RICERCA INFEZIONE DA CYTOMEGALOVIRUS CON ROCHE LIGHTCYCLER PCR

METODO NAZIONALE STANDARD RICERCA INFEZIONE DA CYTOMEGALOVIRUS CON ROCHE LIGHTCYCLER PCR VSOP 35 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections RICERCA INFEZIONE DA CYTOMEGALOVIRUS CON ROCHE LIGHTCYCLER TM PCR Revisione no: 2.1 Data di revisione: 14.08.07 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina no: Pagina 1 di 14 Riferimento no: VSOP 35i2.1

STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite e-mail all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2006). Investigation of cytomegalovirus infection by Roche LightCycler PCR. National Standard Method VSOP 35 Emissione 2.1. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_virology.asp. Revisione no: 2.1 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 2 di 14

INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO DEL DOCUMENTO... 5 INTRODUZIONE... 5 GENERALITA... 5 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA... 6 1.1 RACCOLTA DEL CAMPIONE........... 6 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE............ 6 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE..... 6 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE... 6 2.1 TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE... 6 2.2 TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO E METODO DI PRELIEVO...... 6 2.3 QUANTITA ADEGUATA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI 6 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE... 6 3.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA..... 6 6 3.2 ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO....... 4 PROCEDURA SUL CAMPIONE... 6 4.1 STRUMENTAZIONE....... 6 4.2 REAGENTI........ 7 5 PROCEDURA SUL CAMPIONE... 7 5.1 SELEZIONE DELLA PROVA.. 7 5.2 RICERCA..... 7 5.3 RISULTATO DELL ANALISI.. 8 6 ASSICURAZIONE DI QUALITA... 10 6.1 VALUTAZIONE DEL PREPARATO... 10 6.2 ASSICURAZIONE DI QUALITA INTERNA ED ESTERNA.. 10 7 LIMITI... 10 8 PROCEDURA DI REFERTAZIONE... 11 8.1 REFERTO....... 11 8.2 TEMPO DI REFERTAZIONE....... 11 9 SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI REGIONALI ED AL CDSC CENTER FOR INFECTIONS)... 11 10 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI... 11 11 ALLEGATO: SEQUENZA DI PRIMER E PROBE... 12 BIBLIOGRAFIA... 13 Revisione no: 2.1 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 3 di 14

PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato VSOP 35 Ricerca di infezione da cytomegalovirus con Roche LightCycler Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data 4/ 14.08.07 Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina 2 2.1 7 5.2.1 Sessione(i) interessate 5.3 Modifica Cancellato dalla tabella all esterità 5 Inserito commento al terzo paragrafo Revisione no: 2.1 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 4 di 14

RICERCA DI INFEZIONE DA CITOMEGALOVIRUS CON ROCHE LIGHTCYCLER PCR Tipologia dei campioni: Sangue intero EDTA, Lavaggio Broncoalveolare, Urine SCOPE DEL DOCUMENTO Questa POS descrive l utilizzo dello strumento Roche LightCycler e l analisi quantitativa in una sola fase con polymerase chain reaction (QPCR) su campioni clinici mediante il rilevamento di sequenza-specifica del citomegalovirus (CMV) con ibridizzazione 2-4. La PCR rappresenta un metodo rapido e sensibile per la diagnosi di infezione da CMV. La QPCR può anche essere utilizzata per monitore l aumento percentuale della concentrazione virale nei pazienti, rilevare quelli a maggior rischio di malattia citomegalica ed indicare quando è appropriato un intervento terapeutico. INTRODUZIONE Generalità Il CMV è la maggior causa di morbilità fra i riceventi di trapianto d organo, pazienti in terapia immunosoppressiva o infetti da HIV 5-7. E importante differenziare la malattia dall infezione da CMV e la diagnosi precoce d infezione consente l immediata somministrazione di terapia antivirale con conseguente riduzione della gravità della malattia stessa. E pertanto importante avere prove sensibili, specifiche e rapide. Le tecniche di PCR quantitativa sono state utilizzate per dimostrare la correlazione fra carica virale e rischio di malattia da CMV 8. A tal fine, la ricerca e l analisi quantitativa del CMV con real time Light Cycler può disporre di metodi sensibili, specifici e rapidi 2. Sono stati descritti altri metodi quantitativi dotati di vantaggi simili a quelli del Roche LightCycler PCR 9,10. I metodi real time sono meno costosi, complessi ed impegnativi per il personale rispetto alle precedenti PCR che si avvalevano dei gel e dell ELISA-PCR e consentono una riduzione del rischio di contaminazione da trascinamento per assenza di manipolazione successiva all amplificazione. Revisione no: 2.1 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 5 di 14

1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA 11-22 1.1 PRELIEVO DEL CAMPIONE Adeguati contrassegni di rischio in accordo con le strategie locali. 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE Sangue, lavaggio broncoalveolare ed urine devono essere raccolti in contenitori sterili a tenuta, chiusi in sacchetti di plastica. E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto. 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Il CMV appartiene ai microrganismi del Gruppo di Rischio 2, fare riferimento alle attuali linee guida per una manipolazione appropriata Eseguire tutte le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza microbiologica Il materiale di rifiuto di sostanze infettive o chimiche deve essere allontanato secondo le direttive di politica locale Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio. 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO OTTIMALE DI PRELIEVO DEL CAMPIONE N/D 2.2 TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO E METODO DI PRELIEVO Campioni di sangue, lavaggio broncoalveolare ed urine devono essere prelevati secondo i protocolli locali. 2.3 QUANTITA ADEGUATA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI N/D 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE 3.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile. 3.2 ACCORGIMENTI SPECIALI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO N/D 4 STRUMENTO E REAGENTI 4.1 STRUMENTO Roche LightCycler Versione 1 o Versione 2 Capillari di reazione LightCycler Adattatori da centrifuga LightCycler Microcentrifuga ad almeno 8000 xg Revisione no: 2.1 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 6 di 14

Provette Eppendorf sterili da 0.5 ml Pipette adatte a volumi da 1 µl a 1000 µl Puntali di pipette aerosol resistenti 4.2 REAGENTI N/D 5 PROCEDURA SUL CAMPIONE 5.1 PROVA DI SELEZIONE N/D 5.2 Ricerca 5.2.1 ESTRAZIONE DELL ACIDO NUCLEICO 23 Metodi di estrazione validati in sede locale per campioni di sangue intero-edta, lavaggio broncoalveolare ed urine. Reagenti richiesti I metodi di seguito specificati devono essere validati presso altri centri REAGENTE Confezione Health Protection Agency QCMV LC FasterStart DNA Master Hibridation Probes Primer (se non si usano confezioni della Health Protection Agency QCMV LC) Probe (se non si usa quello della Health Protection Agency QCMV LC) Materiale di controllo di origine plasmatica standard quantitativi PRODUTTORE/FORNITORE Applied and Functional Genomics, Centre for Infections Roche Diagnostics (Cat. No 2239272) Preparare una scorta di 1 µm di forward primer e 4.5 µm di scorta di reverse primer e conservare a -20 C o 4 C. Il reverse primer è marcato con LC Red 640 e deve essere protetto dalla luce. Le sequenze del primer nucleotidico sono specificate nell Allegato. Il Probe deve essere marcato con fluoresceina all estremità 3'. Preparare µm di scorta e conservare protetto dalla luce a -20 C o 4 C. La sequenza nucleotidica del probe è specificata nell Allegato. Forniti con la confezione della Health Protection Agency QCMV LC o preparati in laboratorio. Se preparati in questa sede devono essere diluiti in 10ng/µL di DNA di sperma di aringhe e conservati a 20 C or 4 C. 5.2.2 AMPLIIFICAZIONE DELLA PCR Confezione della Health Protection Agency QCMV LC Se si usa la confezione della Health Protection Agency QCMV LC, preparare la miscela di reazione nel modo seguente. I volumi indicati sono sufficienti per una reazione. Preparare una quantità di miscela di reazione sufficiente per il numero di campioni, standard quantitativi e controlli da analizzare. FastStart DNA Master Hybridisation probe 2.0 µl Detection Mix 6.0 µl MgCl 2 (fornito con Mastermix) 3.2 µl Acqua (fornita con Mastermix) 3.8 µl Reagenti preparati in laboratorio Se si utilizzano reagenti preparati in laboratorio, allestire la miscela di reazione nel modo seguente. I volumi indicati sono sufficienti per una reazione. Preparare una quantità di miscela di reazione sufficiente per il numero di campioni, standard quantitativi e controlli da analizzare. Revisione no: 2.1 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 7 di 14

FastStart DNA Master Hybridisation probe 2.0 µl Forward Primer 2.0 µl Reverse Primer 2.0 µl Probe 2.0 µl MgCl 2 (fornito con Mastermix) 3.2 µl Acqua (fornita con Mastermix) 3.8 µl Distribuire 15 µl della miscela di reazione in un capillare del LightCycler. Aggiungere 5 µl di estratto del DNA, lo standard qualitativo o il controllo. Chiudere i capillari e centrifugare a 1000 rpm per 10 secondi per far sedimentare la miscela di reazione al fondo del capillare di reazione, Trasferire i capillari nel LightCycler Roche. Predisporre gli standard quantitativi come standard ed assegnare i seguenti valori: QSA = 5.000E+5 (5 x 10 5 ) QSB = 5.000E+4 (5 x 10 4 ) QSC = 5.000E+3 (5 x 10 3 ) QSD = 5.000E+2 (5 x 10 2 ) QSE = 5.000E+1 (5 x 10 1 ) Amplificare il DNA utilizzando i seguenti parametri: Protocollo Temperatura ( C) Tempo a Temperatura (sec) Tasso di transizione ( C/sec) Denaturazione 95 600 20 Nessuna Amplificazione 95 0 20 Nessuna 55 10 20 Singola 72 10 20 Nessuna Melt 95 50 80 40 0 10 0 30 20 20 0.1 20 Acquisizione di fluorescenza Nessuna Nessuna Continua Nessuna 5.3 RESULTATO ANALITICO Analizzare la reazione attivando dal software analitico il Melting Curve Programme e selezionare Melting Curve. Selezionare il canale F2. Per gli standard quantitativi il melting del probe deve essere a 64 C e per i campioni positivi deve essere compreso fra 60-68 C. La Figura 1 dimostra le tipiche curve di melting. I campioni negativi non devono evidenziare picchi di melting del probe. L analisi quantitativa richiede la selezione del programma Quantification programme dal menu analitico principale selezionando Quantification. In primo luogo devono essere analizzate le curve standard, l errore analitico deve essere di scarsa entità e tutte devono evidenziare andamenti simili a quelli previsti (Figure 2 e 3). La validazione della seduta analitica richiede valori standard quantitativi compresi nell intervallo di ± 0.5 log 10 del valore atteso. I campioni che amplificano prima del primo standard o dopo lo standard più basso non possono essere quantizzati per impossibilità di una valutazione accurata. Si possono manifestare amplificazioni non-specifiche, come la formazione di primer-dimeri, ma in questo caso non dovrebbe apparire un corrispondente picco di melting del probe. Questi sono esclusivamente presenti quando si realizza una specifica amplificazione del CMV. Quando si è sviluppato un picco di melting del probe e le curve standard sono accettabili si può determinare il valore quantitativo dei campioni in accertamento. I valori quantitativi esprimono il numero di coppie per quantità di 5 µl di templato inserito. Questi richiedono di essere moltiplicati per 200 per ottenere il numero di copie per ml; per la definizione della concentrazione finale nel paziente deve essere opportunamente considerata qualsiasi concentrazione o diluizione effettuata sul campione. Revisione no: 2.1 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 8 di 14

Figura 1: Curva di melting per standard quantitativo (blue), campione CMV positivo (rosa) e campione CMV negativo (porpora) Figura 2: Amplificazione di standard CMV (QSA-QSE) QSA QSB QSC QSD QSE NEG Revisione no: 2 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 9 di 14 Riferimento no: VSOP 35i2.1

Figura 3: Curva standard ottenuta dagli standard QSA-QSE 6 ASSICURAZIONE DI QUALITA' 6.1 VALUTAZIONE DEL PREPARATO Deve essere istituito un sistema di qualità per garantire un appropriato controllo di qualità interno ed esterno ed il mantenimento della qualità delle procedure di controllo 24,25. E' essenziale che i laboratori dispongano di adeguata validazione di metodi, strumentazione, procedure analitiche proprie o commerciali, dimostrando che sono idonee allo scopo 26. 6.2 ASSICURAZIONE DI QUALITA' INTERNA ED ESTERNA N/D 7 LIMITI Il risultato positivo nella ricerca del DNA dipende da un appropriato prelievo del campione, trasporto e procedura analitica e dalla disponibilità di adeguate/appropriate notizie cliniche. La procedura(e) di questi documenti intende descrivere metodi standard di buona qualità per i tipi di campioni specificati. Possono essere richieste altre procedure ed è essenziale l'interpretazione professionale di un gruppo qualificato. Per cortesia prendere nota che le conoscenze delle malattie infettive cambiano continuamente, anche se questa POS è riveduta regolarmente, potrebbe non includere patogeni emergenti. I limiti di questo metodo sono dovuti alla mancanza di un controllo dell' Amplificazione Interna e pertanto, alla impossibilità di rilevare inibitori. Revisione no: 2 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 10 di 14 Riferimento no: VSOP 35i2.1

8 PROCEDURA DI REFERTAZIONE 8.1 REFERTO I campioni negativi devono essere refertati come: Non rilevato DNA di Citomegalovirus con PCR I campioni positivi devono essere refertati come: Rilevato DNA di Citomegalovirus con PCR Se sono richiesti risultati quantitativi, per i campioni positivi si deve specificare il numero di coppie/ml. e/o log 10 coppie/ml. 8.2 TEMPO DI REFERTAZIONE N/D 9.0 SEGNALAZIONI ALLA HPA 27 (LOCALE E SERVIZI NAZIONALI ED AL CENTRO CDSC PER LE INFEZIONI) Ogni risultato positivo deve essere segnalato al CDSC secondo le linee guida pubblicate. 10 RINGRAZIAMENTI ED INDIRIZZI Questi National Standard Method sono stati iniziati e sviluppati dal Virology Working Group on Standards and Quality (http://www.hpa.-standardmethods.org.uk/wg_virology.asp). Si ringraziano le numerose persone appartenenti a laboratori clinici di virologia ed alle organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento, ed il Redattore Medico per la revisione finale. I National Standards Methods sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale, London NW9 5EQ e-mail standards@hpa.org.uk Revisione no: 2 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 11 di 14

ALLEGATO: SEQUENZE DI PRIMER E PROBE Primer Forward: 5 GAG GAC AAC GAA ATC CTG TTG GGC A 3 Primer reverse (marcato internamente con LC640, attaccato alla basa T in corsivo minuscolo): 5 GTC GAC GGT GGA GAT ACT GCt GAG G 3 Probe (marcato con fluoresceina in 3 ): 5 GGA CTA CCT CTT CAA ACG CAT GAT TGA C 3 Revisione no: 2 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 12 di 14

BIBLIOGRAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December 1997. 2. Kearns AM, Draper B, Wipat W, Turner AJ, Wheeler J, Freeman R, et al. LightCycler-based quantitative PCR for detection of cytomegalovirus in blood, urine, and respiratory samples. J Clin Microbiol 2001;39:2364-5. 3. Kearns AM, Guiver M, James V, King J. Development and evaluation of a real-time quantitative PCR for the detection of human cytomegalovirus. J Virol Methods 2001;95:121-31. 4. Kearns AM, Turner AJ, Eltringham GJ, Freeman R. Rapid detection and quantification of CMV DNA in urine using LightCycler-based real-time PCR. J Clin Virol 2002;24:131-4. 5. Fryd DS, Peterson PK, Ferguson RM, Simmons RL, Balfour HH, Jr., Najarian JS. Cytomegalovirus as a risk factor in renal transplantation. Transplantation 1980;30:436-9. 6. Jacobson MA, Mills J. Serious cytomegalovirus disease in the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Clinical findings, diagnosis, and treatment. Ann Intern Med 1988;108:585-94. 7. Mustafa MM. Cytomegalovirus infection and disease in the immunocompromised host. Pediatr Infect Dis J 1994;13:249-57. 8. Gor D, Sabin C, Prentice HG, Vyas N, Man S, Griffiths PD, et al. Longitudinal fluctuations in cytomegalovirus load in bone marrow transplant patients: relationship between peak virus load, donor/recipient serostatus, acute GVHD and CMV disease. Bone Marrow Transplant 1998;21:597-605. 9. Guiver M, Fox AJ, Mutton K, Mogulkoc N, Egan J. Evaluation of CMV viral load using TaqMan CMV quantitative PCR and comparison with CMV antigenemia in heart and lung transplant recipients. Transplantation 2001;71:1609-15. 10. Griscelli F, Barrois M, Chauvin S, Lastere S, Bellet D, Bourhis JH. Quantification of human cytomegalovirus DNA in bone marrow transplant recipients by real-time PCR. J Clin Microbiol 2001;39:4362-9. 11. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. 2004 Approved List of Biological Agents. http://www.hse.gov.uk/pubns/misc208.pdf. p. 1-17. 12. Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety Precautions: Notes for Guidance. 4 th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); 1993. 13. Control of Substances Hazardous to Health Regulations 2002. General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; 2002. 14. Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; 2002. 15. Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; 2002. 16. Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2 nd ed. Suffolk: HSE Books; 2003. Revisione no: 2 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 13 di 14

17. NHS Estates. Health Building Note 15. Facilities for pathology services. 2nd ed. London: Her Majesty's Stationary Office (HMSO); 2005. 18. BS EN 12469: 2000. Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets. London: British Standards Institution (BSI); 2000. 19. BS 5726: 1992. Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation. London: British Standards Institution (BSI); 1992. 20. BS 5726: 1992. Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); 1992. 21. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; 2001. 22. Health Protection Agency. QSOP 38 - Good laboratory practice when performing molecular amplification assays. London: Health Protection Agency; 2003. 23. Health Protection Agency. VSOP 20 - Nucleic acid extraction by the Boom method. London: Health Protection Agency; 2005. 24. Health Protection Agency. QSOP 27 - Quality assurance in the diagnostic virology and serology laboratory. London: Health Protection Agency; 2003. 25. Curry A, Ashley CR. Quality assurance in electron microscopy. In: Snell JJS, Brown DFJ, Roberts C, editors. Quality Assurance Principles and Practice in the Microbiology Laboratory. London: Public Health Laboratory Service; 1999. p. 221-30. 26. Clinical Pathology Accreditation (UK) Ltd. Standards for the Medical Laboratory. Sheffield 2004. p. 1-56 27. PHLS, CDSC. Reporting to the PHLS Communicable Disease Surveillance Centre: a reference for laboratories. May. 2001. Revisione no: 2 Data di revisione 14.08.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 14 di 14