Gennaio - Giugno 2005

Gennaio - Giugno 2005 VALUTAZIONE DELL ATTIVITÀ ANTIPROLIFERATIVA E CITOTOSSICA DI UN FARMACO ANTITUMORALE Fabrizia Vanzetta, 3LM Scuola Superiore Medico Tecnica Lavoro svolto presso il Laboratorio di Oncologia Sperimentale Istituto Oncologico della Svizzera Italiana (IOSI), Bellinzona Responsabile Dr. Carlo V. Catapano

INDICE RIASSUNTO...4 INTRODUZIONE...5 SR271425... 5 Colture cellulari... 5 Tests utilizzati... 7 MTT...7 Test clonogenico...7 Ciclo cellulare...7 MATERIALI E METODI...9 Colture cellulari... 9 Come manipolare le cellule: sterilità...9 Ambiente di lavoro...9 Attrezzatura e soluzioni...9 Manipolazione...9 Espansione della coltura...10 Messa in coltura...10 SR271425... 10 MTT... 10 Test clonogenico... 11 Ciclo cellulare... 11 RISULTATI...13 MTT... 13 Linee polmonari...13 Linee ovariche...14 Test clonogenico... 15 Ciclo cellulare... 16 COMMENTI AI RISULTATI - DISCUSSIONE...18 MTT... 18 Test clonogenico... 18 Ciclo cellulare... 18 CONCLUSIONE...19 BIBLIOGRAFIA...20 RINGRAZIAMENTI...21 ALLEGATI...22 Allegato 1... 22 Terreni di coltura...22 2

Sistemi tampone...22 Allegato 2... 23 Tabella delle IC 50...23 3

RIASSUNTO Lo scopo di questo lavoro di diploma è stato valutare l attività di un potenziale farmaco antitumorale su linee cellulari di tumore ovarico e polmonare. Molti composti di questo genere, capaci di legarsi al DNA e quindi d interferire con la trascrizione di geni, sono tuttora in fase di sperimentazione come farmaci antitumorali nel laboratorio di Oncologia Sperimentale dell Istituto Oncologico della Svizzera Italiana, Bellinzona. Oggetto del presente studio è il composto SR271425, un derivato del tioxantone. Studi preclinici compiuti sia in vivo che in vitro hanno dimostrato l elevata attività di questo farmaco su diversi modelli tumorali murini ed umani. L ipotesi di lavoro è che SR271425, legandosi al DNA, possa interferire selettivamente con la trascrizione di geni critici per la proliferazione e la sopravvivenza di cellule tumorali. Per questo motivo è stata testata la citotossicità del farmaco su un pannello di linee di tumori ovarico e polmonare utilizzando un test colorimetrico (MTT assay) ed un test clonogenico. In un secondo tempo sono state analizzate alterazioni del ciclo cellulare utilizzando metodiche citofluorimetriche. In futuro, si valuteranno gli effetti del farmaco sulla trascrizione di geni espressi ad alti livelli in cellule di tumore ovarico e polmonare. The aim of this diploma work has been to evaluate the activity of a potential anticancer drug on ovarian and lung cancer cell lines. Many compounds that are able to bind DNA, and therefore to interfere with gene transcription, are currently in experimental phase as anticancer drugs in the laboratory of Experimental Oncology, Oncology Institute of the Southern Switzerland, Bellinzona. The object of this study is the compound SR271425, a derivate of thioxantone. Preclinical studies done both in vivo and in vitro have demonstrated the high level of activity of this drug on many models of murine and human tumors. The working hypothesis is that SR271425, in binding DNA, interferes selectively with the transcription of genes critical in the proliferation and survival of tumor cells. Therefore at the beginning the cytotoxicity of the drug on ovarian and lung tumor cell lines was tested using a colorimetric assay (MTT assay) and a clonogenic assay. After that alterations of the cell cycle were assessed with cytofluorimetric methods. Future studies will assess the effects of the drug on transcription of genes overexpressed in ovarian and lung cancer cells. 4

INTRODUZIONE L obiettivo di questo lavoro è valutare l attività antiproliferativa e citotossica del composto SR271425, e studiarne i meccanismi d azione. Partendo dall ipotesi che il farmaco, legandosi al DNA, possa interferire selettivamente con la trascrizione di geni critici per la proliferazione e sopravvivenza di cellule tumorali, si è proceduto nel seguente modo: sono stati valutati gli effetti su crescita e sopravvivenza di linee cellulari derivate da tumori dell ovaio e del polmone dapprima usando un test colorimetrico (MTT assay) e successivamente un test clonogenico. In seguito sono state studiate le alterazioni del ciclo cellulare e l eventuale presenza di apoptosi usando metodiche citofluorimetriche. SR271425 L SR271425 è un derivato del tioxantone (1), composto ad attività antitumorale attualmente in fase di sperimentazione clinica. Studi preclinici, compiuti sia in vitro che in vivo su modelli animali, ne hanno dimostrato l elevata attività antitumorale. E noto che, come altri composti della stessa famiglia, è in grado di legarsi al DNA, ma non si conoscono ancora i meccanismi d azione alla base del suo effetto antitumorale. A concentrazioni terapeuticamente rilevanti non sembra inibire nè enzimi coinvolti nel metabolismo del DNA nè altri bersagli solitamente colpiti dai farmaci antitumorali, quali topoisomerasi I e II o elicasi; è anche improbabile che il composto possa alchilare il DNA (1). L ipotesi di partenza di questo lavoro è che il farmaco, legandosi al DNA, possa inibire la trascrizione di geni critici per la proliferazione e sopravvivenza di cellule tumorali. Dai tests di proliferazione cellulare eseguiti al National Cancer Institute (NCI, Bethesda USA) su un campione di 60 linee cellulari, un trattamento di 48h con SR271425 ha dato come risultato un IC 50 media 1 di 1.7 µm, con un range compreso tra 0.28 µm e 10 µm. Le linee tumorali più sensibili al farmaco sono risultate quelle di polmone e colon (1). Colture cellulari Nel corso degli ultimi anni le colture cellulari hanno giocato un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi farmaci antitumorali; questo tipo di studi ha infatti permesso di ampliare le conoscenze sull uptake ed il flusso dei farmaci all interno della cellula, sui loro effetti sul metabolismo cellulare, sulla capacità d interagire con i recettori cellulari, etc (2). Colture cellulari, combinate per esempio con metodi colorimetrici in grado di misurare l attività antiproliferativa, costituiscono la base fondamentale per lo screening su larga scala di nuovi composti citotossici e citostatici. Tests clonogenici sono spesso utilizzati per misurare la 1 IC 50 è la concentrazione dell agente citotossico alla quale la metà delle cellule non prolifera (2). 5

sopravvivenza delle cellule e la loro capacità di proliferare a seguito dell esposizione con il farmaco citotossico (2). Nuovi e promettenti approcci prevedono l utilizzo di colture tridimensionali allo scopo di misurare la capacità di diffusione del farmaco ed il suo potenziale d azione in un ambiente che si avvicina molto a quello del tumore vero e proprio (2). FIGURA 1: Linea cellulare di tumore polmonare A549 (6). Una coltura cellulare deriva da cellule isolate da tessuti fatte crescere in un terreno di coltura che offra loro le condizioni ed i nutrienti necessari per la crescita (3, 4; vedi allegato 1). Al normale terreno di coltura è possibile aggiungere antibiotici al fine di preservare la coltura cellulare da eventuali contaminazioni batteriche o da micoplasma (5); anche se questo non sempre è vantaggioso in quanto potrebbe mascherare una contaminazione, impedendone una rapida identificazione. Si possono distinguere due tipi di colture cellulari: in sospensione, come nel caso delle cellule ematopoietiche, ed in adesione. Queste ultime provengono da tessuti solidi, per proliferare necessitano di una superficie alla quale attaccarsi e crescono formando un monostrato (4). FIGURA 2: Andamento delle cellule in coltura in funzione del tempo. Modificato da (3). Lo sviluppo delle cellule in coltura può essere diviso in tre fasi (figura 2). Una prima fase di stasi in cui le cellule si adattano alla nuova condizione e superano lo stress dato dalla manipolazione; una seconda fase di crescita esponenziale ed una terza in cui le cellule giungono a confluenza e vanno incontro alla morte per inibizione da contatto e per mancanza di sostanze nutritive (3). 6

Tests utilizzati MTT Questo tipo di test consente di valutare l attività citotossica di un farmaco; tanto più un farmaco è attivo da questo punto di vista, tanto più alto sarà il numero di cellule che smetterà di proliferare e lo farà in modo dipendente dalla dose. Il saggio si basa sul principio che le cellule proliferanti sono in grado di trasformare i sali di tetrazolio (MTT; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) in formazano (cristalli blu-neri). Il risultato del test viene valutato misurando allo spettrofotometro le densità ottiche emesse dai diversi pozzetti (3). Nei pozzetti più scuri ci saranno le cellule che stanno proliferando, mentre nei pozzetti più chiari le cellule si saranno fermate sotto l'effetto del farmaco. Questo tipo di test è relativamente rapido e conveniente, perché viene realizzato dalla semina alla misura delle densità ottiche nella stessa piastra ed i dati ottenuti allo spettrofotometro possono essere analizzati in modo semplice e veloce (7). Grazie alla sua semplicità e convenienza viene utilizzato per lo screening su larga scala di farmaci (2). FIGURA 3: Esempio di MTT. Da sinistra il controllo, al quale seguono concentrazioni crescenti di farmaco. Si può notare la diminuzione della proliferazione cellulare in rapporto alla concentrazione di farmaco, grazie alla diminuzione della colorazione nera nei pozzetti. Test clonogenico Questo test serve a valutare la capacità delle cellule tumorali di formare colonie anche in presenza del farmaco. Le cellule vengono seminate a basse concentrazioni e subito trattate con dosi crescenti di farmaco; dopo diversi giorni si conta il numero di colonie formate. Rispetto all MTT richiede un tempo maggiore e permette di valutare l azione del farmaco a lungo termine (2). Ciclo cellulare L analisi del ciclo cellulare (figura 5) è importante per lo studio dell attività di un farmaco, permette infatti di capire quale può essere il meccanismo d azione del farmaco in una determinata linea cellulare. L analisi del campione viene effettuata usando la citometria di flusso: singole cellule scorrono in fila grazie ad un flusso laminare e vengono colpite da un raggio di luce. In questo modo è possibile valutarne la grandezza, la densità e, a dipendenza della colorazione utilizzata, anche il contenuto di DNA e proteine (5). Per determinare il 7

contenuto di DNA, e quindi riconoscere la fase del ciclo in cui si trova la cellula (figura 4), il colorante maggiormente utilizzato è lo ioduro di propidio che s intercala al DNA e viene eccitato a 488 nm con un laser ad argon. Per fare in modo che il colorante penetri nella cellula, è necessario permeabilizzare e fissare le cellule prima della colorazione (5). FIGURA 4: Schema del ciclo cellulare (8). FIGURA 5: Istogramma del ciclo cellulare analizzato con il citometro di flusso, con le fasi G1, S e G2 (9). Come si può vedere nella figura 5, le cellule nella fase G2 hanno un contenuto di DNA doppio rispetto alla fase G1. Questo perché le cellule che si trovano in fase G1 non hanno ancora duplicato il DNA (2n) 2, mentre nella fase G2 (precedente alla mitosi) la duplicazione è avvenuta e le cellule hanno un contenuto di DNA pari a 4n. Nella fase S la quantità di DNA è intermedia rispetto a G1 e G2; vi sono infatti cellule che non hanno ancora duplicato completamente il loro DNA (10). Farmaci che danneggiano il DNA bloccano le cellule in punti di controllo del ciclo cellulare, in particolare in fase G1 ed in fase G2 (2). Questo blocco viene attivato dalla cellula per favorire la riparazione del danno prima di procedere con la duplicazione. 2 n= un corredo cromosomico, 23 cromosomi. 8

MATERIALI E METODI Colture cellulari Le linee cellulari tumorali di polmone e d ovaio (LGC Promochem/ATCC, Molsheim Cédex F) sono state coltivate in fiasche con una superficie d adesione di 25 cm 2, con terreno RPMI 1640 (RPMI + 25 mm HEPES + L-glutamina; Invitrogen AG, Basel CH) ed aggiunta del 10% di FBS (Siero Bovino Fetale; Invitrogen AG, Basel CH). Sono state cresciute in incubatore a 37 C con un apporto del 5% d anidride carbonica (CO 2 ). Come manipolare le cellule: sterilità Ambiente di lavoro Condizione fondamentale per lavorare con le colture cellulari è la sterilità. Per questo è necessario utilizzare cappe a flusso laminare con filtri appositi, all interno delle quali si possono aprire le fiasche contenenti le cellule, così come le bottiglie con il terreno di coltura e altre soluzioni che devono rimanere sterili. La cappa a flusso laminare delimita un area di lavoro sterile; il flusso d aria crea infatti una barriera nella parte anteriore della cappa, dove si trova l operatore (5), che serve a prevenire l entrata di contaminanti trasportati dall aria nella cappa. L area di lavoro all interno della cappa dovrebbe essere pulita regolarmente con etanolo al 70% (5). Generalmente questo tipo di cappe sono equipaggiate anche con lampade ad ultravioletti (5), da accendere 35 minuti a fine giornata per sterilizzare. Attrezzatura e soluzioni Tutto l equipaggiamento utilizzato per le colture cellulari deve essere sterile. Normalmente le pipette utilizzate sono di plastica, acquistate già sterili ed impacchettate singolarmente, monouso, così come le fiasche di coltura. Tutto il materiale non sterile, come ad esempio i puntali per le pipette, deve essere autoclavato. I terreni di coltura, il siero ed altre soluzioni, si possono acquistare sterili e pronti all uso. Manipolazione Tutto ciò che viene a contatto con le cellule deve essere aperto esclusivamente nella cappa a flusso laminare. Questo vale per il terreno di coltura ed altre soluzioni, così come per le pipette ed altro materiale sterile. All interno della cappa le bottiglie con le soluzioni possono rimanere aperte (5), i tappi si possono posare sulla superficie di lavoro ma solo capovolti, altrimenti i bordi si contaminerebbero. Per evitare contaminazioni involontarie è comunque buona regola chiudere sempre le bottiglie e le fiasche di coltura dopo ogni operazione. Inoltre è consigliabile controllare giornalmente al microscopio le cellule in coltura per osservare la crescita ed assicurarsi che non siano contaminate in modo evidente da batteri (5). 9

Espansione della coltura Quando le cellule ricoprono l 80% della superficie della fiasca e sono ancora in attiva proliferazione, è necessario espandere la coltura, evitando così che le cellule subiscano modificazioni a causa dell inibizione da contatto. Dopo avere tolto il terreno di coltura dalla fiasca, la superficie sulla quale aderiscono le cellule è stata lavata con 5 ml di PBS 1X sterile (ph 7.4 ± 0.05, NOMgCl 2, NOCaCl 2 ; Invitrogen AG, Basel CH) a temperatura ambiente. Con l aggiunta di 500 µl di tripsina (tripsina 0.5% EDTA; Fluka Chemie GmbH, Buchs CH) ed un incubazione di 5 minuti a 37 C, le cellule sono state staccate dalla fiasca. A questo punto sono state recuperate con 5 ml di terreno 3 e trasferite in una provetta sterile da 15 ml. E stata eseguita una centrifugazione di 8 minuti a 1500 rpm per rimuovere eventuali detriti cellulari e cellule morte. Dopo l eliminazione del sovranatante le cellule sono state risospese con 5 ml di terreno fresco. Messa in coltura Con il materiale risospeso sono state preparate due nuove fiasche per portare avanti la linea e, nel caso servissero anche per un trattamento, sono state contate utilizzando il contatore automatico Z2 Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton CA, USA). SR271425 Il farmaco è fornito come polvere di colore giallo in un contenitore che lo protegge dalla luce e deve essere conservato a 4 C. Ha una massa molecolare di 413.54 g/mol. E solubile in cloroformio e dimetil-sulfossido (DMSO), difficilmente solubile in etanolo e metanolo, e praticamente insolubile in acqua (1). Per i nostri studi SR271425 è stato ricostituito in DMSO sterile (Fluka Chemie GmbH, Buchs CH) alla concentrazione 20 mm (soluzione madre), dalla quale è stata effettuata una diluizione a 1 mm sempre utilizzando DMSO sterile. Queste due soluzioni sono state conservate a -20 C e scongelate secondo necessità. MTT Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti, 100 µl per pozzetto, alla concentrazione necessaria (1.5x10 4 cellule/ml), facendo in modo che alla fine dell esperimento non fossero giunte a confluenza. Dopo 24 h dalla semina per le linee polmonari e 72 h per le linee ovariche 4, le cellule sono state trattate con il farmaco a differenti concentrazioni (linee ovariche: 0.5 µm, 1 µm, 1.5 µm, 2 µm, 3 µm; linee polmonari: 0.25 µm, 0.5 µm, 1 µm, 1.5 µm, 2 µm). 3 Il terreno deve sempre essere ambientato in precedenza a 37 C. 4 Tempo necessario affinché possano aderire alla piastra. 10

Partendo dalla concentrazione 1 mm in DMSO, il farmaco è stato diluito serialmente con terreno RPMI 1640 e 100 µl di ogni diluizione sono stati aggiunti ai rispettivi pozzetti, dopo avere aspirato il terreno presente. La prima fila di pozzetti è stata tenuta come controllo non trattato aggiungendo solo terreno di coltura. Dopo 72 h è stato eseguito il saggio colorimetrico con l aggiunta di 10 µl di soluzione MTT (5 mg/ml di PBS 1X sterile; Fluka Chemie GmbH, Buchs CH) ad ogni pozzetto. Dopo 4 h d incubazione a 37 C e 5% CO 2, sono stati aggiunti 100 µl di soluzione di lisi (25% SDS, 0.025 N HCl) per ogni pozzetto. La piastra è stata incubata per 2 h a 37 C e 5% CO 2. Infine è stata eseguita la lettura delle densità ottiche a 570 nm con lo spettrofotometro Microplate Reader AD 340 (Beckman Coulter, Fullerton CA, USA). Dopo aver analizzato i dati è stata calcolata l IC 50 con il programma Rbioconductor. Test clonogenico Le cellule sono state seminate in piastre da 12 pozzetti a bassa concentrazione (IGROV1 e SKOV3: 300 cellule/ml; A549: 200 cellule/ml), per fare in modo che aderissero al pozzetto singolarmente. Subito dopo averle seminate, è stato aggiunto il farmaco con tre diverse concentrazioni (1 µm, 2 µm, 4 µm), lasciando la prima fila non trattata come controllo. Quando colonie formate da un numero maggiore di cinque cellule erano visibili al microscopio nei pozzetti di controllo, è stato rimosso il terreno, i pozzetti sono stati lavati con PBS 1X ed è stato aggiunto il colorante cristal violetto (1 g cristal violetto (Fisher Scientific Winiger, Wohlen CH) in 100 ml EtOH 20%, filtrato). Dopo un incubazione di 5 minuti, il colorante è stato rimosso e le piastre sono state lavate in un becker con acqua corrente demineralizzata. Ciclo cellulare Le cellule sono state seminate in quattro fiasche con una superficie d adesione di 25 cm 2 ad una concentrazione che, alla fine dell esperimento, permettesse di avere a disposizione un milione di cellule in ogni fiasca per l analisi con il citometro di flusso (IGROV1: 2.5x10 4 cellule/ml, SKOV3: 1.5x10 4 cellule/ml, A549: 5.0x10 4 cellule/ml). Dopo 24 h dalla semina per le linee polmonari, e 72 h per quelle ovariche, le cellule sono state trattate con le stesse concentrazioni di farmaco stabilite già per il test clonogenico (1 µm, 2 µm, 4 µm), tenendo una fiasca non trattata come controllo. Dopo 24 h dal trattamento è stato rimosso il terreno da ogni fiasca e conservato in quattro provette separate, dopodiché le fiasche sono state lavate con PBS sterile 1X e le cellule sono state staccate dalle fiasche con 500 µl di tripsina. Dopo 5 minuti d incubazione a 37 C e 5% di CO 2, le cellule sono state recuperate con 5 ml di terreno ed aggiunte alle provette corrispondenti (contenenti già il terreno rimosso in precedenza). E stata eseguita una centrifugazione di 10 minuti a 1500 rpm, rimosso il sovranatante e le cellule sono state lavate con 5 ml di PBS 1X con aggiunta dell 1% di FBS. A questo punto le cellule sono state contate e, dopo una seconda centrifugazione di 10 minuti a 1500 rpm e rimozione del sovranatante, sono state risospese con EtOH 80% conservato a -20 C (1 ml 11

per milione di cellule), aggiunto goccia a goccia agitando continuamente. Le cellule sono state fissate per almeno un ora a -20 C. Dopo il periodo di fissazione è stato eseguito un lavaggio con PBS 1X con aggiunta dell 1% di FBS (due volumi rispetto all EtOH utilizzato), ed una centrifugazione di 10 minuti a 2000 rpm. Le cellule sono state risospese con 2 ml di PBS 1X con l aggiunta dell 1% di FBS e trasferite nelle provette per FACS. E stata eseguita un ultima centrifugazione di 10 minuti a 2000 rpm e dopo la rimozione del sovranatante le cellule sono state risospese con una mix contenente 250 µl di Ribonucleasi A 150 KU 5 (Fluka Chemie GmbH, Buchs CH) e 250 µl di ioduro di propidio 100 µg/ml (Fluka Chemie GmbH, Buchs CH). Dopo 15 min d incubazione a temperatura ambiente e al buio, le cellule sono state analizzate al citometro di flusso FACScalibur (Becton Dickinson, Basel CH). L analisi dei dati è stata eseguita con il programma ModFit LT 3.0. 5 Unità di Kunitz. 12

RISULTATI MTT Linee polmonari Le concentrazioni di farmaco utilizzate per eseguire questo test sono state scelte in base ai risultati ottenuti dal National Cancer Institute. Partendo da questi dati abbiamo utilizzato una serie di concentrazioni comprese tra 0.25 e 2 µm. Dopo un primo screening queste concentrazioni sono risultate valide e sono state adottate per i successivi esperimenti. Dai risultati dell MTT ottenuti con le quattro linee polmonari (figura 6) si può vedere che A549 (IC 50 0.95 µm) e H460 (IC 50 0.88 µm) sono più sensibili, mentre H441 (IC50 2.73 µm) e H358 (IC 50 3.15 µm) sono più resistenti al trattamento (vedi allegato 2). Lo scopo di questo test era verificare l attività di SR271425 e stabilire le concentrazioni da cui partire per i tests seguenti (test clonogenico e ciclo cellulare). A B 120 A549 120 H460 % crescita cellulare 100 80 60 40 20 % crescita cellulare 100 80 60 40 20 0 Controllo 0.25 0.5 1 1.5 2 Concentrazioni farmaco (µm) 0 Controllo 0.25 0.5 1 1.5 2 Concentrazioni farmaco (µm) C D 120 H441 140 H358 % crescita cellulare 100 80 60 40 20 % crescita cellulare 120 100 80 60 40 20 0 Controllo 0.25 0.5 1 1.5 2 Concentrazioni farmaco (µm) 0 Controllo 0.25 0.5 1 1.5 2 Concentrazioni farmaco (µm) FIGURA 6: Attività antiproliferativa in linee tumorali polmonari A549 (A), H460 (B), H441 (C) e H358 (D). Le cellule sono state incubate con concentrazioni crescenti di SR271425. Dopo 72 h è stata misurata la capacità proliferativa delle cellule mediante un saggio di MTT. I grafici rappresentano la media ± deviazione standard dei campioni in triplicato. 13

Linee ovariche Le linee ovariche scelte per questo studio sono interessanti in quanto rappresentano tre diversi stati del gene p53: SKOV3 (nulle; 11), A2780 e IGROV1 (wild type; 12, 13), OVCAR5 (mutate; 12). Questo ci permette di studiare un eventuale coinvolgimento di p53 nella risposta al trattamento (14). Dato che l ipotesi è che SR271425 si leghi al DNA, le linee con p53 wild type dovrebbero risultare più sensibili al trattamento. Dai dati ottenuti si può osservare che delle quattro linee, le SKOV3 sono risultate essere le meno sensibili, con un inibizione del 50% superiore a 4 µm, mentre nelle altre linee l inibizione si ha a concentrazioni inferiori a 2.5 µm (vedi allegato 2). Le concentrazioni di farmaco sono state scelte in seguito ai primi tests eseguiti sulle linee di polmone. Non mostrando quest ultime una risposta significativa a 0.25 µm, abbiamo deciso di togliere questa concentrazione e di aggiungerne una maggiore (3 µm). A B 120 IGROV1 120 A2780 % crescita cellulare 100 80 60 40 20 % crescita cellulare 100 80 60 40 20 0 Controllo 0.5 1 1.5 2 3 0 Controllo 0.5 1 1.5 2 3 Concentrazioni farmaco (µm) Concentrazioni farmaco (µm) C D 120 SKOV3 120 OVCAR5 % crescita cellulare 100 80 60 40 20 % crescita cellulare 100 80 60 40 20 0 Controllo 0.5 1 1.5 2 3 Concentrazioni farmaco (µm) 0 Controllo 0.5 1 1.5 2 3 Concentrazioni farmaco (µm) FIGURA 7: Attività antiproliferativa in linee tumorali ovariche IGROV1 (A), A2780 (B), SKOV3 (C) e OVCAR5 (D). Le cellule sono state incubate con concentrazioni crescenti di SR271425. Dopo 72 h è stata misurata la capacità proliferativa delle cellule mediante un saggio di MTT. I grafici rappresentano la media ± deviazione standard dei campioni in triplicato. 14

Test clonogenico Abbiamo eseguito il test con tre linee cellulari, scegliendole in base alla risposta mostrata nell MTT: una linea polmonare ed una ovarica, A549 e IGROV1, risultate più sensibili al farmaco; ed una linea ovarica, SKOV3, risultata meno sensibile al farmaco. Le concentrazioni di farmaco sono state scelte in base ai risultati ottenuti dall MTT. Come si può vedere dalle figure 8, 9, e 10, l SR271425 inibisce totalmente la crescita delle colonie di A549 e IGROV1 già a 2 µm, mentre per SKOV3 l inibizione a 2 µm non è ancora completa. Per questo test abbiamo scelto differenti concentrazioni iniziali di cellule a dipendenza dell efficienza di formare colonie della linea utilizzata. Controllo 1 µm 2 µm 4 µm FIGURA 8: Test clonogenico effettuato con con cellule di tumore ovarico IGROV1. Concentrazione iniziale di cellule: 300/pozzetto. Trattamento con tre differenti concentrazioni di farmaco per una durata di 8 giorni. Controllo 1 µm 2 µm 4 µm FIGURA 9: Test clonogenico effettuato con con cellule di tumore ovarico SKOV3. Concentrazione iniziale di cellule: 300/pozzetto. Trattamento con tre differenti concentrazioni di farmaco per una durata di 8 giorni. Controllo 1 µm 2 µm 4 µm FIGURA 10: Test clonogenico effettuato con cellule di tumore polmonare A549. Concentrazione iniziale di cellule: 200/pozzetto. Trattamento con tre differenti concentrazioni di farmaco per una durata di 8 giorni. 15

Ciclo cellulare A B C IGROV1 CONTROLLO SKOV3 CONTROLLO A549 CONTROLLO 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 G1: 56.8% S: 28.5% G2: 14.7% 0 1000 2000 3000 4000 5000 G1: 49.0% S: 31.0% G2: 20.0% 0 1000 2000 3000 4000 5000 G1: 62.4% S: 29.9% G2: 7.8% IGROV1 1 µm SR271425 SKOV3 1 µm SR271425 A549 1 µm SR271425 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 G1: 61.5% S: 24.4% G2: 14.1% 0 1000 2000 3000 4000 5000 G1: 51.3% S: 31.8% G2: 16.9% 0 1000 2000 3000 4000 5000 G1: 63.8% S: 29.2% G2: 7.0% IGROV1 2 µm SR271425 SKOV3 2 µm SR271425 A549 2 µm SR271425 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 G1: 69.5% S: 16. 1% G2: 14.4% 0 1000 2000 3000 4000 5000 G1: 61.0% S: 23.5% G2: 15.5% 0 2000 4000 6000 G1: 69.5% S: 23.9% G2: 6.6% IGROV1 4 µm SR271425 SKOV3 4 µm SR271425 A549 4 µm SR271425 0 2000 4000 6000 G1: 79.6% S: 6.0% G2: 14.5% 0 1000 2000 3000 4000 5000 G1: 62.2% S: 20.9% G2: 16.9% 0 2000 4000 6000 G1: 90.3% S: 2.0% G2: 7.7% FIGURA 11: Analisi del ciclo cellulare eseguita con le linee ovariche IGROV1 (A) e SKOV3 (B), e la linea polmonare A549 (C) dopo un trattamento di 24 h e colorazione con ioduro di propidio. L analisi è stata eseguita con il citometro di flusso. 16

Abbiamo eseguito il test con le stesse linee cellulari utilizzate in precedenza per il test clonogenico. Nella figura 11 si può vedere che il farmaco induce un blocco in fase G1 nelle linee con p53 wild type IGROV1 (aumento da 56.8% a 79.6%) e A549 (aumento da 62.4% a 90.3%) e alla concentrazione 4 µm la fase S scompare in entrambe le linee. Per la linea ovarica SKOV3 con p53 nullo, abbiamo osservato qualitativamente la stessa risposta ottenuta con le due linee polmonari, ma quantitativamente più debole. Questi dati sono dunque in accordo con quelli ottenuti con gli altri tests, MTT e clonogenico. 17

COMMENTI AI RISULTATI - DISCUSSIONE MTT L esecuzione di questo test ci ha permesso di verificare l attività di SR271425, stabilendo le concentrazioni da cui partire per i tests previsti. Dai risultati si può vedere che il farmaco è attivo ed inibisce la proliferazione delle cellule in modo dipendente dalla dose. Alcune linee cellulari utilizzate sono risultate più sensibili di altre, com è il caso per le A549 (p53 wild type; 15), H460 (p53 wild type; 15) per le linee polmonari (figura 6). H358 (p53 nulle; 15) e H441 (p53 mutate; 16) sono sembrate invece più resistenti al trattamento (figura 6). Tra le linee di tumore ovarico si nota particolarmente la scarsa sensibilità di SKOV3 (p53 nulle), con un inibizione del 50% superiore a 4 µm, mentre nelle altre linee l inibizione si ha a concentrazioni attorno a 2 µm (figura 7). Test clonogenico Con questo test abbiamo voluto verificare la capacità delle cellule tumorali di formare colonie dopo il trattamento con il farmaco. Grazie a questo test possiamo anche affermare che il farmaco ha un effetto prolungato nel tempo. I risultati di questo test concordano dunque con quelli ottenuti con l MTT. Ciclo cellulare Dall analisi del ciclo cellulare (figura 11), si può notare chiaramente come il farmaco induca un blocco in G1 e, ad alte concentrazioni, la scomparsa della fase S nelle linee cellulari IGROV1 e A549, entrambe con p53 wild type. E interessante notare la differenza quantitativa con la linea ovarica SKOV3, con p53 nullo. Con questa linea otteniamo lo stesso tipo di risposta riscontrata con IGROV1 e A549, ma qualitativamente più debole. Questo conferma la maggiore resistenza di questa linea ovarica a SR271425. I dati ottenuti concordano con l ipotesi che il farmaco si lega al DNA e attiva p53. E infatti in fase G1 che le cellule con p53 intatto si bloccano per cercare di riparare un danno. Questa fase è dunque un punto di controllo nel quale la cellula può fermare la duplicazione del DNA, prima di entrare in mitosi. La diminuzione della fase S si osserva perché le cellule vengono bloccate in G1 e non passano oltre. I risultati ottenuti con SKOV3 ci fanno pensare che il farmaco non induca solamente l attivazione di p53, ma che ci sia anche un altro meccanismo alla base del suo funzionamento ed effetti sul ciclo cellulare. 18

CONCLUSIONE Grazie a questi studi preliminari abbiamo potuto verificare l attività di SR271425 ed osservare il suo influsso sul ciclo cellulare di tre differenti linee tumorali. E nostra intenzione osservare il comportamento nel test clonogenico e nel ciclo cellulare anche della linea tumorale H441, essendo essa p53 mutata. Per confermare un coinvolgimento di p53 nella risposta al farmaco, verrà studiata l espressione di p53 proteina e di proteine da essa regolate (p21, bax, ecc.) dopo trattamenti a diversi tempi (14). Inoltre verrà studiata un eventuale presenza di apoptosi cellulare trattando le cellule per tempi più o meno lunghi e studiando l attivazione di proteine che sono notoriamente coinvolte nel processo apoptotico (parp, caspasi; 7). In futuro, si valuteranno gli effetti di SR271425 sulla trascrizione di geni espressi ad alti livelli in cellule di tumore ovarico e polmonare. Questi risultati ci permetteranno di identificare le condizioni sperimentali da utilizzare in studi futuri sui meccanismi d azione del farmaco ed in studi clinici. 19

BIBLIOGRAFIA (1) Dati forniti dalla ditta produttrice (Sanofi-Synthelabo, Malvern, PA USA) (2) Baguley, B., C., Kerr, D., J.; Anticancer Drug Development; Academic Press (2002) (3) Mariottini, G. L., Capicchioni, V., Guida, L., Mattioli, F., Penco, S., Romano, P., Scarabelli, L.; Introduzione Alle Colture Cellulari; Morgan (2003) (4) Guenzi, S.; Terreni, reagenti e supplementi per Tissue Culture; Biotecnologie 2000 (2004) (5) Spector, D. L, Goldman, R., D. Leinwand, L., A.; Cells, A Laboratory Manual. Volume 1: Culture and Biochemical Analysis of Cells; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998) (6) http://www.amaxa.com/a549.html (7) Roche Applied Science; Apoptosis, Cell Death and Cell Proliferation; Third edition (8) Roche Applied Science Lab FAQS; second edition (9) http://science.cancerresearchuk.org/sci/facs/facs_major_apps/cell_cycle_analysis/ (10) Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J., D.; Molecular Biology of the Cell, Third Edition; Garland Publishing (11) Sasaki, H., Sheng, Y., Kotsuji, F., Tsang, B., K.; Down-regulation of X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein Induces Apoptosis in Chemoresistant Human Ovarian Cancer Cells; Cancer Research 60, 5659-5666 (2000) (12) Mitsuuchi, Y., Johnson, S., W., Selvakumaran, M., Williams, S., J., Hamilton, T.,C., Testa, J., R.; The Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT Signal Transduction Pathway Plays a Critical Role in the Expression of p21waf1/cip1/sdi1 Induced by Cisplatin and Paclitaxel; Cancer Research 60, 5390-5394 (2000) (13) Casalini, P., Botta, L., Menard, S.; Role of p53 in HER2-induced Proliferation or Apoptosis; The Journal of Biological Chemistry 276, 12449-12453 (2001) (14) Bode, A., M., Dong, Z.; Post-Translational Modification of p53 in Tumorigenesis; Nature Reviews Cancer 4, 793-805 (2004) (15) Fukazawa, T., Walter, B., Owen-Schaub, L., B.; Adenoviral Bid Overexpression Induces Caspase-dependent Cleavage of Truncated Bid and p53-independent Apoptosis in Human non-small Cell Lung Cancers; The Journal of Biological Chemistry 278, 25428-25434 (2003) (16) Khan, Q., A., Anderson, L., M.; Hydrocarbon Carcinogens Evade Cellular Defense Mechanism of G1 Arrest in Nontransformed and Malignant Lung Cell Lines; Toxicology and Applied Pharmacology 173, 105-113 (2001) 20

Ringrazio di cuore le seguenti persone: RINGRAZIAMENTI La mia famiglia e Lorenzo, che in questi mesi mi sono stati particolarmente vicini. Prof. Franco Cavalli, per avermi dato la possibilità di svolgere il mio lavoro di diploma presso il Laboratorio di Oncologia Sperimentale dell Istituto Oncologico della Svizzera Italiana. Dr. Carlo Catapano, per avermi seguita ed aiutata durante lo svolgimento del mio lavoro di diploma. Veronica Albertini, per la sua disponibilità, il suo aiuto, i suoi preziosi insegnamenti ed il supporto ricevuto durante lo svolgimento di questo lavoro. Sara Napoli, per avermi gentilmente aiutata con l analisi al FACS. Claudio Realini, per i dati forniti e la disponibilità mostrata nei miei confronti. Tutto il personale del laboratorio di Oncologia Sperimentale dell Istituto Oncologico della Svizzera Italiana, per la cortesia e la disponibilità mostrata nei miei confronti. Andrea Boffini, per l aiuto ed i consigli che mi ha dato. Susan Gilbert, per le correzioni effettuate alla traduzione inglese del riassunto. Francesco Bezzola, per avere messo a disposizione le sue ore di lezione permettendomi di redigere il lavoro. Daniela Marcacci, per l interesse dimostrato per questo lavoro. 21

ALLEGATI Allegato 1 Terreni di coltura I terreni di coltura si possono trovare in commercio e contengono le componenti nutritive necessarie alla crescita e sopravvivenza delle cellule: glucosio, aminoacidi, sali inorganici e vitamine (4, 5). Ce ne sono di diversi tipi (RPMI 1640, Dulbecco s Modified Eagle s Medium, e altri ancora) (4) a dipendenza delle cellule che s intende coltivare, avendo queste esigenze nutritive differenti l una dall altra. Il glucosio è la fonte principale di energia e di carbonio per la cellula (4). Gli aminoacidi sono necessari alla sintesi delle proteine; tredici sono considerati essenziali e devono essere presenti nel terreno, tra questi si possono citare per esempio la tirosina e la cisteina, sintetizzate solamente dagli epatociti (5) e la glutamina necessaria come fonte energetica per la cellula (3). I sali inorganici forniscono ioni sodio (Na + ), calcio (Ca 2+ ), potassio (K + ), magnesio (Mg 2+ ), cloruro (Cl - ), solfato (SO 2-4 ), fosfato (PO 2-4 ), carbonato (CO 2-3 ), che servono a mantenere l equilibrio osmotico all interno della cellula; hanno inoltre una funzione tampone (3, 4). Le vitamine sono utilizzate come catalizzatori o come substrati per alcune funzioni metaboliche (4). Il siero (Siero Bovino Fetale, FBS) viene aggiunto direttamente al terreno di coltura in percentuale del 10%. Contiene i fattori di crescita, i fattori d adesione ed altri elementi importanti per la crescita delle cellule (la transferrina, l albumina, il colesterolo), acidi grassi ed elementi minerali in tracce (rame, zinco e cobalto) (3, 4). Sistemi tampone Il ph di un terreno di coltura per molte cellule dovrebbe essere compreso tra 7.2 e 7.4 (5), ed è necessario un sistema tampone per mantenere questo ph costante. Molti terreni di coltura per questo scopo contengono bicarbonato di sodio (NaHCO 3 ) (5). Il ph è mantenuto dal giusto rapporto tra il livello di CO 2 nella fase gassosa ed il livello di bicarbonato nel terreno. Il tappo della fiasca deve quindi permettere lo scambio di gas tra fiasca ed incubatore (5). Spesso al terreno è aggiunto un indicatore di ph, come il rosso fenolo (4), grazie al quale è possibile osservare un eventuale cambiamento di ph. Dopo qualche giorno di coltura il colore del terreno vira perché le cellule in attiva crescita usano il glucosio per ottenere energia producendo così acido lattico e CO 2 che acidificano il terreno. In molti terreni in aggiunta al bicarbonato viene utilizzato l HEPES, una molecola organica con potere tampone, in grado di aumentare la capacità tamponante del bicarbonato e stabilizzare ulteriormente la coltura (4). 22

Allegato 2 Tabella delle IC 50 LINEA CELLULARE IC 50 µm ± DEVIAZIONE STANDARD A549 0.95 ± 0.1 H460 0.88 ± 0.1 H441 2.73 ± 0.5 H358 3.15 ± 1.1 IGROV1 2.23 ± 0.5 A2780 1.76 ± 0.5 SKOV3 4.38 ± 1.1 OVCAR5 2.17 ± 0.5 23