Le applicazioni pratiche delle scoperte in biologia molecolare Luca Mazzucchelli Istituto cantonale di patologia Locarno

Le applicazioni pratiche delle scoperte in biologia molecolare Luca Mazzucchelli Istituto cantonale di patologia Locarno Oncologia Lago Maggiore Locarno 25 settembre 2008

Farmaco Target Indicazione Rituximab CD20 Linfoma a cellule B Alemtuzumab CD52 CLL, Linfoma a cellule T Trastuzumab Her2 Carcinoma della mammella Cetuximab EGFR Carcinoma del colon, della testa-collo Panitumumab EGFR Carcinoma del colon Bevacizumab VEGF Adenocarcinoma colon Sorafenib BRAF Carcinoma del rene, epatocarcinoma Imatinib c-kit GIST, CML Erlotinib EGFR Adenocarcinoma polmone Gefitinib EGFR Adenocarcinoma polmone Lapatinib EGFR-Her2 Carcinoma della mammella

Ciardiello and Tortora, N Engl J Med 2008

Cellula normale Etero-/Omo-dimeri PTEN PI3K P P K-Ras BRAF Akt MEK mtor ERK 1,2 Cell survival Cell proliferation

Cellula neoplastica PI3K PTEN Akt mtor Cell survival P P K-Ras BRAF MEK ERK 1,2 Cell proliferation Alterazioni del recettore Sovraespressione proteica (amplificazione genica) Mutazioni Alterazioni di proteine di trasduzione Mutazioni Perdita

Cellula neoplastica Sovraespressione Mutazione Etero- oppure omo-dimerizzazione senza ligando Attivazione dominio TK senza ligando e senza etero/omodimerizzazione Attivazione della cascata di segnali Proliferazione cellulare

Meccanismo Tumore Sovraespressione/amplificazione HER2 Sovraespressione /amplificazione EGFR Mutazione EGFR Mutazioni KRAS Mutazione BRAF Mammella Polmone, Colon Testa-collo Polmone Colon, Pancreas, Polmone Tiroide, Colon, Melanoma

Target therapy Anticorpi monoclonali diretti contro la parte extracellulare del recettore Inibitori del dominio tirosinchinasico del recettore situato nella componente citosolica del recettore Inibitori di proteine di trasduzione Ciardiello and Tortora, N Engl J Med 2008

Meccanismi di azione degli anticorpi monoclonali Ciardiello and Tortora, N Engl J Med 2008

Meccanismo di azione dei TKIs Esoni 18-21 EGFR ATP TKI Stimolazione cellulare La presenza di mutazione induce alta affinità di legame con piccole molecole capaci di sostituirsi ad ATP in maniera non permanente Il dominio TK viene bloccato La cascata di segnali a valle viene interrotta

MoAb TKI Somministrazione i.v. p.os. Struttura IgG molecole basso PM Selettività target alta media Meccanismo blocca ligando blocca dominio TK Internalizzazione si no Attivazione sistema si immunitario Mutazione proteina (si) no si Sovraespressione si (si)

Inibitori TK (EGFR) sono efficaci in circa il 5% dei carcinomi polmonari Trastuzumab (anti-her2) è efficace solo in 10-15% dei carcinomi della mammella Cetuximab (anti-egfr) è efficace solo nel 20% dei carcinomi del colon Perchè? Come predire la risposta terapeutica?

TKIs Asiatici Donne Aspetti Clinici Non-fumatori/trici Adenocarcinoma Dermatite acneiforme Aspetti molecolari Mutazione EGFR negli esoni 18-21 (5-15% dei pazienti caucasici, 25-35% dei pazienti asiatici

Sequenziamento DNA Estrazione DNA da tessuto fissato in formalina ed incluso in paraffina (mutazioni somatiche) Amplificazione degli esoni critici tramite PCR Sequenziamento ed analisi

Her-2 Test nella mammella Immunoistochimica FISH

Linee guida

EGFR immunoistochimica Fattori preanalitici Anticorpo primario Metodo Dimensioni del prelievo Valutazione Scoring

EGFR gene amplification

chrm. 7 aneusomy & EGFR gene amplification

Linee guida FISH SCORING SYSTEM classification Colorado & Working Group NSCLC Locarno revised mcrc FISH status Monosomy - 1 copy in 50% of cells negative Disomy 2 copies in 90% of cells 2 copies in > 60% of cells negative Low trisomy High trisomy Low polysomy High polysomy Gene amplification 2 copies in 40% of cells, 3 copies in 10-40% of cells, 4 copies in < 10% of cells 2 copies in 40% of cells, 3 copies in 40% of cells, 4 copies in < 10% of cells 4 copies in 10-40% of cells - negative - negative 3 or 4 copies in > 40% of cells 4 copies in 40% of cells > 4 copies in > 40% of cells positive Tight EGFR gene clusters and R 2 or 15 copies of EGFR per cell in 10 of analyzed cells Tight EGFR gene clusters and R 2 or 15 copies of EGFR per cell in 10 of analyzed cells positive

EGFR FISH vs risposta clinica DISOMIA MARCATA POLISOMIA AMPLIFICAZIONE EGFR FISH 3/27 (11%) 16/27 (59%) 8/27 (30%) RISPONDONO 0 4 6 NON RISPONDONO 3 12 2

EGFR & downstream signals EGFR outside cytoplasm mutated in ~30-40% sporadic CRC PI3K K-Ras PTEN Akt mtor BRAF MEK ERK1,2 mutated in ~5-10% sporadic CRC cell survival angiogenesis change in gene expression metastatisation nucleus tumor invasion cell proliferation

Patients, treatment regimens and clinical response No. % No. of patients with mcrc* 113 100 Site of primary disease Colon cancer 70 62 Rectal cancer 43 38 Anti-EGFR MoAb ** Cetuximab 36 32 Cetuximab + Chemotherapy 51 45 Panitumumab 26 23 Prior adjuvant chemotherapy # Yes 100 88 Prior lines of chemotherapy 1 12 11 2 53 47 3 29 26 4 5 4 5 1 1 EGFR IHC expression ( 1% cells) Yes 113 100 Clinical response (RECIST) Responders 24 21 Non-responders 89 79 * 45 patients were treated at Oncology Institute of Southern Switzerland (Bellinzona, Switzerland) and 68 were treated at Ospedale Cà Granda (Milan, Italy) ** 64 patients were enrolled in clinical trials # 13 patients received cetuximab as frontline therapy.

K-Ras status and clinical response Wild-type Mutant K-Ras 79/113 (70%) 34/113 (30%) * Responders 22/79 (28%) 2/34 (6%) Non-responders 57/79 (72%) 32/34 (94%) p<0.05, two-tailed Fisher s exact test?!? KRAS mutations correlate with resistance to to anti-egfr MoAbs

BRAF status and clinical response on wild-type K-Ras patients Wild-type Mutant BRAF 68/79 (86%) 11/79 (14%) * Responders 22/68 (32%) 0/11 (0%) Non-responders 46/68 (68%) 11/11 (100%) p<0.05, two-tailed Fisher s exact test BRAF mutations are are associated with lack of of response to to MoAbs treatment in in KRAS wild-type tumors

113 pazienti con carcinoma colorettale metastatico trattati con Cetuximab o Panitumumab 79 pazienti mutazione KRAS 34/113 (30%) mutazione BRAF 11/79 (14%) 48% dei pazienti non rispondenti 68 pazienti 22/68 (32%) rispondono 46/68 (68%) non rispondono

K-Ras e cetuximab in mcrc: meta-analisi Lavoro Pazienti rispondenti Pazienti resistenti % di mutazione di K-Ras Moroni et al. Lancet Oncology 2005 Lièvre et al. Clin Cancer Res 2006 Di Fiore et al. Br J Cancer 2007 Frattini et al. Br J Cancer 2007 Benvenuti et al. Cancer Res 2007 De Roock et al. Ann Oncol 2008 Casi 10 21 K-Ras mutati 2 8 K-Ras wt 8 13 Casi 11 19 K-Ras mutati 0 13 K-Ras wt 11 6 Casi 12 47 K-Ras mutati 0 16 K-Ras wt 12 31 Casi 10 17 K-Ras mutati 1 9 K-Ras wt 9 8 Casi 11 37 K-Ras mutati 1 15 K-Ras wt 10 22 Casi 8 29 K-Ras mutati 0 15 K-Ras wt 8 14 62 casi che rispondono, 4 hanno la mutazione di K-Ras (6.4%) 76 casi con la mutazione di K-Ras, 4 rispondono (5.2%) 32% 43% 27% 37% 33% 41%

Cellular models of CRC and response to anti-egfr MoAbs BRAF V600E mut The presence of of BRAF V600E allele in in CRC cells impairs their response to to cetuximab or or panitumumab

113 pazienti con carcinoma colorettale metastatico trattati con Cetuximab o Panitumumab 79 pazienti mutazione KRAS 34/113 (30%) mutazione BRAF 11/79 (14%) 48% dei pazienti non rispondenti 68 pazienti 22/68 (32%) rispondono 46/68 (68%) non rispondono

EGFR & downstream signals EGFR out cytoplasm mutated in ~20-30% of sporadic CRC mutated in ~40% of sporadic CRC PI3K K-Ras loss in ~30% of sporadic CRC PTEN Akt BRAF MEK mutated in ~5-10% of sporadic CRC mtor ERK1,2 cell survival angiogenesis changes in gene expression nucleus cell proliferation tumor invasion tumor metastasization

PIK3CA status and clinical response Wild-type Mutant PIK3CA 95/110 (86%) 15/110 (14%) * Responders 22/95 (23%) 0/15 (0%) Non-responders 73/95 (77%) 15/15 (100%) p<0.001, two-tailed Fisher s exact test PIK3CA mutations are are associated with lack of of response to to MoAbs treatment in in KRAS wild-type tumors

PTEN PTEN pos 16/27 (62%) PTEN neg 11/27 (38%) PTEN pos PTEN neg PR 10 0 NR (PD+SD) 6 11 p<0.001 Absence of PTEN expression confers cetuximab resistance

Quale algoritmo?

mcrc EGFR by FISH on primary tumor disomy chromosome 7 marked polysomy EGFR gene amplification no cetuximab cetuximab PTEN + K-Ras wt PTEN + K-Ras mut PTEN - K-Ras mut PTEN - K-Ras wt response resistance

mcrc KRAS status on primary tumor mutated Wild-type no treatment BRAF mutated PIK3CA mutated PTEN loss EGFR disomy BRAF PIK3CA PTEN EGFR response BRAF wt PI3K wt EGFR CNG PTEN +

Conclusioni Le terapie mirate sono efficaci solo in una sottopopolazione di pazienti L analisi delle molecole bersaglio sulle cellule neoplastiche e del sistema di trasduzione del segnale a valle puó essere utile per predire l efficacia di nuovi trattamenti Per meglio valutare l impatto di queste analisi predittive sono indispensabili studi clinici prospettici Una gestione interdisciplinare del paziente è indispensabile

Controlli di qualità HER2 house internal controls HER2 IHC UK NEQAS HER2 FISH UK NEQAS EGFR FISH reproducibility studies KRAS German Ring Test CH?

Costi I costi di analisi di biologia molecolare in patologia sono relativamente elevati (circa 600 CHF per analisi) Attualmente tutte le analisi sono state rimborsate dalle assicurazioni (Her2 FISH) La disponibilità al rimborso potrebbe scemare a fronte di un impennata dei costi Il timore di indurre dei costi potrebbe frenare la richiesta di queste analisi da parte del medico I pazienti beneficiano di queste analisi (evitare terapie inutili) I risparmi procurati da una selezione accurata dei pazienti che possono beneficiare di trattamenti mirati superano nettamente i costi di terapie inutili.

Milo Frattini Vittoria Martin Francesca Molinari Morena Ghisletta Antonella Camponovo Sara Banfi Lara Lunghi Piercarlo Saletti Sara De Dosso Andrea Bordoni Alessandra Spitale Paola Mazzola Alberto Bardelli Federica Di Nicolantonio Miriam Martini Andrea Sartore-Bianchi Mauro Moroni Salvatore Siena