DIAGNOSTICA ENZIMATICA GLI ENZIMI SI DOSANO SU DIVERSI LIQUIDI BIOLOGICI: - - PLASMA O SIERO URINE, SALIVA, ESSUDATI, ecc. I CONTESTI DIAGNOSTICI IN CUI SI USANO QUESTI DOSAGGI SONO DUE: 1. Valutazione ahvità di produzione dell enzima: malahe geneqco- metaboliche con dell ahvità enzimaqca (per es., fenilchetonuria, glicogenosi, ecc.) 2. Valutazione della quanqtà di enzima rilasciata dalle cellule nei liquidi biologici per iperproduzione o danno cellulare: dei valori (per es. infarto del miocardio, tumori, ecc.) Generalmente per misura di un enzima si intende la misura della sua a:vità enzima@ca che si ohene misurando la quanqtà di substrato che l enzima presente nel campione trasforma nel prodo[o nell unità di tempo. Enzimi di valore diagnosqco I dosaggi enzimaqci comunemente usaq a scopo diagnosqco sono numericamente limitaq: solo una decina sono di impiego rouqnario e quesq oggi cosqtuiscono circa il 30% del carico di lavoro di un comune laboratorio diagnosqco. 1
ENZIMI DI INTERESSE DIAGNOSTICO GLI ENZIMI PRESENTI NEL SANGUE POSSONO ESSERE CLASSIFICATI IN - ENZIMI SPECIFICI (per es., quelli coinvol@ nella coagulazione del sangue) - ENZIMI SECRETI O RIASSORBITI (svolgono la loro funzione in altri tessu@) - ENZIMI CELLULARI (che svolgono funzioni intracellulari e sono riversa@ nel sangue nel turnover cellulare) CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI usa@ a scopo diagnos@co Gli aumen@ o le diminuzioni di a:vità enzima@che sieriche sono sempre correla@ ad alterazioni della funzionalità cellulare 2
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ORGANI DIVERSI ESPRIMONO UN PATTERN ENZIMATICO DIVERSO Organi diversi hanno una diversa dotazione enzimaqca (differenze metaboliche) Ci sono enzimi organo- specifici: glutammatodeidrogenasi (GLDH o GD) è l enzima organo- specifico del fegato, mentre la crea@na chinasi (CK) lo è del muscolo ORGANI DIVERSI ESPRIMONO ISOENZIMI DIVERSI Gli isoenzimi, o isozimi, sono forme mulqple di un enzima che catalizzano la stessa reazione, ma differiscono nella stru[ura o nella composizione in subunità. Ad esempio, la latato deidrogenasi (LDH) è una proteina tetramerica cosqtuita da due differenq catene polipepqdiche, M ed H. Dalle diverse combinazioni delle due catene si hanno cinque isoenzimi: M4, M3H, M2H2, MH3, H4. La creaqnachinasi (CK) è una proteina dimerica cosqtuita da due differenq catene polipepqdiche, B e M. Dalle diverse combinazioni di queste due catene si hanno tre isoenzimi: BB, BM e MM. Hanno cara[erisqche fisiche (i.e., massa), chimiche (i.e., composizione, pi) e biochimiche (ph ohmale, costanq cataliqche (Km, Vmax)) diverse, e sono pertanto discriminabili con tecniche analiqche specifiche. Sono presenq in tessuq diversi. Per es., la M4 è prevalentemente espressa nel muscolo scheletrico, mentre la forma H4 è presente solo nel miocardio. Altro esempio, la fosfatasi alcalina acida è presente nella prostata, la fosfatasi alcalina basica è presente nel fegato e nelle ossa. Poiché gli isoenzimi sono distribuiq in maniera differente nei vari organi, l'analisi quanqtaqva di quesq consente di risalire all'organo bersaglio della patologia. Dunque livelli alteraq di quesq sono indici specifici di alcune malahe come quelle cardiache, muscolari, ossee, etc., per questo sono di grande uqlità diagnosqca. 4
ISOENZIMI DELLA CK Crea@na chinasi (CK) LaTato deidrogenasi (LDH) 5
FOSFATASI ALCALINA (ALP) La ALP è presente sopra[u[o nel fegato (canalicoli biliari) e nelle ossa (osteoblasq), placenta e rene. La ALP aumenta nelle: Affezioni del sistema epato- biliare (poco in cirrosi, epaqte); Alterazioni della sostanza ossea (rachiqsmo, metastasi ossee, Morbo di Paget); IperparaQroidismo Patologie infiammatorie croniche intesqnali UQlità diagnosqca della misura dell ahvità della ALP nel sangue Un aumento elevato (5 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: cirrosi biliare ostruzione delle vie biliari morbo di Paget altre patologie Un aumento moderato (3-5 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: epatopaqe mononucleosi infehva altre patologie Un aumento lieve (fino a 3 volte superiore ai valori di riferimento) può essere dovuto a situazioni come: epaqte virale fra[ure gravidanza Una diminuzione può essere dovuta a situazioni come: ipoqroidismo scorbuto cachessia anemie Valori di riferimento I valori dell ahvità nel sangue della fosfatasi alcalina normalmente variano fra 110 e 700 UI/l nei bambini fino a un anno, fra 110 e 550 UI/l da 1 anno a 10 anni, fra 130 e 700 UI/l da 10 a 15 anni, fra 50 e 220 UI/l negli adulq. 6
Metodi Enzima@ci di Analisi Analisi Enzima+ca di Substra+ Gli enzimi vengono usaq spesso per idenqficare e/o per quanqficare sostanze chimiche specifiche in soluzione. I vantaggi sono derivaq dal fa[o che le reazioni enzimaqche sono veloci e molto specifiche per la natura dei substraq e che, anche in condizioni molto blande, catalizzano reazioni che raramente procedono a velocità significaqve. La specificità degli enzimi può superare la necessità di rimuovere materiali interferenq dai campioni. Saggi di A:vità Enzima@ca È possibile determinare la quan@tà di enzimi par@colari in fluidi biologici misurandone l a:vità con substra@ specifici. Per queste determinazioni si misura la velocità di conversione di un par@colare substrato in prodoto invece del grado a cui procede la reazione. La cine@ca della maggior parte delle reazioni enzima@che è descrita dalla equazione di Michaelis- Menten: La velocità di una reazione enzimaqca aumenta con l aumentare della [S] fino a raggiungere un limite oltre il quale non aumenta più (saturazione = tu[o E è legato a S so[oforma di complesso ES) ma resta costante a meno che non si aumenta [E] 7
Per valutare l a:vità enzima@ca, viene impiegata una concentrazione di substrato [S] >> K M in modo che la V 0 misurata corrisponda con buona approssimazione alla V max : Queste condizioni sperimentali sono note come cine@ca di ordine zero: non c è alcuna dipendenza dalla concentrazione del substrato, la velocità osservata è proporzionale alla concentrazione di enzima. Unità di a:vità enzima@ca e dosaggio degli Enzimi Catal (kat): è la quan@tà di enzima che converte 1 mole di reagente nel prodoto in 1 secondo nelle condizioni di reazione standard (o:mali). L Unità internazionale (U o UI): corrisponde alla quan@tà di enzima che converte 1 µmole di reagente nel prodoto in 1 minuto. Poiché 1 µmole /min = 1.67 10-8 moli/s quindi U = 1.67 10-8 kat. La concentrazione enzima@ca è espressa come UI/L o sotomul@pli UI/mL (in alcuni casi anche UI/mg). FaTori che influenzano le reazioni catalizzate dagli enzimi Inibitori Mol@ enzimi sono inibi@ da varie sostanze, pertanto bisogna tenere conto di ques@ fatori e usare controlli appropria@. Per es., agen@ chelan@, come citrato e altri compos@ capaci di formare complessi bidenta@ con metalli sono spesso inibitori poten@ di alcuni enzimi metallo- dipenden@ come le chinasi. ph Temperatura CofaTori (co- enzimi e cofatori metallici) 8
ESERCITAZIONE: Misurazione sperimentale dei parametri cine@ci della fosfatasi alcalina Misure sperimentali e analisi dei da@ cine@ci Per misurare la velocità di reazione abbiamo bisogno di un sistema per seguire la formazione del prodoto o il consumo di substrato. Via via che il substrato viene consumato la velocità diminuisce fino a quando alla fine viene raggiunto l equilibrio. Di regola, si preferisce predisporre una serie di esperimen@ tu: alla stessa concentrazione di enzima, ma a diverse concentrazioni di substrato e misurare la velocità iniziale (V 0 ). Saggio SpeTrofotometrico Spesso si usano metodi spetrofotometrici per monitorare le reazioni enzima@che. Ques@ possono essere molto convenien@ se il substrato o il prodoto contengono un gruppo cromoforo (o fluoroforo) dis@nto. Assorbimento della radiazione UV/visibile dovuto a transizioni energeqche degli ele[roni degli straq esterni delle molecole. Quando la luce colpisce una molecola essa può essere trasmessa (nessuna interazione) o assorbita. Il livello di assorbimento della radiazione che a[raversa un campione di sostanza in soluzione viene misurato da uno strumento noto come spe[rofotometro. 9
Legge di Lambert e Beer L assorbimento di radiazione luminosa da parte di una sostanza in soluzione viene descri[o quanqtaqvamente con la legge di Lambert e Beer, l equazione fondamentale della spe[rofotometria. A= Assorbanza (o densità ohca); è un numero adimensionale, il cui valore varia linearmente con la concentrazione della soluzione. ε=coefficiente di esqnzione molare (mm - 1 xcm - 1 ); la densità ohca di una soluzione a concentrazione unitaria e misurata in un cammino ohco lungo 1 cm. È una costante specifica di ogni sostanza a una data lunghezza d onda. d=cammino ohco della soluzione (cm). C=Concentrazione della soluzione della sostanza (mm) Reazione usata per la misura dell a:vità enzima@ca della fosfatasi alcalina PNPP PNP ph = 9 2 mm Mg 2+ La fosfatasi alcalina è un enzima Mg- dipendente che catalizza l idrolisi di tu: i fosfomonoesteri. Si esegue il saggio enzima@co con un composto non naturale sinte@zzato chimicamente: il p- nitrofenilfosfato (PNPP) che viene idrolizzato a p- nitrofenolo (PNP) e fosfato (P i ). La forma ionica del PNP è colorata (massimo di assorbimento a 405 nm) quindi la reazione può essere misurata spetrofotometricamente. Poiché la variazione di [S] rispeto a t è pressoché lineare nelle fasi iniziali è possibile eseguire analisi accurate di V in funzione di [S]. 10
16/12/14 Una volta otenu@ i da@ riguardo l andamento di V in funzione di [S] come è possibile determinare KM e kcat? Comunemente viene usato il grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver- Burk che è un riarrangiamento dell equazione di Michaelis- Menten: 1/V = (KM+[S])/(Vmax[S])=KM/(Vmax[S])+[S] /(Vmax[S]) Ovvero: 1/V = KM/(Vmax[S])+1 /Vmax Quando 1/[S] = 0 significa che [S] è infinitamente grande e la velocità di reazione è al suo valore massimo. Si no@ che avendo Vmax e [E]t si può calcolare kcat, sapendo che Vmax = kcat[e]t. Per otenere il valore di Km estrapoliamo il grafico di Lineweaver- Burk a un punto ipote@co in cui 1/V=0. 11