ADVANCE TM HRP Codice K4067 500 ml Codice K4068 110 ml Codice K4069 11 ml Prodotto pronto all'uso Uso previsto Per uso diagnostico In Vitro. Questo sistema è destinato all'uso con anticorpi primari di topo o coniglio forniti dall'utente. Consente di effettuare l'identificazione qualitativa di antigeni mediante microscopia ottica su tessuti normali e patologici fissati in formalina e inclusi in paraffina. Di seguito viene fornito un elenco dei prodotti reperibili presso Dako che assicurano un uso ottimale del sistema ADVANCE TM HRP. Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining" ( Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica ) per quanto riguarda: (1) Principio della procedura, (2) Materiali necessari ma non forniti, (3) Conservazione, (4) Preparazione dei campioni, (5) Procedura per la colorazione, (6) Controllo della qualità, (7) Risoluzione dei problemi, (8) Interpretazione della colorazione, (9) Limiti generali. Cenni introduttivi Principio della procedura Reagenti forniti Materiali necessari ma non forniti Il sistema di rivelazione ADVANCE HRP si basa su una tecnica di colorazione IHC estremamente sensibile, particolarmente utile per l'identificazione di antigeni che sono presenti con concentrazioni basse. Il sistema non utilizza biotina, pertanto assicura la totale assenza o sostanziale riduzione della colorazione aspecifica che è causata dall'attività avidina-biotina endogena nel fegato, nei reni, nei tessuti linfoidi e nelle sezioni criostatate. Tutti i reagenti del kit ADVANCE HRP sono pronti all'uso. Dal momento che si tratta di un metodo estremamente sensibile, le diluizioni ottimali dell'anticorpo primario possono essere notevolmente più alte rispetto ai tradizionali metodi EnVision, ABC o LSAB. 1-5 È possibile arrestare qualsiasi attività di perossidasi endogena mettendo il campione in incubazione con un reagente idoneo a bloccare la perossidasi endogena. Successivamente il campione deve essere incubato con un anticorpo primario di topo o di coniglio opportunamente diluito e caratterizzato e quindi sottoposto ad una sequenza di incubazioni della durata di 30 minuti l'una, con ADVANCE HRP Link e ADVANCE HRP Enzyme. La colorazione viene completata con un'incubazione di 5-30 minuti con un substrato-cromogeno adatto. ADVANCE TM HRP Link Un reagente che contiene anticorpi secondari anti-topo e anti-coniglio in un tampone Tris-HCl con proteina stabilizzante e un agente antibatterico. ADVANCE TM HRP Enzyme Un reagente che contiene anticorpi polimerizzati con perossidasi di rafano in un tampone Tris-HCl con proteina stabilizzante e un agente antibatterico. I reagenti del kit ADVANCE HRP sono perfettamente idonei allo svolgimento delle procedure immunoistochimiche. I reagenti forniti sono pronti all'uso. L'ulteriore diluizione dei reagenti o una variazione dei tempi o delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei. Panni assorbenti Tessuto di controllo positivo e negativo Colorante di contrasto: acquoso, ad esempio Automation Hematoxylin (codice S3301), Hematoxylin for IHC (codice S3302) e Mayer s Hematoxylin oppure Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (codice S3309) Vetrini coprioggetto Acqua distillata Etanolo, assoluto e al 95% Microscopio ottico (20x 800x) Mezzi di montaggio come Glycergel Mounting Medium (codice C0563) o Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (codice S3025) oppure un mezzo di montaggio non acquoso come Ultramount (codice S1964) Anticorpi primari e reagente di controllo negativo Vetrini, polilisinati oppure silanizzati del tipo Silanized Slides (codice S3003) Vaschette o bagni per la colorazione Contaminuti (per intervalli di 3-40 minuti) Spruzzette Soluzione tampone di lavaggio Xilene, toluene o derivati dello xilene Materiali opzionali ma non forniti Idrossido di ammonio, 15 mol/l, diluito a 0,037 mol/l PAP Pen (codice S2002) (118767-002) 306008IT_002 p. 1/5
Prodotti Dako consigliati Codice Dako Nome del prodotto Tipo di prodotto S3800 Autostainer Plus Strumento S2001 S2003 Blocco della perossidasi Dual Endogenous Enzyme Block Blocco della perossidasi Blocco della perossidasi endogena S3006 K3461/K3469 K3461/K3469 S3301 S3302 S3309 Wash Buffer 10x For Automated and Manual IHC Use. AEC+ Ready-to-use Liquid DAB+ Automation Hematoxylin Hematoxylin for IHC Mayer s Hematoxylin o Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin Tampone di lavaggio Sistema substrato Colorante di contrasto Precauzioni Conservazione 1. Per uso professionale. 2. Non utilizzare i reagenti oltre la data di scadenza indicata per il metodo di conservazione previsto. Se i reagenti sono conservati in condizioni difformi da quelle specificate nel foglietto illustrativo del prodotto, l eventuale uso dovrà essere convalidato dall utente. 3. Non sostituire con reagenti appartenenti ad altri numeri di lotto o a kit di altri produttori. 4. Gli enzimi e i substrati cromogeni possono subire alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Evitare di conservare i componenti del kit e di eseguire la colorazione in condizioni di luce intensa, ad esempio sotto la luce diretta del sole. 5. Tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati potrebbero produrre risultati erronei. Le eventuali modifiche dovranno essere convalidate dall utente. 6. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica. 7. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, così da evitare il contatto con gli occhi e la pelle. 8. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia. Conservare a 2 8 C. Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l instabilità di questi prodotti. Pertanto è opportuno analizzare un controllo positivo e un controllo negativo contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione imprevista, che non sia giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un probabile problema del kit, contattare l Assistenza Tecnica Dako. Preparazione dei reagenti Per ragioni di praticità, prima di procedere alla colorazione è opportuno preparare i reagenti elencati di seguito. Soluzione tampone di lavaggio TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (codice S3006): tampone di lavaggio consigliato per le procedure di rivelazione IHC manuali e automatizzate. TBS, 0,05 mol/l Tris buffered Saline (codice S1968) e PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (codice S3024): anche queste soluzioni sono tamponi di lavaggio adatti per la colorazione manuale. Si sconsiglia l'uso di soluzioni contenenti sodio azide come tamponi di lavaggio. La sodio azide inattiverebbe la perossidasi (HRP) provocando una colorazione negativa. Conservare la soluzione inutilizzata a 2 8 C. Eliminare la so luzione tampone se appare torbida. È possibile utilizzare acqua distillata per sciacquare il blocco perossidasi, il substrato e il colorante di contrasto. Anticorpo primario L'ottimizzazione degli anticorpi concentrati è prerogativa dell'utente finale. Preparare le diluizioni con il prodotto Antibody Diluent (codice S0809) o con un altro diluente contenente tampone Tris-HCI 0,05 mol/l con albumina di siero bovino (BSA) all'1%. Per la maggior parte degli anticorpi primari impiegati con questo kit è sufficiente un tempo di incubazione di 30 minuti. Reagente di controllo negativo Un reagente di controllo negativo ideale dovrebbe contenere un anticorpo che non manifesti una reattività specifica con i tessuti umani o il siero normale/non immune nella stessa matrice/soluzione dell'anticorpo primario diluito. Il reagente di controllo negativo dovrebbe appartenere alla stessa sottoclasse e specie animale a cui appartiene l'anticorpo primario e dovrebbe essere diluito alla stessa concentrazione di immunoglobuline o proteine che è propria dell'anticorpo primario, naturalmente con lo stesso diluente. Il periodo di incubazione del reagente di controllo negativo deve corrispondere a quello dell anticorpo primario. (118767-002) 306008IT_002 p. 2/5
Colorante di contrasto Il cromogeno DAB genera un prodotto finale insolubile in alcol e può essere utilizzato con ematossilina a base di alcol. Quando si utilizza il substrato cromogeno AEC, il prodotto finale della reazione è invece solubile in alcol e pertanto deve essere abbinato solo a coloranti di contrasto a base di acqua, quali ad esempio Automation Hematoxylin (codice S3301), Hematoxylin for IHC (codice S3302), Mayer s Hematoxylin o Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (codice S3309). Dopo la colorazione di contrasto con ematossilina, effettuare un risciacquo accurato in acqua distillata e immergere i vetrini contenenti il tessuto in un bagno di ammoniaca 0,037 mol/l o in un agente con analoghe proprietà di colorazione blu. La soluzione ammoniacale 0,037 mol/l viene preparata miscelando 2,5 ml di idrossido di ammonio 15 mol/l (concentrato) in 1 litro di acqua. La soluzione ammoniacale 0,037 mol/l inutilizzata può essere conservata in un flacone perfettamente sigillato a temperatura ambiente (20-25 C) per 12 mesi. Consultare le istruzioni fornite dai produttori per eventuali colorazioni di contrasto alternative. Mezzi di montaggio Il mezzo di montaggio acquoso consigliato è Glycergel Mounting Medium (codice C0563) o Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (codice S3025). Il prodotto Glycergel deve essere riscaldato almeno a 50 C prima dell'uso. È possibile utilizzare anch e il mezzo di montaggio permanente non acquoso Ultramount (codice S1964). Preparazione dei campioni Caratteristiche prestazionali Procedura per la colorazione Per l'uso con sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina, oltre che con sezioni di tessuto congelate e strisci cellulari. Prima che la colorazione IHC abbia luogo, i tessuti devono essere fissati e trattati. La fissazione impedisce l autolisi e la putrefazione dei tessuti asportati, preserva l antigenicità, migliora l indice di rifrazione dei costituenti del tessuto e aumenta la resistenza degli elementi cellulari al trattamento del tessuto. Il tessuto viene sottoposto a disidratazione, diafanizzazione degli agenti disidratanti, infiltrazione di mezzi inclusivi, inclusione e infine sezionamento. I fissatori più comuni per i preparati di tessuto destinati alle procedure IHC sono descritti nelle General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica ). Queste informazioni sono fornite esclusivamente come linee guida. Le procedure ottimali dovranno essere definite e verificate dall utente. Gli anticorpi contenuti in questo kit sono stati assorbiti in fase solida per consentire la rimozione di anticorpi con reattività crociata alle immunoglobuline umane (Ig), tuttavia è possibile che vi sia reattività crociata alle Ig appartenenti ad altre specie. Le Ig anti-topo e anti-coniglio sono state purificate per affinità su una colonna con Ig di topo e Ig di coniglio rispettivamente. L'attività combinata è diretta ai due anticorpi primari di topo e di coniglio e comprende il legame alle due IgG, a tutte le sottoclassi di IgG e all'igm. L'HRP (perossidasi di rafano) presente sul polimero è stata preparata a partire da HRP con attività altamente specifica. Le molecole non coniugate sono state rimosse tramite cromatografia di gel-filtrazione. Note sulla procedura Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente le istruzioni fornite di seguito e studiare il contenuto del prodotto. I reagenti inclusi nel kit e le istruzioni fornite dovrebbero assicurare una prestazione ottimale. L'ulteriore diluizione dei reagenti o una variazione dei tempi o delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei. Tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20-25 C) prima dell immunocolorazi one. Analogamente, tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante la procedura di colorazione, altrimenti si potrebbe assistere ad un aumento del fenomeno di colorazione aspecifica. Coprire i vetrini per proteggerli dalle correnti d'aria. Se le incubazioni devono protrarsi nel tempo, collocare i tessuti in un ambiente umido. Procedura automatizzata Programmare il sistema Dako Autostainer / Autostainer Plus nel modo seguente: FASE 1: Selezionare il programma automatico per il modello di protocollo (Protocol Template Auto Program). FASE 2: Sistemare i reagenti sul rack reagenti dello strumento e riempire le damigiane con il tampone di lavaggio e l'acqua distillata. FASE 3: Caricare i vetrini sullo strumento. FASE 4: Avviare il ciclo. FASE 5: Rimuovere i vetrini dallo strumento. Procedura manuale (Per ogni fase della procedura, fare riferimento ai prodotti Dako compatibili descritti sopra.) FASE 1: BLOCCO DEGLI ENZIMI ENDOGENI Picchiettare per eliminare il tampone in eccesso. Utilizzando carta bibula, asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere il liquido rimanente e mantenere il reagente entro l'area prescritta. Applicare una quantità di Dual Endogenous Enzyme Block o di Peroxidase Block sufficiente per ricoprire il campione. Incubare per 5-10 minuti nel caso di Dual Endogenous Enzyme Block o Peroxidase Block, a seconda della concentrazione dell'enzima endogeno nel tessuto da analizzare. Sciacquare delicatamente con acqua distillata o soluzione tampone da una spruzzetta (fare attenzione a non indirizzare il flusso direttamente sul tessuto) e collocare in un bagno tampone fresco. (118767-002) 306008IT_002 p. 3/5
FASE 2: ANTICORPO PRIMARIO O REAGENTE DI CONTROLLO NEGATIVO precedentemente. Applicare una quantità di anticorpo primario diluito in modo ottimale oppure di reagente di controllo negativo sufficiente per ricoprire il campione. Incubare per 30* (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con soluzione tampone da una spruzzetta (fare attenzione a non indirizzare il flusso direttamente sul tessuto) e collocare in un bagno tampone fresco per 5 minuti. FASE 3: ADVANCE TM HRP Link precedentemente. Applicare una quantità di ADVANCE TM HRP Link sufficiente per ricoprire il campione. Incubare per 30* (±1) minuti. Sciacquare secondo la modalità descritta al punto 2. FASE 4: ADVANCE TM HRP Enzyme precedentemente. Applicare una quantità di ADVANCE TM HRP Enzyme sufficiente per ricoprire il campione. Incubare per 30* (±1) minuti. Sciacquare secondo la modalità descritta al punto 2. FASE 5: SUBSTRATO CROMOGENO precedentemente. Applicare una quantità di soluzione substrato cromogeno sufficiente per ricoprire il campione. Incubare per 5-30 minuti (AEC+) o per 5-10 minuti (DAB+). Sciacquare delicatamente i vetrini con acqua distillata. Raccogliere il substrato cromogeno di scarto in un contenitore per materiali pericolosi e smaltire in modo appropriato. Collocare i vetrini appena sciacquati in un nuovo bagno di acqua distillata. FASE 6: COLORAZIONE DI CONTRASTO CON EMATOSSILINA (facoltativa) Immergere i vetrini in un bagno di ematossilina. La durata dell'incubazione varia a seconda della potenza dell'ematossilina usata. Sciacquare i vetrini in un bagno di acqua distillata o deionizzata per 2-5 minuti. * Per aumentare la produttività, si consiglia di ridurre i tempi di incubazione con la diluizione alternativa dell'anticorpo primario. Il tempo di incubazione consigliato per il massimo grado di sensibilità è di 30 minuti. Controllo della qualità Le differenze che esistono tra i laboratori (per quanto riguarda il modo di trattare il tessuto o di eseguire le procedure tecniche) possono determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono necessari controlli interni periodici oltre alle procedure descritte di seguito. Per ulteriori informazioni, consultare le linee guida sul controllo della qualità stabilite nel College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry e i riferimenti bibliografici dal 6 all'8. Per informazioni dettagliate sulla sensibilità e l'immunoreattività dei singoli anticorpi primari, fare riferimento ai rispettivi foglietti illustrativi. Per ulteriori informazioni sui controlli positivi e negativi, fare riferimento alle General Instructions for Interpretazione dei risultati Limiti generali Per conoscere le linee guida sull'interpretazione dei risultati, fare riferimento alle General Instructions for Per conoscere i limiti generali della procedura, fare riferimento alle General Instructions for L'uso di fissativi scaduti o non tamponati e l'esposizione dei tessuti ad un calore eccessivo (superiore a 60 C) durante il trattamento potrebbero provocare una ridotta sensibilità alla colorazione. L'attività di perossidasi endogena o pseudoperossidasi è osservabile nelle emoproteine quali l'emoglobina, la mioglobina, il citocromo e la catalasi, oltre che negli eosinofili. 9,10 Questa attività può essere inibita incubando i campioni con il reagente Peroxidase Block per 5 minuti o con il reagente Dual Endogenous Enzyme Block per 5-10 minuti, prima dell'applicazione dell'anticorpo primario. Anche gli strisci di midollo osseo e sangue e i tessuti congelati possono essere trattati con questo reagente. Questa procedura non elimina comunque il pigmento rossiccio-marrone delle emoproteine. In alternativa è possibile utilizzare una soluzione di metanolo e perossido di idrogeno. Alcuni antigeni possono denaturarsi per effetto di questo trattamento. I tessuti delle persone infette dal virus dell epatite B e contenenti l antigene di superficie dell epatite B (HBsAg) possono essere interessati da una colorazione aspecifica con la perossidasi di rafano. 11 Il siero normale/non immune proveniente dalla stessa fonte animale dell'antisiero secondario impiegato nelle fasi di bloccaggio potrebbe generare risultati falsi-negativi o falsi-positivi per effetto degli auto-anticorpi o degli anticorpi naturali. I reagenti forniti nel kit sono stati diluiti in proporzioni ottimali. Un'ulteriore diluizione potrebbe ridurre la capacità di rivelazione dell'antigene. (118767-002) 306008IT_002 p. 4/5
Risoluzione dei problemi Osservazione Segnale troppo forte Fondo sui bordi Fondo sui test positivi Fondo sui test negativi Colorazione aspecifica Segnale assente Durata del saggio eccessiva Commento Il sistema di rivelazione ADVANCE HRP è molto sensibile e prevede un'elevata diluizione degli anticorpi primari. Se gli anticorpi non sono sufficientemente diluiti, il segnale è troppo forte. Effettuare una diluizione in serie dell'anticorpo primario e scegliere un rapporto di diluizione che rientri nella gamma di valori prima del punto zero. Il tessuto si è asciugato. Per la colorazione manuale: collocare i vetrini nella camera umidificata. Diluire ulteriormente l'anticorpo primario (vedere sopra Segnale troppo forte ). La concentrazione del reagente di controllo negativo deve corrispondere alla concentrazione dell'anticorpo primario titolato in modo ottimale. Se non corrisponde, diluire ulteriormente il controllo negativo. Il lavaggio è essenziale. Se non è sufficiente un lavaggio accurato seguito da 5 minuti di incubazione, procedere a due lavaggi con immersioni complete di 5 minuti ciascuna. Per la buona riuscita della reazione, è fondamentale che i reagenti ADVANCE TM HRP Link e ADVANCE TM HRP Enzyme vengano utilizzati in sequenza. L'anticorpo primario era troppo diluito. Effettuare una diluizione in serie dell'anticorpo per definire il rapporto di diluizione corretto. Il sistema ADVANCE HRP prevede una procedura caratterizzata da un'elevata sensibilità, da tempi di incubazione più brevi, o da una combinazione di entrambi questi fattori. Se si desidera abbreviare la durata complessiva del saggio, è necessario utilizzare un anticorpo primario più concentrato. Bibliografia 1. Guesdon JL, et al. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27:1131 2. Warnke R and Levy R. Detection of T and B cell antigens with hybridoma monoclonal antibodies. A biotin-avidin-horseradish peroxidase method. J Histochem Cytochem 1980; 28:771 3. Petrusz P and Ordronneau P. Immunohistochemistry of pituitary hormones. Polak MT and van Noorden S, eds. Immunocytochemistry: Practical applications in pathology and biology. Bristol-Wright-PSG 1983; 212 4. Nagle RB, et al. Immunohistochemical demonstration of keratins in human ovarian neoplasms. A comparison of methods. J Histochem Cytochem 1983; 31:1010 5. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984; 2:161 6. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilber DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 7. National Committee for Clinical Laboratory Standard. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 8. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 9. Escribo LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 10. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1990; 46 11. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 Edition 06/10 (118767-002) 306008IT_002 p. 5/5