I INTRODUZIONE 1. Fisiologia del trasporto delle lipoproteine Le lipoproteine sono aggregati lipido-proteici, eterogenei per dimensioni e composizione ma simili per struttura che assicurano un efficace trasporto di lipidi insolubili, quali colesterolo e trigliceridi, nel flusso ematico (fig.1). Le lipoproteine a bassa densità (LDL), rappresentano la quota maggiore delle lipoproteine che trasportano colesterolo nel sangue umano e sono anche la causa di diverse affezioni coronariche. La diminuzione delle LDL nel sangue mediante terapia farmacologica riduce il rischio di infarto e prolunga la vita. Le LDL sono particelle contenenti un nucleo idrofobico costituito da esteri del colesterolo e un rivestimento polare costituito principalmente da fosfolipidi e da una proteina di 513 kd chiamata apolipoproteina B-100 (apob-100). 5
Fig.1: Tutte le lipoproteine hanno un versante esterno idrofilico costituito da colesterolo libero, fosfolipidi e apolipoproteine e un nucleo idrofobico in cui sono presenti trigliceridi ed esteri del colesterolo. Le LDL sono secrete dal fegato come precursori di più grandi dimensioni (55 nm) chiamate lipoproteine a densità molto bassa (VLDL) il cui nucleo contiene trigliceridi oltre che esteri del colesterolo. 6
Nei capillari del muscolo e del tessuto adiposo vengono rimossi i trigliceridi-vldl e le particelle subiscono poi reazioni di scambio con altre lipoproteine riducendo le dimensioni. Nel nucleo rimangono principalmente gli esteri del colesterolo e vengono rimosse tutte le proteine eccetto apob-100 producendo in tal modo le LDL. Le LDL circolano nel sangue umano con un tempo di vita medio di 2.5 giorni. Le particelle sono rimosse dal plasma quando apob-100 si lega al recettore dell LDL presente sulla superficie delle cellule epatiche. Dopo il legame al recettore la particella viene internalizzata mediante endocitosi, degradata nei lisosomi ed il colesterolo liberato entra a far parte del colesterolo cellulare (fig.2). Quando la concentrazione di colesterolo negli epatociti cresce, la trascrizione del gene dell LDLR è soppressa e le LDL sono trattenute nel sangue. Al contrario, quando i livelli di colesterolo epatico diminuiscono viene indotta la trascrizione del gene del recettore, LDL sono captate più rapidamente e la quantità di LDL nel plasma diminuisce. 7
Fig.2: Metabolismo dei lipidi. Le lipoproteine possono essere classificate per la loro mobilità elettroforetica o più comunemente per la loro diversa densità. Mediante tecniche di ultracentrifugazione è possibile separare le diverse classi lipoproteiche in relazione alla loro densità (crescente) cui corrisponde una diminuzione (decrescente) del diametro della particella e del rapporto 8
lipidi/ apolipoproteine: CHILIMICRONI: rappresentano i veicoli di trasporto dei grassi di origine alimentare e sono sintetizzati nell intestino; VLDL (very low-density lipoproteins): sono anch esse deputate al trasporto dei trigliceridi ma sono sintetizzate nel fegato; IDL (intermediate-density lipoproteins): derivano dalle VLDL; LDL (low-density lipoproteins): rappresentano il principale trasportatore plasmatico del colesterolo; HDL (high-density lipoproteins): la principale funzione è di favorire il trasporto del colesterolo dai tessuti periferici per indirizzarlo verso il catabolismo epatico. Sebbene le varie classi lipoproteiche svolgano ruoli fisiologici diversi nell insieme contribuiscono a: 1. trasportare i lipidi esogeni (alimentari) dall intestino al fegato; 2. distribuire i lipidi endogeni dal fegato a tutti gli organi attraverso il sistema vascolare; 9
3. riportare dalle cellule periferiche al fegato i lipidi non più necessari per una ulteriore ridistribuzione o per la definitiva eliminazione attraverso la via biliare. Le LDL sono rimosse dal torrente circolatorio con elevata efficienza e specificità per mezzo dell endocitosi mediata dal recettore delle LDL (LDLR), un recettore di membrana che ha un elevata affinità di legame per due specifici ligandi presenti sulla superficie di queste due classi lipoproteiche, apob e apoe rispettivamente. Una volta che le LDL si sono legate all LDLR, il complesso è internalizzato e dà luogo alla formazione di vescicole endocitotiche all interno delle quali le LDL, dopo essersi dissociate dal recettore, sono degradate in aminoacidi, colesterolo libero, acidi grassi e glicerolo. Una volta libero, il recettore si localizza di nuovo sulla superficie della cellula, cosicché un piccolo numero di recettori può internalizzare una grande quantità di LDL. Questo fenomeno è denominato riciclaggio e riutilizzazione del recettore LDLR. 10
La quota di colesterolo che penetra nella cellula è capace di determinare da un lato l inibizione dell attività della idrossimetil-glutaril-coenzimaa reduttasi (HMG-CoA reduttasi), l enzima chiave nella sintesi del colesterolo, e dall altro di stimolare l attività dell acil-colesteroloaciltransferasi (ACAT), l enzima che esterifica il colesterolo libero per poterlo conservare nei depositi cellulari. L effetto netto di questo meccanismo coordinato è che la quantità intracellulare del colesterolo, soprattutto di quello libero, rimane costante (1). 2. Endocitosi mediata da recettore Il colesterolo è trasportato nel torrente circolatorio in forma di particelle lipoproteiche le più comuni delle quali sono le LDL. L assunzione di tali particelle da parte delle cellule richiede il loro legame ad un recettore specifico concentrato in coated pits, regioni specializzate della membrana plasmatica rivestite da una specifica proteina strutturale chiamata clatrina. Il complesso LDL-LDLR viene poi internalizzato mediante endocitosi: il recettore viene riciclato mentre le LDL vengono trasportate ai lisosomi 11
dove il colesterolo è rilasciato per essere usato dalle cellule. Il meccanismo di captazione e internalizzazione delle LDL è stato dedotto conducendo studi su pazienti affetti da una malattia ereditaria nota come Ipercolesterolemia Familiare (FH). Le mutazioni che causano tale patologia sono di due tipi: mancato legame delle LDL al loro recettore oppure impossibilità di internalizzare il complesso LDL-LDLR. Dagli esperimenti condotti si notò che i recettori dei soggetti affetti da FH non si concentravano nelle fosse rivestite da clatrina, come avviene in pazienti sani, ma rimangono uniformemente distribuiti sulla superficie della cellula, prova diretta questa del ruolo centrale svolto dalle coated pits nell endocitosi mediata da recettore. Le mutazioni che impediscono al recettore di concentrarsi nelle coated pits, sono nella regione citoplasmatica della molecola LDLR. Una di queste mutazioni è la sostituzione di una tirosina con una cisteina sufficiente a rendere non funzionale il recettore. 12
Fig.3: Il recettore delle LDL comprende 700 aminoacidi extracellulari, un α-elica transmembrana di 22 aminoacidi e una coda citoplasmatica di 50 aminoacidi. I 292 aminoacidi N-terminali costituiscono il dominio di legame delle LDL. Sei aminoacidi nella coda citoplasmatica definiscono il segnale di internalizzazione. La mutazione di una Tyr in Cys in questa sequenza impedisce la concentrazione del recettore nelle coated pits (2). Il segnale di internalizzazione del recettore delle LDL è una sequenza di sei amminoacidi che comprende la tirosina essenziale. Questa sequenza si lega ad adattine che a loro volta legano la clatrina sul lato citoplasmatico della membrana. La clatrina assemblata in una struttura a canestro distorce la 13
membrana, formando fosse invaginate che si staccano grazie all azione della dinamina. Quest ultima proteina forma anelli attorno al collo delle fosse invaginate stringendo le vescicole e rilasciandole nella cellula. L endocitosi mediata da recettori è una delle principali attività della membrana plasmatica delle cellule eucariotiche. Sono stati indentificati più di 20 recettori che vengono internalizzati selettivamente tramite questa via. Le fosse rivestite occupano in genere 1-2% della superficie della membrana e hanno un emivita di 1-2 minuti. Le vescicole rivestite da clatrina dopo la loro internalizzazione si fondono con endosomi precoci, vescicole con estensioni tubolari poste alla periferia della cellula. Gli endosmi precoci servono da compartimento di smistamento da cui le molecole assunte per endocitosi sono riciclate alla membrana plasmatica o trasportate ai lisosomi per essere degradate. Una caratteristica importante degli endosomi precoci è il fatto che essi mantengono un ph acido (circa 6-6.2) dovuto all azione di una pompa di ioni idrogeno presente sulla loro membrana. Questo ph acido porta alla dissociazione dei ligandi dai loro recettori e le molecole così separate 14
possono essere trasportate a destinazioni intracellulari diverse. Un esempio classico è fornito dalle LDL il cui recettore viene riportato sulla membrana plasmatica tramite vescicole di trasporto che gemmano dalle estensioni tubulari degli endosomi. Le LDL vengono invece trasportate ai lisosomi per essere degradate e rilasciare colesterolo. L LDLR impiega dieci minuti per effettuare il giro completo della membrana plasmatica agli endosomi. I ligandi e le proteine di membrana destinate alla degradazione nei lisosomi sono trasportate dagli endosomi precoci agli endosomi tardivi che sono vicini al nucleo. Non a caso il trasporto dagli endosomi precoci a quelli tardivi è mediato dal movimento di grosse vescicole endocitiche di trasporto lungo i microtubuli. Gli endosomi tardivi sono più acidi degli endosomi precoci (ph circa 5.5-6.0) e sono in grado di fondersi con vescicole di trasporto che portano idrolasi lisosomiali dall apparato del Golgi. Gli endosomi tardivi maturano poi in lisosomi quando acquisiscono un intero complemento di enzimi lisosomiali e diventano ancora più acidi (ph circa 5.0). All interno dei lisosomi la degradazione è dovuta ad idrolasi acide (fig.4). 15