenta struttura circolare con implicazioni sulla duplicazione cellulare e sulla genetica batterica. Non è legato ad istoni ma è complessato a proteine acide dalle quali è facilmente dissociabile. E collegato alla membrana in corrispondenza di zone caratteristiche che rappresentano l origine della duplicazione durante la riproduzione cellulare.

Duplicazione del DNA Il cromosoma batterico prende contatto con zone particolari della membrana che rappresentano l origine della duplicazione. Il processo continua da entrambi i lati e termina al punto opposto rispetto all origine. Contemporaneamente al distacco delle emieliche si ha la formazione del filamento complementare. Terminato il processo si formeranno due nuovi filamenti di DNA ciascuno dei quali sarà formato da un elica parentale e dal filamento complementare, assicurando la esatta ripartizione del corredo genetico

Plasmidi: definizione Sono elementi genetici extracromosomiali a struttura circolare, presenti nel citoplasma batterico, di dimensioni minori rispetto al cromosoma, dotati di relativa autonomia replicativa e in grado di condizionare caratteri fenotipici importanti sotto il profilo dell azione patogena, della resistenza agli antinfettivi e della sopravvivenza nell ambiente.

Grandezza e numero dei plasmidi La grandezza dei plasmidi si misura in kilobasi (lunghezza media di un gene). Esistono plasmidi più piccoli di poche kb e plasmidi più grandi con più di 1000 kilobasi. I plasmidi più grandi sono presenti in un unica copia. I più piccoli possono essere presenti in più copie. Tutti i plasmidi possiedono una serie di geni che codificano gli elementi necessari e sufficienti alla loro duplicazione e ripartizione tra le cellule figlie al momento della divisione cellulare.

Trasferimento intercellulare dei plasmidi I plasmidi oltre a venir trasmessi verticalmente da cellula madre a cellula figlia, possono trasferirsi orizzontalmente tra cellule diverse. Esistono plasmidi autotrasmissibili e non autotrasmissibili. I plasmidi autotrasmissibili possono trasferirsi grazie al contatto cellula-cellula e sono detti coniugativi. La trasmissione mediante coniugazione viene controllata da geni tra. I plasmidi non autotrasmissibili non contengono geni tra, il loro trasferimento per coniugazione è reso possibile dalla presenza di plasmidi coniugativi che coabitano nella stessa cellula.

Funzioni dei Plasmidi Le funzioni dei plasmidi sono numerose; anche se non indispensabili sono utili a garantire la sopravvivenza dei batteri in particolari situazioni o habitat metaboliche Utilizzazione di sostanze,produzione di pigmenti etc. resistenza Agli antibiotici, agli ioni, ai raggi U.V. virulenza Produzione di esotossine, batteriocine, polimeri adesinici biologiche Modificazione e restrizione di DNA estraneo

Tipi di plasmidi Plasmide F è un plasmide coniugativo, contiene geni tra che promuovono il trasferimento del plasmide stesso da una cellula donatrice ad una cellula ricevente. Può integrarsi nel cromosoma batterico rendendo possibile la mobilizzazione intercellulare di geni cromosomici. Plasmide R è un plasmide autotrasmissibile capace di codificare per la produzione di enzimi in grado di conferire resistenza nei confronti di diversi farmaci antibatterici e di operare il trasferimento interspecifico di tali resistenze. Plasmidi batteriocinogeni codificano per la produzione di batteriocine cioè di proteine tossiche in grado di uccidere batteri della stessa specie, ma innocue per le specie che le producono. Tali sostanze vengono espresse di prevalenza quando sia necessario ristabilire un alterato equilibrio in particolari nicchie ecologiche.

Citoplasma Il citoplasma batterico è estremamente semplice, privo di molti elementi morfologici che caratterizzano il citoplasma delle cellule eucariotiche quali: reticolo endoplasmico apparato del Golgi mitocondri lisosomi vacuoli

Citoplasma : composizione H2O Componenti inorganici: sodio, magnesio, calcio, ferro etc Macromolecole organiche Polimeri Le sostanze organiche contribuiscono maggiormente a generare una elevata pressione osmotica che contraddistingue l interno della cellula. Tale pressione è maggiore nei Gram+ e minore nei Gram-

Inclusioni citoplasmatiche Occasionalmente nel citoplasma sono presenti granulazioni (inclusioni) citoplasmatiche, di diversa composizione aventi il significato di accumuli di materiale di riserva. Glicogeno Sono costituiti da: Acido β-idrossi-butirrico Polisaccaridi Polifosfati I granuli di polifosfati sono detti metacromatici presentano il fenomeno della metacromasia si colorano diversamente rispetto al colore utilizzato. Sono particolarmente abbondanti in Corynebacterium diphteriae costituendone un carattere distintivo importante utile per l identificazione.

Ribosomi Rappresentano lo strumento universale delle sintesi proteiche per qualunque tipo di organizzazione cellulare: procariotica o eucariotica. I ribosomi procariotici, tuttavia, presentano differenze fondamentali rispetto agli eucarioti Caratteristiche Sono presenti nel citoplasma in numero elevato (fino a 15000) Funzionalmente identici ma strutturalmente differenti rispetto ai procarioti Le differenze indirizzano l azione selettivamente tossica di alcuni antibiotici Hanno un coefficiente di sedimentazione 70S (80S per gli eucarioti) Sono costituiti da due subunità una più grande 50S e una più piccola 30S

Ribosomi Forma Complessivamente globulare, la subunità più piccola alloggia in una cavità presente nella subunità più grande Composizione 60% RNA 40% proteine Una unità ribosomiale completa contiene: 55 proteine e tre tipi di RNA: 5S, 16S, 23S Organizzazione strutturale La subunità più grande contiene 34 proteine(1l, 2L etc.) e due RNA (5S, 23S) La subunità più piccola contiene 21 proteine (1S, 2S etc. e un RNA (16S)

Membrana citoplasmatica Delimita esternamente il citoplasma Si trova al di sotto della parete cellulare E strutturalmente simile ma funzionalmente differente rispetto alla membrana degli eucarioti Composizione chimica Proteine 60% Lipidi 40% Carboidrati tracce Proteine Integrali: sono situate nello spessore della membrana Periferiche: sono situate superficialmente

Lipidi assenza di steroli, presenza di fosfolipidi quali: Fosfatidil-glicerolo Difosfatidil-glicerolo Fosfatidil-etanolamina Fosfatidil-serina Fosfatidil-inositolo Acidi grassi Assenza di acidi grassi polinsaturi Presenza di acidi grassi ramificati e derivati dal ciclopropano Glicerolo Esterificato con aminoacidi quali: lisina, alanina, glicina, ornitina

Legati ai lipidi (glicolipidi) Carboidrati Legati a proteine (glicoproteine Modello a mosaico fluido Struttura I fosfolipidi formano un doppio strato continuo, con le parti apolari rivolte verso l interno (porzione idrofobica) e le parti polari rivolte verso la porzione esterna idrofila.

Funzioni della membrana citoplasmatica Delimita esternamente il citoplasma opera il contenimento degli organi interni della cellula presiede agli scambi rende possibile il trasporto attraverso la cellula tramite meccanismi: attivi (contro il gradiente di pressione osmotica), passivi (leggi dell osmosi), facilitati (carriers) partecipa al processo di riproduzione cellulare (duplicazione DNA, formazione del setto interno di divisione) rende possibili i processi di respirazione cellulare in assenza dei mitocondri promuove la formazione del setto di divisione asimmetrica nella sporulazione partecipa alle fasi intermedie e finali del processo di biosintesi del peptidoglicano (componente fondamentale della parete cellulare) promuove il rilascio di enzimi implicati nella resistenza batterica agli antibiotici.

Mesosomi Nelle sezioni ultrasottili esaminate al m.e. la membrana citoplasmatica presenta delle invaginazioni che si approfondano nel citoplasma e possono assumere una struttura complessa ricca di microtubuli e microfilamenti. A queste strutture più frequenti e complesse nei Gram+, denominate mesosomi sono state attribuite diverse funzioni in rapporto alla divisione cellulare, alla secrezione di esoenzimi e ai processi di fosforilazione ossidativa. In realtà i mesosomi sono risultati essere degli artefatti dei processi di fissazione. Il fatto che essi tendano a formarsi in zone precise della membrana suggerisce che la membrana stessa possa presentare regioni con particolari specializzazioni strutturali e funzionali

Parete cellulare Caratteristiche Struttura più importante e caratteristica dei batteri Delimita esternamente la cellula batterica, al di fuori della membrana citoplasmatica Struttura fondamentale per garantire l integrità cellulare Posseduta universalmente da tutti i batteri ad eccezione del genere Mycoplasma (assenza di parete) e del genere Chlamidia (parete di diversa composizione) Struttura esclusiva dei batteri, non ha corrispondenza negli eucarioti; i miceti hanno parete cellulare, ma costituita da polisaccaridi e proteine

Parete cellulare Funzioni e proprietà Assicura protezione alla cellula nei confronti degli agenti esterni e della lisi osmotica Definisce la differente forma ai batteri con la sua struttura rigida e compatta Fornisce un bersaglio all azione selettivamente tossica di alcuni antibiotici che vanno ad interferire a vario livello nel processo di biosintesi del principale componente della parete

Parete cellulare Struttura Il componente fondamentale della parete è un polimero il peptidoglicano formato da due aminozuccheri alternati tra loro e uniti da un legame β-glucosidico rappresentati da: N-acetilglucosamina N-acetilmuramico Ad ogni residuo di ac. muramico è legato un tetrapeptide costituito da: L-alanina D-glutammico L-lisina D-alanina

Organizzazione strutturale della parete La parete cellulare dei batteri risulta diversamente strutturata nei batteri Gram+ e nei batteri Gram-. Tale diversa organizzazione determina il differente comportamento dei batteri alla colorazione di Gram permettendo di effettuare una distinzione fondamentale dal punto di vista clinico.

Parete cellulare Gram positivi Costituente fondamentale il peptidoglicano, formato da: N-acetilglucosamina Acido N-acetilmuramico Tetrapeptide Ponte trasversale formato da 1 a 5 aminoacidi uguali o diversi tra loro Dimensioni 80-90 mμ

Parete cellulare Gram positivi Struttura Tridimensionale Costituita da numerose catene lineari, parallele tra loro, per uno spessore di 80-90 mµ dei due aminozuccheri legati con legame β-glucosidico Ogni residuo di ac. muramico lega il tetrapeptide formato da aminoacidi alternativamente in configurazione L e D Il ponte trasversale collega due catene tetrapeptidiche poste su scheletri lineari adiacenti legando il 3 ed il 4 aminoacido della catena (L-lisina D-alanina)

Parete cellulare Gram positivi Struttura Tridimensionale

Monomero costitutivo del peptidoglicano E una molecola formata da: una unità di N-acetilglucosamina legata con legame β 1-6 glucosidico ad una unità di ac. N-acetilmuramico il quale lega il tetrapeptide ed il ponte trasversale. Ogni monomero è legato al monomero successivo tramite un legame β 1-4 glucosidico. Tale legame viene idrolizzato dall enzima lisozima, il quale pertanto ha azione depolimerizzante il peptidoglicano scindendone cioè i vari monomeri costitutivi.

Altri costituenti la parete dei Gram+ Acidi teicoici Caratteristiche Lunghi filamenti che si protendono all esterno della cellula Composizione chimica Esteri fosforici del glicerolo e del ribitolo altamente polimerizzati con gruppi OH variamente sostituiti

Funzioni degli acidi teicoici Antigeni di superficie (utili per la sierotipizzazione). Formano una fitta rete all esterno della cellula ostacolando l ingresso delle sostanze a basso peso molecolare. Con le loro cariche elettriche negative formano un letto anionico capace di attrarre cationi che fungono da cofattori per taluni enzimi. Rendono possibile l adesione a svariate superfici (adesine)

Altri costituenti la parete dei Gram + Proteine Sono occasionalmente presenti in talune specie es. Proteina A di Staphylococcus aureus (azione antifagocitaria) Proteina M di Streptococcus pyogenes (fattore di adesività condiziona l invasività e la virulenza) Lipidi Sono presenti in alcuni generi e soprattutto in elevata quantità nel genere Mycobacterium.

Parete cellulare dei batteri Gram-positivi peptidoglicano Parete ac. teicoico Membrana plasmatica

Parete cellulare Gram- Caratteristiche E resa più complessa rispetto ai Gram+ dalla presenza di una membrana posta esternamente ad un sottile strato di peptidoglicano Costituenti Membrana parietale esterna Peptidoglicano Spazio periplasmico Membrana citoplasmatica I batteri Gram- rappresentano l unico esempio di organizzazione cellulare delimitata da una doppia membrana

Il peptidoglicano dei batteri Gram- Ha uno spessore minore rispetto ai Gram positivi (10-20μm) E composto da pochi scheletri lineari paralleli tra loro dei due aminozuccheri (N-acetilglucosamina e N-acetilmuramico). Il 3 aminoacido della catena tetrapeptidica legata ad ogni residuo di acido muramico è l acido meso-diaminopimelico (L lisina nei Gram+). Le catene tetrapeptidiche per il 50% sono sciolte, per il restante 50% sono legate tra loro con legame peptidico diretto realizzato tra il terzo aminoacido di una catena e il quarto della catena adiacente Struttura bidimensionale meno compatta rispetto ai Gram+

Parete cellulare Gram- Membrana parietale esterna Avvolge la cellula al di fuori del peptidoglicano Protegge la cellula batterica conferendole capacità di resistenza verso sostanze dannose. Presenta maggiore densità rispetto alla membrana citoplasmatica. Presenta caratteristiche di permeabilità del tutto peculiari che la rendono poco permeabile alle sostanze idrofobe e permeabile alle sostanze idrofile a basso peso molecolare. E collegata tramite delle lipoproteine al peptidiglicano sottostante. Ha una struttura tipicamente asimmetrica, il foglietto fosfolipidico più esterno è sostituito da un originale composto: il lipopolisaccaride o LPS

Parete cellulare Gramlipopolisaccaride Sostituisce il foglietto fosfolipidico più esterno, consiste di tre porzioni: 1) una porzione lipidica (lipide A) rappresenta l endotossina cioè la frazione tossica. Al lipide A è legata una porzione polisaccaridica proiettata all esterno della membrana e composta a sua volta da due parti: a) una catena di zuccheri (parte centrale o core) con struttura costante in tutti i Gram negativi appartenenti alla stessa specie b) una lunga catena polisaccaridica di composizione differente nei batteri appartenenti alla stessa specie con spiccate proprietà antigeniche (antigene O) Le catene polisaccaridiche presenti sulla superficie dei Gram- sono strutture polari in grado di legare cationi bivalenti formanti ponti che rendono la membrana assai compatta, tendenzialmente idrofila e capace di escludere i composti idrofobici.

La permeabilità della membrana esterna: il sistema delle porine I batteri Gram- proteggono la cellula dalla interazione con composti idrofobici dannosi circondandosi di polimeri idrofili (core polisaccaridico e antigene O). La compattezza della membrana esclude tuttavia il passaggio di sostanze idrofile essenziali al metabolismo. Per assicurare il passaggio dei metaboliti, la membrana è dotata di canali speciali per la diffusione passiva di molecole idrofile. Questi canali, chiamati porine, sono proteine che presentano un foro centrale di lume limitato e che si riuniscono in coppie o in trimeri assicurando il passaggio delle sostanze indispensabili al metabolismo. L organizzazione della parete cellulare dei Gram- rende ragione della particolare resistenza di tali batteri a taluni farmaci e della loro presenza in particolari distretti organici (ambiente intestinale)

Periplasma o spazio periplasmico E un comparto ben definito compreso tra il peptidoglicano e la membrana citoplasmatica. Ha la funzione di racchiudere e contenere in uno spazio delimitato una serie di molecole proteiche che garantiscono l esercizio di funzioni fisiologiche importanti per il batterio.

Parete cellulare dei batteri Gram-negativi lipopolisaccaridi porina Membrana esterna Parete lipoproteine peptidoglicano Spazio periplasmico Membrana plasmatica

Sintesi del peptidoglicano La via biosintetica che conduce alla sintesi del peptidoglicano è fondamentale per comprendere il meccanismo d azione di numerosi antibiotici che debbono la loro azione all inibizione di tale sintesi in taluni momenti essenziali. La biosintesi del peptidoglicano è il processo tramite il quale la cellula sintetizza ciascun monomero di peptidoglicano. Le fasi finali del processo, consistenti nella estensione dei singoli monomeri in corti polimeri, nella formazione di legami crociati tra polimeri lineari e nel loro inserimento nella parete deteminandone l allungamento è catalizzata da enzimi capaci di legare covalentemente la penicillina e gli altri β-lattamici noti come PBP (Penicillin-binding proteins).

Strutture polisaccaridiche esterne Glicocalice Il glicocalice è un complesso di sostanze per lo più polisaccaridiche che avvolgono la cellula batterica all esterno della parete cellulare, rappresentate dallo strato cristallino o strato S o dalla capsula. Il glicocalice, pur non essendo una struttura essenziale per il batterio è presente in tutte le fasi della vita lasciando intuire un ruolo fondamentale nei fenomeni di permeabilità selettiva e adesione della cellula batterica prerequisito essenziale di ogni processo infettivo.

Strato cristallino o strato S E uno strato formato da subunità proteiche spesso uguali tra loro, a volte legate a carboidrati disposte con una precisa simmetria cristallina, spesso associate in tetrameri, pentameri o esameri a formare un involucro pluristratificato che avvolge esternamente la cellula. Funzioni Rappresenta un ulteriore involucro protettivo Può intervenire nei fenomeni di adesione alle superfici mucose, momento fondamentale di ogni processo infettivo.

Capsula E un involucro mucoso e amorfo che può essere abbondantemente presente sia nei batteri Gram+ sia nei Gram- E il risultato della secrezione di materiali di alta viscosità (etero o omopolimeri polisaccaridici) che rimangono adesi alla superficie esterna della cellula conferendo proprietà di adesività a particolari superfici con possibilità da parte del batterio di colonizzare specifici distretti (superfici dei denti, mucose etc.) o peculiari nicchie ecologiche.

Composizione della capsula Generalmente la capsula è costituita da: polisaccaridi (levani e destrani) polisaccaridi complessi es. Streptococcus pneumoniae poliribitolfosfati es. Haemophilus influenzae poli D glutammato es. Bacillus anthracis Qualunque sia la sua composizione, la capsula è legata alle strutture sottostanti, direttamente se le cariche elettriche sono di segno opposto, altrimenti se le cariche sono dello stesso segno (-), interverranno dei cationi che effettuerannno legami a ponte tra la capsula e la parete cellulare

Capsula Funzioni Azione antifagocitaria impedisce la fagocitosi da parte dei fagociti dell ospite (i batteri più invasivi che debbono attraversare il torrente ematico per raggiungere il bersaglio sono sempre capsulati) Strumento di adesione il materiale capsulare rappresenta un efficace strumento per l adesione batterica alle superfici mucose o inerti dell organismo ospite contribuendo fortemente alla formazione di biofilm che favoriscono la persistenza del processo infettivo

Come si evidenzia nei batteri la presenza della capsula? La presenza della capsula si evidenzia facilmente sospendendo i batteri in una goccia di inchiostro di china ed osservando al microscopio. I batteri provvisti di capsula sono evidenti per l alone chiaro, non penetrato dall inchiostro, di cui è circondata la cellula batterica in contrasto con il fondo scuro delle particelle di inchiostro.

Formazione della capsula La formazione della capsula può essere influenzata da: 1. Fattori ambientali (presenza dei precursori dei componenti capsulari) 2. Fattori genetici (presenza di geni capaci di costituire il componente capsulare: es. capsula dello Streptococcus pneumoniae)

Che cos è il biofilm? Il biofilm è una formazione complessa formata da un estesa matrice di materiale polisaccaridico contenente numerosi batteri in grado di interagire tra loro, che può invadere ampie zone di mucosa quali: la mucosa respiratoria (infezioni da Pseudomonas nella fibrosi cistica), le fasce connettivali intermuscolari (fascite necrotizzante), superfici connettivali come le valvole cardiache, oppure superfici di materiali inerti introdotti a scopo terapeutico come fili di sutura e vari impianti protesici (cateteri vescicali, catetere venoso centrale, protesi vascolari, protesi valvolari cardiache). All interno del biofilm i batteri sono relativamente resistenti all azione degli effettori delle difese antimicrobiche e rappresentano un più difficile bersaglio per i farmaci antibatterici. La crescita all interno del biofilm rappresenta pertanto una delle cause più frequenti di infezioni persistenti e una delle condizioni infettive di più difficile approccio.

Strutture appendicolari della cellula batterica Alla superficie della cellula batterica possono essere presenti una serie di appendici rappresentate dai flagelli e dalle fimbrie o pili. Si tratta di strutture proteiche filamentose formate da monomeri capaci di autoassemblarsi a formare strutture di varia lunghezza, cilindriche che si protendono all esterno della cellula.

Flagelli Sono appedici molto sottili, di aspetto ondulato, con spessore costantemente inferiore al potere di risoluzione del microscopio ottico e assai lunghe ( più lunghe della cellula a cui appartengono) che si protendono all esterno della cellula batterica. Sono organi di propulsione, permettono cioè ai batteri di muoversi. I batteri che hanno i flagelli sono detti: mobili, quelli che ne sono privi: immobili. Il movimento conferito dai flagelli è un movimento vero più evidente rispetto ai moti oscillatori (moti browniani) delle specie immobili.

Come è possibile dimostrare la presenza dei flagelli? Lo spessore dei flagelli (~120 Ǻ) inferiore al potere di risoluzione del microscopio ottico, ne impedisce la visione all osservazione microscopica a meno di non usare soluzioni di sali (nitrato di argento), in grado di depositarsi sui flagelli, ispessendoli e permettendone la visione. La presenza dei flagelli può essere dimostrata indirettamente apprezzando il movimento dei batteri con un metodo chiamato: metodo della goccia pendente. Tale metodica utilizza un particolare vetrino più spesso dei vetrini portaoggetto con una escavazione circolare centrale, chiamato cellula di Koch.

Movimento dei batteri: metodo della goccia pendente Procedimento Si pone una goccia di sospensione batterica sul coprioggetti. Si ungono con vasellina i bordi del vetrino allo scopo di farlo aderire al vetrino cellula di Koch Si prende la cellula di Koch con la concavità rivolta verso il basso e si fanno aderire i due vetrini. Si capovolge il tutto, in modo che la goccia di sospensione batterica penderà all interno della cavità. I batteri, all osservazione micro scopica, se mobili si muoveranno vivacemente, assai più rispetto alle specie immobili

Dislocazione dei flagelli sulla cellula batterica La presenza dei flagelli, tranne rare eccezioni, è una caratteristica esclusiva dei batteri di forma cilindrica (bacilli, vibrioni e spirilli) i quali a seconda della zona di inserzione dei flagelli si distinguono in: Monotrichi lofotrichi anfitrichi un solo flagello polare un ciuffo di flagelli polari due flagelli polari Peritrichi flagelli lungo il contorno

Struttura del flagello I flagelli sono formati dalla ripetizione di subunità di una particolare proteina chiamata flagellina che si autoassemblano a formare una struttura elicoidale. Le singole subunità vengono sintetizzate dalla cellula, trasportate lungo l interno cavo del flagello e depositate all apice determinandone l allungamento. Le flagelline di specie batteriche diverse, sono differenti tra loro, sono dotate di spiccate proprietà antigeniche e rappresentano l antigene H dei batteri mobili

Ultrastruttura del flagello Ogni singolo flagello è costituito da tre parti: Il filamento elicoidale che protrude dalla cellula ( filament ) Un gancio tubulare che attraversa gli strati esterni di diametro leggermente maggiore rispetto al filamento ( hook ) Un corpo basale che ancora il flagello alle strutture cellulari e rappresenta il motore del movimento rotatorio del flagello

Fimbrie o pili Sono appendici proteiche che si proiettano al di fuori degli involucri cellulari esterni Sono presenti solo nei Gram negativi (circondano la cellula) Originano dalla membrana citoplasmatica e si estendono per 0,2 µm all esterno. Sono formate dalla ripetizione di una o due proteine (piline) specifiche per le diverse specie batteriche, organizzate con simmetria elicoidale a formare rigide strutture cilindriche Alcune proteine, presenti all estremo libero delle fimbrie conferiscono loro la specifica capacità di legarsi a particolari substrati (adesine). Una particolare classe di pili è rappresentata dai fili F o pili sessuali. Sono più lunghi delle fimbrie adesiniche e svolgono un ruolo fondamentale nei processi di coniugazione batterica, permettendo lo scambio di materiale genetico.

Processo di sporulazione Le spore batteriche sono cellule peculiari per attributi morfologici e funzionali, capaci di sopravvivere nell ambiente esterno allo stato di quiescenza. Vengono prodotte da un limitato numero di specie per lo più saprofite. Tra i batteri di interesse clinico, gli sporigeni più importanti appartengono a due generi Genere Bacillus sporigeni aerobi Genere Clostridium sporigeni anaerobi

Processo di sporulazione La produzione della spora non costituisce una tappa obbligata del ciclo di sviluppo di uno sporigeno, ma si verifica in seguito a condizioni ambientali sfavorevoli (scarsa presenza di nutrienti e di acqua). Nel batterio sporigeno vanno perciò distinte due condizioni alternative: l accrescimento vegetativo Le cellule termolabili e metabolicamente attive si dividono per scissione binaria alla massima velocità consentita dalle condizioni ambientali sporificazione Vengono sintetizzati tutti i componenti peculiari della spora

Significato della spora La sporulazione va considerara come un processo di differenziamento cellulare indotto dal variare delle condizioni ambientali, e rappresenta il risultato di informazioni genetiche che, alternativamente espresse possono consentire la formazione di due tipi cellulari tra loro profondamente diversi: La spora la forma vegetativa

La spora matura E profondamente diversa dalla forma vegetativa per composizione chimica, organizzazione strutturale, proprietà fisiologiche E termoresistente, disidratata, priva di evidente attività metabolica. E resistente a molti agenti fisici e chimici, antibiotici e solventi. E in grado, nonostante l estrema dormienza, di rispondere a determinati stimoli ambientali ed andare incontro al processo di germinazione che comporta interruzione dello stato di quiescenza e ritorno alla forma vegetativa.

La spora germinata E un entità termolabile Idratata Metabolicamente attiva In presenza di nutrienti, a concentrazioni non limitanti dà luogo ad una cellula capace di moltiplicarsi

Proprietà delle spore resistenza Calore Essiccamento Congelamento Agenti chimici Radiazioni quiescenza metabolica disidratazione-rifrangenza difficoltà tintoriali per scarsa assunzione del colorante

Protoplasto E assente l RNA messaggero Sono assenti enzimi per la biosintesi di alcuni aminoacidi Sono assenti enzimi per la biosintesi dei nucleotidi Sono assenti enzimi per la biosintesi degli acidi tricarbossilici E presente una copia del cromosoma batterico Sono presenti i componenti della sintesi proteica Sono presenti proteine enzimatiche e strutturali Sono presenti proteine di riserva Sono presenti gli enzimi per il trasporto terminale degli elettroni

Germinazione E il processo in cui cessa la condizione di spora e si ha il ripristino delle attività vegetative. La trasformazione di una spora quiscente in una forma vegetativa è il risultato di 3 processi sequenziali: 1. Attivazione è un processo reversibile che rende le spore pronte a germinare, se esposte a specifici induttori della germinazione; questi sono sostanze quali: aminoacidi o nucleosidi che non vengono utilizzati come substrati dalla spora, ma piuttosto si legano a strutture recettoriali, determinandone modificazioni in grado di attivare il metabolismo degradativo. L attivazione può essere indotta: dall esposizione a temperature elevate o a seguito di eventi naturali come l invecchiamento e l usura degli strati.

Germinazione 2. germinazione È un processo irreversibile caratterizzato da una serie di reazioni degradative che portano alla depolimerizzazione della corteccia, con l eccezione della porzione più interna, ad opera di un enzima litico simile al lisozima e alla perdita di composti spora-specifici. 3. esocrescita L esocrescita della spora germinata si attua quando vengono forniti nutrienti a concentrazioni non limitanti. Durante l esocrescita si verificano una serie di eventi che ripristinano le condizioni metaboliche della crescita vegetativa

Riproduzione dei batteri I batteri si riproducono per schizogonia o divisione semplice: una cellula madre cioè si divide e forma due cellule figlie perfettamente uguali tra loro, perché ciò possa avvenire è necessario che il patrimonio genetico venga egualmente ripartito, il DNA pertanto deve potersi duplicare. Questo processo assicura la corretta ripartizione del corredo genetico tra le cellule figlie. Il materiale genetico dei batteri (DNA) è organizzato in un unica molecola di forma circolare. Il processo di duplicazione ha inizio da un punto di origine posto sulla membrana citoplasmatica e termina dal lato opposto

Fasi della riproduzione batterica Duplicazione del cromosoma batterico: il materiale cromosomico, ancorato alla membrana citoplasmatica, si duplica generando due nuovi cromosomi ancorati ciascuno separatamente alla membrana Accrescimento delle membrane: si verifica l accrescimento delle membrane batteriche e il conseguente allungamento della cellula, partendo dalla zona di membrana che separa le due strutture cromosomiche Allontanamento delle strutture cromosomiche: continuando l accrescimento della cellula, le due strutture cromosomiche si distanziano sempre di più l una dall altra Separazione delle cellule figlie: la separazione è causata dalla formazione di un setto che parte dalla membrana e si approfonda nel citoplasma in direzione centripeta Distacco delle cellule: all interno del setto di membrana si forma un setto di parete permettendo il definitivo distacco delle cellule. Se il setto non si completa le cellule neoformate rimangono unite in aggruppamenti spaziali caratteristici.

La curva di crescita dei batteri I batteri, se le condizioni sono opportune per lo sviluppo, si riproducono assai velocemente e il loro numero aumenta in breve tempo. Misurando la quantità di batteri presenti nell unità di volume di un terreno liquido a diversi intervalli di tempo, si può costruire un grafico che rispecchia la cinetica del processo replicativo della popolazione batterica della coltura. Il grafico ha un aspetto caratteristico, simile per tutti i batteri e può essere suddiviso in diverse fasi.

Curva di crescita: fasi Misurando il numero di batteri vivi presenti in una unità di volume a vari intervalli di tempo e riportando i valori in un diagramma ad assi cartesiani nel quale in ascisse si pone il tempo e in ordinate il log del numero dei batteri vivi si ottiene una curva che può essere suddivisa in 4 fasi. 1) Fase di latenza in questa fase non si ha aumento nel numero dei batteri. La durata di questa fase può essere molto diversa a seconda delle specie batteriche e delle condizioni di coltura; è dovuta alla necessità per i batteri di sintetizzare gli enzimi necessari alla metabolizzazione dei substrati presenti nel terreno (fase di adattamento metabolico)

Curva di crescita: fasi 2) Fase esponenziale o logaritmica Quando tutti i batteri hanno terminato i processi metabolici necessari alla riproduzione, inizia la fase esponenziale nella quale si ha un rapido incremento nel numero dei batteri in rapporto al tempo. Questa fase non può durare all infinito poiché determina un rapido esaurimento di nutrienti con allungamento del tempo di moltiplicazione. 3) Fase stazionaria Il numero di batteri vivi si mantiene costante, il modesto numero di batteri che ancora si dividono bilancia quelli che muoiono. 4) Fase di morte o di declino Il numero di batteri cala progressivamente in quanto il numero di batteri che muoiono supera quelli che sopravvivono o ancora riescono a dividersi

Le colture continue Normalmente si dice che una coltura è giovane, quando è in fase logaritmica di sviluppo e vecchia quando si trova in fase stazionaria. La distinzione tra giovane e vecchia non riguarda la cellula batterica ma è dovuta alle condizioni del mezzo di coltura e alla disponibilità di nutrienti. E possibile mantenere una coltura batterica giovane per il tempo che si desidera utilizzando particolari sistemi di coltura (chemostati) in cui da una parte si ha continua sottrazione di terreno invecchiato e dall altra si ha aggiunta di uguale quantità di terreno fresco. In tal maniera si mantiene indefinitivamente la coltura in condizioni ottimali, per cui si ha la moltiplicazione di tutti i batteri presenti.

Fattori che influenzano la crescita dei microrganismi Temperatura (batteri psicrofili, mesofili, termofili) Ossigeno (aerobi, anaerobi, facoltativi) Anidride carbonica (5-10% necessaria per talune specie) Fattori di accrescimento (alcuni batteri non riescono a sintetizzare taluni metaboliti che debbono essere loro forniti)

Principi e tecniche di sterilizzazione Definizione la sterilizzazione è l operazione la quale, mediante tecniche fisiche o chimiche, determina l uccisione di tutti i microrganismi (patogeni e saprofiti) presenti in un materiale La disinfezione, invece, con l impiego di sostanze chimiche ad azione germicida determina l uccisione solamente dei patogeni. La sterilizzazione si può ottenere mediante: calore: (fiamma diretta, calore umido, secco, vapore sotto pressione) filtrazione radiazioni gas

Sterilizzazione mediante calore Fiamma diretta utilizza il becco Bunsen, serve per sterilizzare l ansa e per il flambaggio dei bordi dei recipienti durante le operazioni di apertura e chiusura. Calore umido molto efficace, uccide i microrganismi a temperature inferiori rispetto a quelle utilizzate con il calore secco grazie alla maggiore conducibilità termica del vapore. Si attua con: 1) liquidi caldi (acqua): bollitura, pastorizzazione 2) Vapore fluente o sotto pressione (sterilizzazione con vapore fluente, tindalizzazione, autoclave) Bollitura Si ottiene utilizzando liquidi alla temperatura di 100, uccide i microrganismi in forma vegetativa; usata per siringhe, materiali da medicazione. Pastorizzazione Serve per ridurre la carica batterica da un materiale ad es. il latte (prende il nome da Pasteur).

Sterilizzazione mediante vapore fluente Per vapore fluente si intende il vapore acqueo alla temperatura di 100, esso possiede grande forza di penetrazione. Un sistema impiegato per formare vapore fluente è la pentola di Koch, un recipiente a chiusura non ermetica all interno del quale l acqua bolle alla temperatura di 100. Sterilizzazione frazionata (Tindalizzazione) Si applica quando il materiale da sterilizzare non tollera le alte temperature (terreni contenenti proteine del latte o siero). L apparecchio usato è il gelatinizzatore di koch. Tecnica Si sottopone il materiale a tre trattamenti termici a 80 per 30 a distanza di 24h uno dall altro. Si uccidono sia le forme vegetative sia le spore e si ha solidificazione del terreno.

Sterilizzazione con vapore sotto pressione Metodo riservato al materiale che può tollerare le alte temperature (terreni di coltura e soluzioni stabili al calore). Apparecchio utilizzato: autoclave. Autoclave L azione sterilizzante è data dalle temperature raggiunte dal vapore saturo sotto pressione. Esiste corrispondenza tra i valori di pressione e temperatura: alla temperatura di 121 corrisponde la pressione di 1 atm capace di permettere la sterilizzazione del materiale in un tempo di 15-30 min. Tecnica: 1. Porre il materiale chiuso con tappi all interno dell apparecchio. 2. Chiudere il coperchio dell autoclave. 3. Accendere l autoclave, l acqua bollendo genera vapore che sostituisce l aria presente nella camera di sterilizzazione. 4. Attendere che il vapore fuoriesca dal rubinetto di scarico e chiudere il rubinetto stesso 5. Controllare la corrispondenza tra temperatura e pressione e lasciar agire il tempo richiesto. 6. A sterilizzazione avvenuta, per aprire l autoclave attendere che la pressione sia tornata ai valori ordinari.

Sterilizzazione con calore secco Principio sterilizzante: aria fortemente riscaldata Apparecchio impiegato: forno Pasteur È un apparecchio nel quale l aria calda generata da resistenze circola nel comparto interno. La sterilizzazione si ottiene regolando la temperatura a 160-180 C per 2 h. Utile per sterilizzare: vetreria e strumentario resistente alle alte temperature, ma non per i terreni di coltura

Sterilizzazione per filtrazione Si usa per sterilizzare liquidi contenenti sostanze labili al calore come: vitamine, proteine del siero etc. Procedimento: il materiale da sterilizzare viene fatto passare attraverso una membrana provvista di pori il cui diametro permette il passaggio del liquido ma non dei batteri. I filtri più usati sono monouso da inserire in: 1. imbuti sterilizzabili 2. contenitori preconfezionati monouso 3. su siringa

Sterilizzazione con radiazioni Sterilizzazione con radiazioni Le radiazioni ionizzanti sono radiazioni elettromagnetiche con un energia tale da provocare la formazione di ioni e altri composti reattivi dalle molecole con le quali entrano in collisione. Tali molecole reattive degradano biopolimeri come il DNA e le proteine con conseguente morte della cellula. Le radiazioni sono usate per prodotti farmaceutici e materiale suscettibile al calore. Le radiazioni debbono essere applicate ad una lunghezza d onda inferiore a 300nm, si impiegano: Raggi gamma ( si ottengono da una sorgente di cobaldo 60) Raggi X non usati in campo alimentare, alterano i caratteri organolettici, sono prodotti da un filamento riscaldato che scorre all interno di un tubo vuoto.

Sterilizzazione gassosa Sterilizzazione gassosa Si usa per materiale in plastica monouso Si impiega ossido di etilene al 10% e CO 2 al 90% (per ridurre l infiammabilità) Si usano apparecchiature simili alle autoclavi Temperatura: 55, tempo necessario: 4-8 h in presenza di umidità. Provoca alchilazione dei gruppi sulfidrilici e aminici, delle proteine e dei gruppi iminici degli acidi nucleici. Terminata la sterilizzazione, allontanare i residui di ossido di etilene tramite areazione in speciali camere di areazione. (sistema di sterilizzazione lento). Metodo utile anche per apparecchiature, materiale per disinfezione, superficie delle compresse.

L azione patogena dei batteri Un batterio può essere definito patogeno, quando è in grado di penetrare, attecchire e moltiplicarsi nell organismo umano, danneggiandolo con la produzione di sostanze tossiche denominate tossine. I meccanismi dell azione patogena sono pertanto: la moltiplicazione in vivo la produzione di tossine Virulenza: indica il grado della patogenicità. Fattori di virulenza: Sono i mezzi con cui si esprime la patogenicità dei microrganismi

Vie di ingresso dei batteri nell ospite Le vie che normalmente permettono l ingresso dei microrganismi nell ospite sono rappresentate da: Via orale (attraverso gli alimenti) Apparato respiratorio (attraverso l aria inspirata) Congiuntiva dell occhio Apparato genito-urinario

La moltiplicazione in vivo dei batteri Avvenuta la penetrazione nell ospite, nella maggior parte delle infezioni, la colonizzazione batterica si verifica a livello delle mucose tramite: Adesine strutture superficiali di natura proteica capaci di legarsi alle membrane eucariotiche o a proteine della matrice intercellulare Polisaccaridi capsulari La moltiplicazione batterica è seguita dalla formazione di biofilm cioè di una struttura complessa formata da una matrice polimerica autoprodotta capace di invadere ampie zone di mucosa. I batteri stabilmente insediatisi a livello delle mucose possono: Rimanere localizzati nella sede primaria d infezione Raggiungere l area riccamente vascolarizzata della sottomucosa Diffondere per via ematica colonizzando tessuti e organi a distanza

Evasione delle difese antibatteriche dell ospite I batteri insediatisi nell organismo mettono in opera meccanismi capaci di evadere le difese dell ospite rappresentati dai fattori di virulenza, suddivisi in: Aggressine sostanze non tossiche che promuovono l attecchimento e l invasione dei batteri impedendo le difese dell ospite: mediante inibizione della migrazione macrofagica attraverso strutture di superficie ad azione antifagocitaria (antigeni di superficie, proteina M di S. pyogenes, capsula, etc.) attraverso enzimi che favoriscono la diffusione tissutale (ialuronidasi, chinasi, proteasi, collagenasi, DNAsi) mediante la produzione di leucocidine in grado di danneggiare i leucociti mediante produzione di catalasi e superossidodismutasi in grado di resistere ai meccanismi di killing intracellulare dei macrofagi Tossine Si suddiviono in eso ed endotossine a seconda che siano prodotte dal batterio e secrete all esterno o che facciano parte della struttura cellulare batterica.

Differenze tra esotossine ed endotossine Esotossine Prodotte da Gram+ e Gram- Natura chimica: proteica Termolabili Cronolabili Fortemente antigeni Convertibili in anatossine Tossicità elevata (DL50-μg) Azione tossica specifica Endotossine Prodotte solo da Gram- Lipopolisaccaridica Termostabili Cronostabili Debolmente antigeni Non convertibili in anatossine Tossicità minore (DL50-mg) Azione tossica non specifica

Classificazione delle esotossine in base alla specificità dell azione tossica Tossine citolitiche ledono le membrane delle cellule bersaglio provocandone la morte Tossine neurotrope il bersaglio è rappresentato dalle cellule del sistema nervoso centrale o periferico Enterotossine agiscono a livello delle cellule della mucosa intestinale specialmente dell intestino tenue Tossine pantrope sono in grado di danneggiare qualsiasi cellula attraverso l alterazione, la deregolazione o il blocco di alcuni eventi metabolici.

Tossine neurotrope (tossina butulinica e tetanica) Sono tossine che interferiscono con il meccanismo di trasmissione degli impulsi, a livello periferico (tossina butulinica) o centrale (tossina tetanica). Tossina butulinica agisce attraverso il blocco della trasmissione colinergica presinaptica mediata dall acetilcolina (Ach). Agisce pertanto su: terminazioni pregangliari terminazioni postgangliari parasimpatiche terminazioni dei motoneuroni Viene inbita la liberazione di Ach con paralisi flaccida dei muscoli viscerali e striati; la morte interviene per arresto cardio-circolatorio Tossina tetanica agisce a livello del SNC bloccando l impulso nervoso inibitore del riflesso da stiramento muscolare per cui ad ogni contrazione muscolare segue la contrazione del muscolo antagonista con paralisi di tipo spastico.

Enterotossine: tossina colerica La tossina colerica, prototipo delle enterotossine è formata da una subunità A (attiva), circondata da 5-6 subunità B (subunità di legame). La subunità A è costituita da due catene: A1 e A2. Il frammento A1 ha attività ribosilante e esplica l azione sulla proteina G attivatrice dell enzima adenilato ciclasi, il quale converte l ATP in AMPc. Viene così a prodursi una notevole quantità di AMCc che provoca la fuoriuscita di ioni con conseguente perdita di liquidi che si riversano nel lume intestinale.

Endotossine Le endotossine sono rappresentate dal lipopolisaccaride (LPS) che costituisce lo strato periferico della membrana esterna dei batteri Gram negativi. Risulta costituito dal lipide A, dal core e dall antigene O Lipide A Core antigene somatico (unità ripetitive)

Organizzazione strutturale dell LPS Lipide A rappresenta la porzione tossica dell LPS (endotossina), è formato da glucosamina fosforilata ed esterificata con diversi acidi grassi saturi Core struttura polisaccaridica legata al lipide A caratterizzata dalla presenza di zuccheri particolari come l acido cheto-deossioctonoico e da un eptoso Antigene O porzione polisaccaridica specifica ancorata al core formata da una lunga catena, spesso ramificata, costituita da subunità tri-tetra o penta saccaridiche formate da zuccheri diversi nelle differenti specie batteriche, cui conferisce determinati caratteri antigeni.

Caratteristiche delle endotossine Le endotossine, considerata la loro particolare natura chimica, sono termostabili e cronostabili e assai poco dotate di potere immunogeno. Non sono pertanto detossificabili in preparazioni omologabili alle anatossine o tossoidi che si possono invece preparare da numerose esotossine.

Trasferimento intercellulare del materiale genetico Il genoma batterico presenta una notevole plasticità in grado di conferire possibilità evoluzionistiche e di adattabilità. Tale possibilità è accresciuta da meccanismi di trasferimento intercellulare di materiale genetico, che pur non paragonabili ai processi di riproduzione sessuata, rappresentano un fondamentale presupposto evoluzionistico. Meccanismi di trasferimento del materiale genetico Trasformazione assunzione di DNA presente in forma solubile nell ambiente Trasduzione Coniugazione trasferimento di geni batterici da una cellula ad un altra tramite virus batterici (batteriofagi). trasferimento diretto di materiale genetico attraverso un contatto fisico tra cellule diverse.