2 a a ESERCIITAZIIONE 1 LA REAZIONE DI HILL: MISURA DELLA VELOCITA' DI TRASPORTO ELETTRONICO Nella fotosintesi ossigenica l energia della, assorbita dai pigmenti fotosintetici, viene utilizzata per trasferire elettroni contro gradiente elettrochimico (dal P680 al P680* e dal P700 al P700*) dall H 2 O ad un accettore con potenziale redox molto più negativo. In vivo, gli accettori finali di elettroni sono la ferridossina e il NADP +, che a loro volta costituiscono i donatori di elettroni nella fissazione fotosintetica di CO 2 e negli altri processi riduttivi, come ad esempio l assimilazione dell azoto, che si svolgono nei cloroplasti.
2 Come conseguenza del trasporto di elettroni non-ciclico attraverso i due fotosistemi si ha un pompaggio attivo di protoni dallo stroma al lume tilacoidale. Ciò avviene in conseguenza della dissociazione dell'acqua (lato luminale - 2H 2 O = 4H + + 4 e - + O 2 ) e del ciclo dei chinoni. Alla, quando procede il trasporto non ciclico degli elettroni, si viene a creare un ph di circa 4 unità tra il lume e lo stroma (ph = 8 nello stroma e ph = 4 nel lume) che energizza la sintesi di ATP. Questa avviene attraverso l'atp sintasi la quale risulta costituita da due porzioni: la porzione CF 1, attraverso la quale si ha il pompaggio di protoni dal lume verso lo stroma e la porzione CF 0, che permette la sintesi di ATP nel lato stromatico. Il funzionamento dell'atp sintasi determina da un lato sintesi di ATP e dall'altro la continua dissipazione del gradiente protonico creatosi durante il trasporto elettronico.
3 Tra i fattori che controllano la velocità di trasporto elettronico si hanno: 1) LUCE-BUIO: al buio non avviene il trasporto elettronico e non formandosi il gradiente protonico non si ha neppure la fosforilazione. In aggiunta la mancanza di fosforilazione è dovuta anche alla inattivazione delle ATP sintasi al buio. 2) PRESENZA/ASSENZA DI ADP: perché si abbia sintesi di ATP c'è bisogno di ADP e di P i. Se manca l'adp si ha trasporto elettronico ma ad una velocità inferiore rispetto a quella che si avrebbe in presenza di ADP. Questo perché in assenza di fosforilazione non si ha dissipazione del gradiente protonico e questo rallenta notevolmente il trasporto elettronico. Infatti tanto maggiore è il gradiente protonico tra lume e stroma ( ph), tanto minore è la velocità di trasporto elettronico (se il gradiente protonico non viene dissipato si ha un rallentamento del trasporto elettronico). 3) DISACCOPPIANTI/PROTONOFORI: i disaccoppianti sono un gruppo eterogeneo di composti che inibiscono la sintesi cloroplastica o mitocondriale di ATP, ma che spesso sono in grado di stimolare la velocità di trasporto elettronico. I disaccoppianti agiscono dissipando il gradiente protonico e quindi stimolando la velocità di trasporto elettronico. Il disaccoppiante che viene usato nella
4 presente esercitazione è il solfato d'ammonio NH 4 (SO 4 ) 2. L'NH 3 che si ottiene dalla dissociazione di questo composto penetra attraverso la membrana tilacoidale nel lume del tilacoide e qui si protona, sottraendo quindi H + al lume e dissipando quindi il gradiente protonico. Questo provoca una stimolazione della velocità di trasporto elettronico. NH 3 NH 4 + Abbiamo detto che l'accettore terminale degli elettroni nel trasporto non-ciclico è il NADP +. Tuttavia facendo avvenire il trasporto elettronico in vitro, utilizzando delle membrane tilacoidali isolate, è possibile utilizzare anche altri accettori artificiali di elettroni che in base a cambiamenti cromatici, a seconda del loro stato di ossidazione o di riduzione, ci indicano la velocità del trasporto elettronico. Nell'esperimento oggetto della presente esercitazione, per evidenziare il processo di trasporto fotosintetico di elettroni in preparati di tilacoidi isolati da foglie di spinacio, verrà utilizzato come
5 accettore di elettroni artificiale il diclorofenoloindofenolo (DPIP), il cui colore varia a seconda dello stato di ossidazione: DPIP ox = blu DPIP rid = incolore PROTOCOLLO SPERIMENTALE 1 - ISOLAMENTO DEI TILACOIDI Pesare circa 2 grammi di foglia di spinacio e sminuzzarli in un mortaio pre-rafreddato. Omogeneizzare il tessuto con 2,5 ml di miscela di estrazione (tampone K-fosfato 20 mm, ph 7,5; saccarosio 0,5 M; KCl 10 mm). Aggiungere altri 2,5 ml di miscela di estrazione e versare l'omogenato in una provetta da centrifuga. Filtrare con garza e centrifugare a 2500 rpm per 15 min. Scartare il sovranatante e risospendere il precipitato con 5 ml di miscela di estrazione fino ad ottenere una sospensione omogenea, che verrà conservata in ghiaccio. Tutte le operazioni devono essere svolte ad una temperatura di 0-4 C. Prelevare successivamente dalla sospensione di tilacoidi 1 ml ed incubarlo in una provetta per 5 min in un bagno maria bollente. 2- MISURA DELLA QUANTITÀ DI CLOROFILLA PRESENTE NELLA SOSPENSIONE DI TILACOIDI Prelevare 5 µl dalla sospensione di tilacoidi e aggiungere 995 µl di una soluzione di acetone all'80% in una provetta eppendorf. Centrifugare a 12000 rpm per 5 minuti e leggere allo spettrofotometro a 645 e
6 663 nm. Calcolare la concentrazione di clorofilla totale (a + b) nella sospensione di tilacoidi in mg/ml di sospensione di tilacoidi utilizzando le formule già viste nella 1 a esercitazione. Cl a = [(12,7) x (lettura a 663)] -[(2,69) x (lettura a 645)] Cl b = [(22,9) x (lettura a 645)] -[(4,68) x (lettura a 663)] Alla fine dei calcoli occorrerà dividere per 1000, dato che il valore trovato è relativo a 1000 ml, e poi moltiplicare per 200, tenendo conto della diluizione effettuata (5 µl dalla sospensione di tilacoidi e aggiungere 995 µl di una soluzione di acetone). 3 - DETERMINAZIONE DELLA VELOCITA' DI TRASPORTO ELETTRONICO. Con questo sistema sperimentale valuteremo l'effetto dei substrati della fosforilazione (aggiunta o meno di ADP) e di un disaccoppiante (solfato d'ammonio) sulla velocità del trasporto fotosintetico. Come disaccoppiante verrà utilizzato il solfato d'ammonio: l'ammoniaca penetra attraverso le membrane dei tilacoidi solo nella forma non protonata (NH 3 ) e, protonandosi all'interno dei tilacoidi, aumenta il ph dello spazio interno. Procedura sperimentale: Mettere nelle 6 provette i reagenti (tranne la sospensione di tilacoidi) nelle quantità indicate nello schema seguente; campione 1: permette di valutare come influisce sul trasporto elettronico la mancanza di ADP (ccaamppi ioonnee vveer rddee) campione 2: permette di valutare la velocità di trasporto elettronico in condizioni ottimali (in quanto presente anche ADP - ccaamppi ioonnee vveer rddee) campione 3: rappresenta il controllo negativo e si ottiene aggiungendo tilacoidi bolliti; in questa situazione viene inibito il trasporto elettronico e quindi il colore della provetta è quello dato dall'accettore allo stato ossidato e pertanto blu (ccaamppi ioonnee bbl luu)
7 campione 4: in questo campione non avviene la fosforilazione perché non mettiamo ADP e perché mettiamo il disaccoppiante. Poiché l'aggiunta di questo dissipa il gradiente protonico avremo una stimolazione del trasporto elettronico. REAZIONE DI HILL AL MASSIMO (campione verde nel più breve tempo) campione 5: non si ha trasporto perché la reazione viene fatta avvenire al buio (ccaamppi ioonnee bbl luu) campione 6: in questa provetta si mette soltanto la sospensione di tilacoidi, senza accettore finale e senza ADP, quindi non avviene alcun trasporto. Il campione pertanto rir imaannee vveer rddee. CAMPIONE 1 2 3 4 5 6 DPIP (0,4 mm) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 ---- ADP-Mg (ADP 10 mm + ---- 0,3 0,3 ---- 0,3 ---- MgSO 4 0,1 M) (NH 4 ) 2 SO 4 (50 mm) ---- ---- ---- 0,3 ---- ---- Miscela di estrazione 1,5 1,2 1,2 1,2 1,2 2,5 Tilacoidi 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 BOLLITI Incubazione buio Mescolarli, agitando il fondo delle provette; avvolgere le provette nella carta stagnola; aggiungere 0,5 ml di sospensione di tilacoidi, secondo lo schema e agitare; fare un bianco costituito da 3 ml di miscela di estrazione e leggere allo spettrofotometro (λ = 600 nm) tutte le provette contro il bianco, annotando i valori nella tabella riassuntiva riportata di seguito (lettura al tempo 0); esporre i campioni 1-2-3-4-6 alla ; osservare ed annotare le variazioni di colore nelle diverse provette nel corso del tempo;
8 quando si osserva nella provetta 4 la variazione di colore dal blu al verde si stoppa il tempo di incubazione e per quantificare l'entità di tale variazione cromatica (tanto più il campione si è decolorato e tanto maggiore sarà il trasporto elettronico) misurare allo spettrofotometro l'assorbimento a 600 nm di tutti i campioni, compreso quello incubato al buio, annotando sempre i valori nella tabella riassuntiva (assorbimento finale); Facendo la differenza tra Abs finale e Abs iniziale si otterrà anche una graduatoria della velocità di trasporto. Tanto più grande è il e tanto maggiore è la velocità. N.B. Le soluzioni dei diversi reagenti sono tutte sciolte nella miscela di estrazione. Tabella riassuntiva velocità di trasporto elettronico CAMPIONE Abs 600 nm (iniziale) Abs 600 nm (finale) Abs 600 nm (1) Trasporto senza fosforilazione (2) Trasporto con fosforilazione (3) Trasporto senza fosforilazione con tilacoidi bolliti, quindi senza integrità di membrana (4) Trasporto con ammonio solfato come agente disaccoppiante (5) Trasporto senza esposizione alla (6) Provetta controllo con tilacoidi, ma senza DPIP 1 2 3 4 5 6 buio 1 2 3 4 5 6