Simplexa BKV Quantitation Standards

Simplexa BKV Quantitation Standards REF MOL2310 Rev. B I Simplexa BKV Quantitation Standards sono destinati alla definizione di una curva standard per il saggio Simplexa BKV sullo strumento 3M Integrated Cycler. Per uso diagnostico in vitro USO PREVISTO I Simplexa BKV Quantitation Standards di Focus Diagnostics sono standard di quantificazione destinati alla definizione di una curva di calibrazione per il saggio Simplexa BKV sullo strumento 3M Integrated Cycler. MATERIALI FORNITI Il set di standard di quantificazione Simplexa TM BKV di Focus Diagnostics contiene materiali sufficienti per due reazioni. Componente del kit REF Descrizione del kit degli Standard di Quantificazione (QS) Focus Diagnostics Simplexa BKV Quantitation Standards ( REF n. MOL2310) Numero di provette per kit Reazioni per flaconcino Volume per flaconcino (µl) Descrizione del componente Simplexa BKV Quantitation Amplicone di BKV in una matrice di base di MOL2311 Standard 1 (QS-1) Simplexa BKV Quantitation MOL2312 Amplicone di BKV in una matrice di base di Standard 2 (QS-2) Simplexa BKV Quantitation MOL2313 Amplicone di BKV in una matrice di base di Standard 3 (QS-3) Simplexa BKV Quantitation MOL2314 Amplicone di BKV in una matrice di base di Standard 4 (QS-4) Simplexa BKV Quantitation MOL2315 Amplicone di BKV in una matrice di base di Standard 5 (QS-5) MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Simplexa BKV ( REF MOL2300) 2. 3M Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versione 3.0 o superiore 3. Universal Discs (dischi universali) per utilizzo su Integrated Cycler 4. Nastro di copertura per dischi universali 5. a Sistema Roche MagNA Pure LC e materiali di consumo associati. 6. a Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (kit di isolamento per acidi nucleici, numero di catalogo Roche 3038505001) 7. b Strumento biomérieux NucliSENS easymag con reagenti e materiali di consumo associati 8. b Pipetta multicanale Biohit/bioMerieux 9. b Piastra con strip per saggio ELISA 10. Micropipette singole, multicanale e/o a ripetizione con range di accuratezza di 1-10 µl, 10-100 µl e 100-1000 µl 11. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 C (per la conservazione dei componenti del kit) 12. Frigorifero da 2 a 8 C (per i componenti del kit e gli standard scongelati) 13. Cabina di biosicurezza (cappa a flusso laminare) per le estrazioni 14. Microcentrifuga 15. Miscelatore vortex 16. Puntali sterili monouso RNAsi/DNAsi-free con filtro barriera per aerosol per micropipettatore 17. Provette da 1,5 ml in polipropilene per microcentrifuga (provette RNAsi/DNAsi-free consigliate, ma non necessarie) e rack dedicato 18. Guanti monouso senza talco

Simplexa BKV Pagina 2 19. Acqua priva di nucleasi, usata durante l estrazione e come No Template Control (NTC, controllo privo di templato) 20. Rack di raffreddamento per provette da microcentrifuga da 1,5 ml a Da utilizzarsi con la metodica di estrazione Roche MagNA Pure LC b Da utilizzarsi con la metodica di estrazione biomérieux easymag PERIODO DI VALIDITÀ E MANIPOLAZIONE 1. Conservare gli standard a una temperatura compresa tra -10 e -30 C (non usare un congelatore no-frost). 2. Dopo il primo utilizzo, conservare gli standard scongelati a temperature comprese tra 2 e 8 C per non oltre cinque (5) giorni. 3. Non utilizzare gli standard dopo la data di scadenza. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Tutti i prodotti basati su materiale di devono essere trattati come potenzialmente infettivi. I materiali di partenza da cui è stato derivato questo prodotto sono stati sottoposti a screening per l antigene di superficie dell epatite B e per la presenza di anticorpi contro l epatite C e HIV-1/2 (AIDS) tramite metodi approvati dalla FDA, e sono risultati negativi ai test. Siccome, però, nessun metodo conosciuto offre la totale certezza che i prodotti derivati da sangue umano non possano trasmettere questi o altri agenti infettivi, tutti i controlli, i campioni di siero e l attrezzatura che venga a contatto con questi campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi e decontaminati o smaltiti seguendo le precauzioni necessarie per i materiali che pongono un rischio biologico. I CDC (Centers for Disease Control) e i National Institutes of Health statunitensi raccomandano di manipolare gli agenti potenzialmente infettivi in strutture con un livello di biosicurezza 2, 1,2 3. Durante la manipolazione dei reagenti del kit, indossare dispositivi di protezione individuale quali, in modo non limitativo, guanti e camice da laboratorio. Lavarsi bene le mani una volta terminato il test. 4. Non pipettare con la bocca. 5. Non fumare, bere, mangiare, manipolare lenti a contatto o truccarsi nelle aree in cui siano in utilizzo i reagenti del kit e/o campioni umani. 6. Smaltire gli standard non utilizzati in base alle normative locali, provinciali e nazionali. 7. La contaminazione dei campioni dei pazienti o dei reagenti può determinare risultati errati. Utilizzare tecniche asettiche. 8. Pipettare e manipolare gli standard con cautela per evitare di mescolarli con quelli contenuti nei pozzetti adiacenti. 9. Utilizzare tecniche di pipettamento adeguate e mantenere lo stesso tipo di tecnica per l'intera procedura per assicurare valori ottimali e riproducibili. 10. Non sostituire o miscelare standard provenienti da lotti diversi o di altri produttori. 11. Non scambiare i tappi delle provette. Questo può comportarne la contaminazione e compromettere i risultati del test. 12. Non riutilizzare dischi universali già esposti ai campioni dei pazienti o ai reagenti. 13. Smaltire il disco usato senza staccare o rimuovere il nastro di copertura. ISTRUZIONI PER L USO A. AREA DI ESTRAZIONE DEGLI STANDARD DI QUANTIFICAZIONE Operare in un area dedicata all estrazione. La preparazione degli standard di quantificazione per l'estrazione deve essere eseguita in una cabina di biosicurezza. Estrazione mediante il metodo Roche MagNA Pure LC 1. Estrarre gli standard di quantificazione utilizzando il kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid e lo strumento Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Per eseguire l estrazione degli acidi nucleici utilizzando questo kit, fare riferimento alle istruzioni per l'uso del produttore. 2. Nel menu a discesa Protocol [Protocollo] sul sistema MagNA Pure LC, selezionare Total NA [Acidi nucleici totali], quindi Total NA Variable_elution_volume.blk dall elenco. In questo modo verranno caricate le impostazioni adeguate per la sessione. 3. Il Sample Protocol [Protocollo campione] deve essere Total NA Variable_elution_volume. 4. Impostare il Sample Volume [Volume campione] su 200 µl e il volume di eluizione su 50 µl. 5. Impostare il volume di diluizione su zero per tutti i campioni. 6. Verificare che il Post Elution Protocol [Protocollo post-eluizione] sia impostato su None [Nessuno]. 7. Verificare che gli standard di quantificazione e il controllo no template (NTC) siano correttamente posizionati sulla cartuccia campione. 8. Miscelare ciascuno standard e l NTC per 2-4 secondi e centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 9. Pipettare 200 µl di ciascuno standard e dell NTC nella posizione corrispondente della cartuccia campione. 10. Controllare visivamente il livello degli standard e dell NTC nella cartuccia campione per accertarsi che i campioni siano stati effettivamente aggiunti. 11. Miscelare 2 volte con colpi di vortex il controllo interno di estrazione ed amplificazione (IC) e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul fondo della provetta. 12. Per ciascun set di standard, pipettare 100 µl di IC in 6 ml di tampone di lisi in una provetta conica. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio corretto sullo strumento di estrazione MagNA Pure.

Simplexa BKV Pagina 3 13. Trasferire la cartuccia campione sullo strumento MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor e avviare la sessione di estrazione. 14. Una volta completata l estrazione degli acidi nucleici, la cartuccia contenente gli standard estratti può essere rimossa dal MagNA Pure e sigillata. Conservare il DNA estratto ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C fino al suo utilizzo. Non si consiglia di conservare gli standard estratti a questa temperatura per lunghi periodi. Mantenere i campioni di DNA estratti su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco. Estrazione mediante il metodo biomérieux NucliSENS easymag 1. Per il funzionamento dello strumento e del software, fare riferimento al manuale d'uso NucliSENS easymag. 2. Sul software NucliSENS easymag, scegliere Generic template [Templato generico] con le seguenti impostazioni: Default Request [Richiesta predefinita]: Generic 2.0.1 (o equivalente) Run Name Prefix [Prefisso nome sessione]: (come appropriato) Sample ID prefix [Prefisso ID campione]: (come appropriato) Sample Type [Tipo di campione]: Primary [Primario] Workflow Defaults [Valori predefiniti flusso di lavoro]: On-board lysis Incubation [Incubazione di lisi integrata] On-board Silica Incubation [Incubazione silice integrata] Sample Addition Guidance Off [Aggiunta assistita campione disattivata] Reagent Tracking [Tracciamento reagenti]: Tracciamento reagenti di lisi, silice, controllo interno disattivato 3. Inserire le informazioni sul singolo campione nella schermata Extraction Request [Richiesta estrazione] come indicato di seguito. Sample ID [ID campione]: (Inserire il nome del campione) Request [Richiesta]: Generic 2.0.1 (o equivalente) Volume (ml): 0,200 Eluate [Eluato] (µl): 50 Type [Tipo]: Primary [Primario] Priority [Priorità]: Normal [Normale] Matrix [Matrice]: Other [Altro] 4. Creare una Extraction Run [Sessione di estrazione] nel software NucliSENS easymag in base al manuale d'uso. 5. Miscelare ciascuno standard per 2-4 secondi e centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 6. Pipettare 200 µl di standard e del controllo no template nei contenitori dei campioni. 7. Miscelare 2 volte il controllo interno (IC) con colpi di vortex e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul fondo della provetta. 8. Pipettare 5 µl di IC in ogni standard e in tutti i pozzetti di controllo. Sostituire il puntale tra un campione e l altro. 9. Caricare i contenitori dei campioni, i nuovi materiali monouso per l'aspiratore e i reagenti sullo strumento easymag in base al manuale d'uso. 10. Avviare la lisi integrata e incubare i campioni lisati per 10 minuti prima di aggiungere la miscela di silice magnetica. 11. Durante il periodo di incubazione della lisi, preparare la miscela di silice magnetica. Mescolare la silice e diluire in acqua priva di nucleasi aggiungendo 1 parte di silice magnetica a 3 parti di acqua priva di nucleasi (per esempio, 270 µl di silice magnetica + 810 µl di acqua priva di nucleasi). Preparare un minimo di 135 µl di miscela di silice magnetica per campione. 12. Per trasferire la miscela di silice nei pozzetti della strip per ELISA, mescolare la miscela di silice magnetica e usare 1 puntale e la modalità operativa P2 della pipetta Biohit. Premere Start per aspirare 1050 µl di miscela di silice magnetica, quindi premere di nuovo Start scartando il primo colpo nella provetta della miscela di silice. Premere Start per erogare 125 µl di miscela di silice magnetica negli 8 singoli pozzetti della strip per ELISA. Se necessario, ripetere per le altre strip per ELISA. 13. Dopo i 10 minuti dell'incubazione di lisi, utilizzare 8 puntali (per ogni strip per ELISA) e la modalità operativa P3 della pipetta Biohit per trasferire 100 µl di miscela di silice magnetica nel contenitore di ogni campione. Posizionare i puntali nei pozzetti delle strip per ELISA e premere Start per miscelare e aspirare la miscela di silice magnetica. 14. Trasferire la miscela di silice magnetica nell appropriato contenitore del campione e posizionare il puntale nel campione al di sotto del livello del liquido. Premere Start per aspirare, distribuire e mescolare (x3) la silice magnetica e i campioni. Assicurarsi che il puntale rimanga sotto il livello del liquido, per garantire una miscelazione corretta. 15. Ripetere i passaggi 13 e 14 negli altri contenitori dei campioni. 16. Dopo l'aggiunta della miscela di silice magnetica a tutti i contenitori dei campioni, avviare la sessione di estrazione. 17. Al termine della sessione, togliere i contenitori dei campioni dallo strumento. Se i campioni non devono essere utilizzati subito, trasferirli in provette singole per ridurre al minimo la possibilità che la silice magnetica ricada nel campione. Conservare il DNA estratto a una temperatura compresa tra 2 e 8 C fino al suo utilizzo. Si sconsiglia di conservare i campioni estratti a questa temperatura per lunghi periodi. Tenere il DNA estratto su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco. B. IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER PCR IN TEMPO REALE 1. Fare riferimento al Manuale dell operatore dell Integrated Cycler per informazioni dettagliate su come configurare il software Integrated Cycler Studio e aggiungere una definizione dell analisi, stabilire una curva standard (sessione di calibrazione) e analizzare i test compiuti con l Integrated Cycler.

Simplexa BKV Pagina 4 Nota: nella sessione di calibrazione possono essere caricati solo gli standard di quantificazione e il controllo no template. I campioni dei pazienti e i controlli positivi possono essere analizzati quando sia stata portata a termine una sessione di calibrazione valida. Esempio di layout del disco 1 2 3 A QS-1 QS-3 QS-5 B QS-1 QS-3 QS-5 C QS-1 QS-3 QS-5 D QS-1 QS-3 QS-5 E QS-2 QS-4 NTC F QS-2 QS-4 G QS-2 QS-4 H QS-2 QS-4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C. AREA DI PREPARAZIONE REAGENTI Area dedicata alla preparazione della miscela di reazione per il dosaggio Simplexa BKV. 1. Lasciare scongelare la miscela di primer e la miscela master a temperatura ambiente (tra 18 e 25 C circa). Ogni flaconcino compreso nel kit contiene reagente sufficiente per 50 reazioni. Prima di ogni uso, mescolare delicatamente la miscela di primer e la miscela master invertendo 6-8 volte, quindi centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 2. Preparare il volume richiesto di miscela di reazione in una provetta in polipropilene per microcentrifuga di dimensioni adeguate, pipettando il volume di ogni componente come indicato nella tabella sotto. Volumi della miscela di reazione Miscela di reazione Miscela di reazione Reagente Volume / 1 reazione Volume / 24 reazioni Simplexa Master Mix 4,0 µl 96 µl Simplexa BKV Primer Mix 1,0 µl 24 µl Volume totale 5,0 µl 120 µl 3. Mescolare delicatamente la miscela di reazione per inversione o pipettando 8-10 volte. 4. Centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta. 5. Procedere all impostazione della PCR. 6. Utilizzare la miscela di reazione entro un ora dalla preparazione. Se l impostazione della PCR non viene eseguita immediatamente, conservare la miscela di reazione preparata ad una temperatura compresa tra 2 e 8 C. D. AREA DI AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR IN TEMPO REALE Operare in un area dedicata alla preparazione del disco universale a 96 pozzetti per il saggio Simplexa BKV. Durante l'esecuzione della seguente procedura, fare riferimento all esempio di layout del disco nella sezione B: 1. Aggiungere 5,0 µl di miscela di reazione a ogni pozzetto. 2. Aggiungere 5,0 µl di ogni standard di quantificazione estratto al giusto pozzetto QS. 3. Aggiungere 5,0 µl del controllo no template estratto al pozzetto NTC. 4. Coprire il disco con il nastro di copertura per dischi universali. 5. Aprire il coperchio dell Integrated Cycler. 6. Posizionare il disco universale sigillato sulla piastra. 7. Chiudere delicatamente il coperchio. 8. Fare clic su Run [Esegui]. 9. Fare clic su Start [Inizia]. E. ANALISI DELLA CURVA STANDARD (SESSIONE DI CALIBRAZIONE) 1. Il software Integrated Cycler Studio determinerà automaticamente se la sessione di calibrazione è valida. a. Se valida, la sessione di calibrazione sarà automaticamente salvata in modo da permetterne l uso. b. Se non valida, la sessione di calibrazione sarà eliminata e sarà necessario eseguire una nuova sessione di calibrazione prima di poter analizzare i campioni dei pazienti. LIMITAZIONI 1. Da utilizzarsi con il kit Simplexa BKV. 2. Il dosaggio deve essere eseguito solo da personale adeguatamente formato e che abbia acquisito familiarità con le procedure d esame e l'interpretazione dei risultati. 3. Il software Integrated Cycler Studio mantiene in memoria l'ultima sessione di calibrazione valida per quantificare i campioni ottenuti dai pazienti. L estrazione deve essere eseguita utilizzando per gli standard di quantificazione e i campioni dei pazienti la stessa metodica; in caso contrario, si otterranno risultati errati.

Simplexa BKV Pagina 5 BIBLIOGRAFIA 1. NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd Ed. (1999). 2. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71 30855, Langenhagen-Hannover, Germania INFORMAZIONI PER GLI ORDINI PI.MOL2310 Rev. B In data: 20 aprile 2012 Telefono: Fax: ASSISTENZA TECNICA (800) 838-4548 (solo USA) (562) 240-6510 +1 - (562) 240-6500 (dall'estero) Telefono: Fax: (800) 838-4548 (solo USA) (562) 240-6526 +1 - (562) 240-6500 (dall'estero) Visitate il nostro sito web all indirizzo www.focusdx.com Cypress, California 90630, Stati Uniti