Codice K4003: il prodotto seguente è sufficiente per 1100 sezioni di tessuto, sulla base di un utilizzo di 100 µl per sezione:

Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit Codice K4002 15 ml Codice K4003 110 ml Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. Queste istruzioni sono valide per il sistema Dako EnVision +, Peroxidase (DC EnVision+ System, HRP). Questo kit è destinato all uso con anticorpi primari di coniglio forniti dall operatore per l identificazione qualitativa di antigeni mediante microscopio ottico in tessuti normali e patologici inclusi in paraffina, in tessuti al criostato o in preparazioni cellulari. Possono essere utilizzati tessuti processati con una serie di fissativi, compresi etanolo, B-5, fissativo di Bouin, zinco formalina e formalina tamponata a ph neutro. Fare riferimento a Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica o alle Istruzioni del sistema di rilevamento delle procedure di immunoistochimica (IHC) per: (1) Principio della procedura, (2) Materiale necessario, ma non fornito, (3) Conservazione, (4) Preparazione dei campioni, (5) Procedura di colorazione, (6) Controllo di qualità, (7) Eventuali problemi e risoluzione, (8) Interpretazione della colorazione, (9) Limitazioni generali. Sommario e spiegazione Principi della procedura Il sistema EnVision+ System, HRP è una tecnica di colorazione IHC a due fasi. Questo sistema è basato su un polimero marcato con HRP, coniugato agli anticorpi secondari. Il polimero marcato non contiene avidina o biotina. Quindi la colorazione aspecifica dovuta all attività avidina-biotina endogena, che si osserva nei tessuti epatici, renali, linfoidi e nelle sezioni al criostato, è eliminata o significativamente ridotta. Il reagente del sistema EnVision+, HRP è pronto per l uso. Questo sistema è un metodo estremamente sensibile e le diluizioni ottimali dell anticorpo primario sono fino a 20 volte superiori di quelle utilizzate nella tecnica PAP (perossidasi antiperossidasi) tradizionale e diverse volte maggiori di quelle utilizzate nei metodi ABC o LSAB tradizionali. Questo protocollo offre un sistema di intensificazione del segnale per la rilevazione degli antigeni presenti a basse concentrazioni o per gli anticorpi primari a titolo basso. Gli anticorpi primari prodotti da coniglio reagiscono bene con il polimero marcato. L interpretazione di qualsiasi colorazione positiva o della sua assenza deve essere accompagnata da studi morfologici e istologici con i controlli opportuni. Qualsiasi attività perossidasica endogena è eliminata incubando il campione con un reagente di blocco della perossidasi adeguato. Il campione è poi incubato con l anticorpo primario opportunamente caratterizzato e diluito e in seguito con il polimero marcato mediante 2 incubazioni consecutive di 30 minuti. Si deve notare che per gli anticorpi che necessitano di digestione enzimatica o smascheramento del bersaglio, può essere necessario aumentare i tempi di incubazione dell anticorpo primario e del polimero marcato da 5 a 10 minuti. La colorazione è completata con un incubazione di 5 10 minuti con il substrato-cromogeno adatto. Reagente fornito Codice K4002: il prodotto seguente è sufficiente per 150 sezioni di tessuto, sulla base di un utilizzo di 100 µl per sezione: Flacone n. Quantità Descrizione 2 1x15 ml Polimero marcato: polimero marcato con perossidasi, coniugato all anticorpo di capra anti-immunoglobuline di coniglio in tampone Tris-HCl, contenente stabilizzatore proteico e un agente antimicrobico. Codice K4003: il prodotto seguente è sufficiente per 1100 sezioni di tessuto, sulla base di un utilizzo di 100 µl per sezione: Flacone n. Quantità Descrizione 1 1x110 ml Polimero marcato: polimero marcato con perossidasi, coniugato all anticorpo di capra anti-immunoglobuline di coniglio in tampone Tris-HCl, contenente stabilizzatore proteico e un agente antimicrobico. (107940-004) 302063IT_003 p. 1/7

Materiali necessari, ma non forniti Salviettine assorbenti Controllo di tessuto, negativo e positivo Colorante di contrasto a base acquosa, quale l ematossilina di Mayer o il Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (codice S3309) Vetrini coprioggetto Acqua distillata Reagente per il blocco della perossidasi endogena, quale Dual Endogenous Enzyme Block (code S2003) Etanolo, assoluto e al 95% Microscopio ottico (20x 800x) Mezzi di montaggio, quale Glycergel Mounting Medium (codice C 0563) o Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (codice S 3025) oppure mezzo di montaggio permanente non acquoso, Ultramount (codice S1964) Anticorpi primari o reagente di controllo negativo Vetrini, rivestiti in poli-l-lisina o Silanized Slides (codice S3003) Vaschette o bagni per la colorazione Soluzione di substrato-cromogeno, come AEC+ Substrate-Chromogen (codice K3469, 110 ml, pronto per l uso) o Liquid DAB+ ( codice K3468) Cronometro (in grado di misurare intervalli di 3 40 minuti) Flaconi di lavaggio Soluzione del tampone di lavaggio Xilene, toluene o derivati dello xilene Materiali opzionali necessari, ma non forniti Idrossido di azoto, 15 mol/l diluito a 0,037 mol/l PAP Pen (codice S2002) Precauzioni Conservazione 1. Per operatori specializzati. 2. Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza prevista per i metodi di conservazione consigliati. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate nel foglio illustrativo, l operatore deve verificarne le condizioni. 3. Non sostituire i reagenti con quelli di altri lotti o di kit di produttori diversi. 4. Gli enzimi e i substrato-cromogeni possono essere alterati, se esposti a eccessivi livelli di luce. Non conservare i componenti del kit né procedere alla colorazione in condizioni di luce intensa, come la luce solare diretta. 5. Tempi o temperature di incubazione diverse da quelle specificate possono dare risultati erronei, qualsiasi cambiamento di questo tipo deve essere convalidato dall operatore. 6. Utilizzare le procedure di manipolazione indicate per i prodotti derivati da fonti biologiche. 7. Indossare dispositivi di protezione individuale idonei per evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. 8. La soluzione inutilizzata deve essere smaltita in conformità alle norme locali, statali e federali. EnVision+, HRP deve essere conservato a 2 8 C. Non congelare. Non usare dopo la data di scadenza indicata sulle fiale dei reagenti e sull etichetta del prodotto. L alterazione dell aspetto di qualsiasi reagente, come la precipitazione, può indicare instabilità o deterioramento. In tali casi non utilizzare il(i) reagente(i). Non esistono segni evidenti che indichino l instabilità di questi prodotti. Per questo motivo è necessario testare i controlli positivi e negativi con ogni campione del paziente. Se si dovesse osservare una colorazione inattesa non attribuibile a modifiche delle procedure di laboratorio e si sospetta un problema relativo al kit, contattare il Servizio tecnico Dako. (107940-004) 302063IT_003 p. 2/7

Preparazione del reagente È opportuno preparare i seguenti reagenti prima della colorazione. Soluzione del tampone di lavaggio Il TBST 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (codice S3006) è il tampone di lavaggio raccomandato per la rilevazione IHC manuale e automatizzata. Anche le soluzioni di lavaggio TBS 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (codice S1968) e PBS 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (codice S3024) sono adatte per la colorazione manuale. Si sconsiglia l utilizzo delle soluzioni del tampone di lavaggio che contengono azide sodica. L azide sodica inattiva la perossidasi di rafano (HRP) determinando una colorazione negativa. Conservare il tampone inutilizzato a 2 8 C. Eliminare il tampone in caso appaia torbido. Per sciacquare il reagente di blocco della perossidasi, il substrato e il colorante di contrasto si può utilizzare l acqua distillata. Anticorpo primario Gli anticorpi NP-Series Plus ready-to-use sono ottimizzati e consigliati per l uso con i sistemi di rilevazione ad alta sensibilità Dako Plus. Presso Dako sono disponibili anche gli anticorpi concentrati. L ottimizzazione degli anticorpi concentrati deve essere eseguita dall operatore finale. Le diluizioni devono essere preparate utilizzando l Antibody Diluent (codice S0809) o un diluente contenente il tampone Tris-HCl 0,05 mol/l con albumina di siero bovino (BSA) 1%. Gli anticorpi NP-Series ready-to-use non sono ottimizzati per l uso con i sistemi di rilevazione ad alta sensibilità Dako Plus. Per la maggioranza degli anticorpi primari utilizzati con questo kit, è sufficiente un tempo di incubazione di 30 minuti. Reagente di controllo negativo Idealmente un reagente di controllo negativo contiene un anticorpo che non esibisce reattività specifica contro i tessuti umani o siero normale/non immune nella stessa matrice/soluzione dell anticorpo primario diluito. Il reagente di controllo negativo deve essere della stessa specie animale e sottoclasse dell anticorpo primario, diluito alla sua stessa concentrazione immunoglobulinica o proteica nello stesso diluente. Il periodo di incubazione per il reagente di controllo negativo deve corrispondere a quello dell anticorpo primario. Quando si utilizzano gli anticorpi Dako NP-Series Plus ready-to-use si consiglia di usare come controllo negativo l Universal Negative Control+ ottimizzato per l utilizzo con gli anticorpi di coniglio NP-Series Plus ready-to-use (codice NP001). Per le informazioni specifiche riguardanti la preparazione del reagente di controllo negativo, fare riferimento alla sezione Controllo di qualità. Colorante di contrasto Il prodotto finale colorato della reazione di colorazione è una sostanza alcolica insolubile e può essere utilizzato con coloranti di contrasto a base alcolica o acquosa, quale l ematossilina di Mayer o il Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (codice S3309). Dopo la colorazione di contrasto con ematossilina e un abbondante risciacquo in acqua distillata, immergere i vetrini con i tessuti in un bagno di ammoniaca 0,037 mol/l o di agenti che tingono di blu simili. La soluzione ammoniacale (37 mol/l) viene preparata mescolando 2,5 ml di idrossido di ammonio 15 mol/l (concentrato) con 1 L di acqua. La soluzione ammoniacale inutilizzata a 0,037 mol/l può essere conservata a temperatura ambiente (20 25 C) in un flacone ben chiuso per 12 mesi. Per procedure di colorazione alternative, consultare le linee guida dei produttori. Mezzo di montaggio Per il montaggio a base acquosa, si raccomanda l uso di Glycergel Mounting Medium (codice C0563) oppure di Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (codice S 3025). Glycergel deve essere riscaldato almeno a 50 C prima dell uso. Si può utilizzare anc he il mezzo di montaggio permanente non acquoso (Ultramount, codice S1964). Preparazione del campione Fare riferimento a Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica e/o alle Schede delle specifiche tecniche degli anticorpi. Prima della colorazione IHC, fissare e trattare i tessuti. La fissazione evita l autolisi e la decomposizione dei tessuti rimossi, preserva l antigenicità, accresce l indice di rifrazione dei componenti tissutali e aumenta la resistenza degli elementi cellulari al processamento del tessuto stesso. Il processamento tissutale include la disidratazione, l eliminazione degli agenti essiccanti, l infiltrazione dei mezzi di inclusione, l inclusione e la sezione dei tessuti. I fissativi più comuni per le preparazioni tissutali per l IHC sono descritti nelle Istruzioni generali della colorazione immunoistochimica. Queste sono solo delle linee guida; spetta all operatore determinare e verificare le procedure migliori. (107940-004) 302063IT_003 p. 3/7

Procedura di colorazione Note sulla procedura Prima dell uso, l operatore deve leggere attentamente le seguenti istruzioni per familiarizzare bene con tutti i componenti. I reagenti e le istruzioni fornite sono state studiate per dare prestazioni ottimali. L ulteriore diluizione del reagente o la modifica dei tempi e delle temperature di incubazione possono portare a risultati errati. Tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20 25 C) prima dell immunocolorazione. Preferibilmente, tutte le fasi di incubazione dovrebbero essere eseguite a temperatura ambiente. Non lasciare andare a secchezza le sezioni tissutali durante la procedura di colorazione. Le sezioni tissutali essiccate possono aumentare il fenomeno di colorazione aspecifica. Coprire i vetrini esposti a correnti d aria. In caso di incubazioni prolungate, porre i tessuti in un ambiente umido. È possibile aumentare ulteriormente la sensibilità del sistema EnVision+ System, HRP, allungando i tempi di incubazione alle fasi 2 e 3 di 5 10 minuti. Protocollo di colorazione FASE 1 REAGENTE DI BLOCCO DELLA PEROSSIDASI Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Se si usa la carta bibula (come la carta di tessuto assorbente), asciugare accuratamente attorno al campione per rimuovere qualsiasi liquido rimanente e per mantenere i reagenti all interno dell area adibita. Applicare una quantità di perossido di idrogeno dal flacone 1 sufficiente per coprire il campione. Incubare per 5 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con acqua distillata o soluzione tampone da un flacone di lavaggio (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto) e porre in un bagno tamponato fresco. FASE 2 ANTICORPO PRIMARIO O REAGENTE DI CONTROLLO NEGATIVO Eliminare picchiettando il tampone in eccesso e asciugare i vetrini, come descritto precedentemente. Applicare una quantità di anticorpo primario adeguatamente diluito o di reagente di controllo negativo sufficiente per coprire il campione. Incubare per 30 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con la soluzione tampone di un flacone di lavaggio (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto) e porre in un bagno tamponato fresco. Se la procedura di colorazione deve essere interrotta, i vetrini possono essere mantenuti in un bagno tamponato dopo l incubazione con l anticorpo primario (fase 2) sino a un ora a temperatura ambiente (20 25 C), senza alterare il risultato della colorazion e. FASE 3 FASE 4 FASE 5 FASE 6 POLIMERO MARCATO CON PEROSSIDASI Eliminare picchiettando il tampone in eccesso e asciugare i vetrini, come descritto precedentemente. Applicare una quantità di polimero marcato dal flacone 2 sufficiente per coprire il campione. Incubare per 30 (±1) minuti. Sciacquare i vetrini, come nella fase 2. SUBSTRATO-CROMOGENO Asciugare i vetrini, come descritto precedentemente. Applicare una quantità di substrato-cromogeno sufficiente per coprire il campione. Incubare per 5 10 minuti. Sciacquare delicatamente con acqua distillata da un flacone di lavaggio (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto). Collect Raccogliere la soluzione substrato-cromogeno da eliminare in un contenitore per materiali pericolosi e smaltire in modo corretto. COLORANTE DI CONTRASTO EMATOSSILINA (opzionale) Immergere i vetrini in un bagno di ematossilina a base acquosa (codice S3309). La lunghezza dell incubazione dipende dalla forza dell ematossilina utilizzata. Sciacquare delicatamente in un bagno di acqua distillata. Immergere i vetrini 10 volte in un bagno di soluzione ammoniacale 0,037 mol/l o agenti che tingono di blu simili. Sciacquare delicatamente in un bagno di acqua distillata o deionizzata per 2 5 minuti. MONTAGGIO I campioni possono essere montati e coperti con un vetrino corpioggetto con un mezzo di montaggio acquoso, quali Glycergel Mounting Medium (codice C0563) o Faramount (codice S3025) oppure mezzi di montaggio permanenti non acquosi, Ultramount (codice S1964). I vetrini possono essere anche disidratati e montati permanentemente. (107940-004) 302063IT_003 p. 4/7

Controllo di qualità Eventuali modifiche al trattamento dei tessuti e alle procedure tecniche nel singolo laboratorio possono causare variazioni significative nei risultati, rendendo necessaria una performance regolare dei controlli interni in aggiunta alle procedure seguenti. Per ulteriori informazioni consultare le linee guida del controllo di qualità del programma College of American Pathologists (CAP) Certification per immunoistochimica e i riferimenti bibliografici 1 3. Fare riferimento alla scheda delle specifiche tecniche di ogni anticorpo primario utilizzato per i dettagli relativi alla sensibilità e all immunoreattività. Per ulteriori informazioni sui controlli positivo e negativo fare riferimento a Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica. Interpretazione della colorazione Limitazioni specifiche del prodotto Fare riferimento a Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica per le linee guida relative all interpretazione della colorazione. La colorazione del tessuto è dipendente dalla corretta manipolazione e dal trattamento del tessuto prima della colorazione. La fissazione incorretta, il congelamento, lo scongelamento, il lavaggio, la disidratazione, il riscaldamento, la sezione o la contaminazione con altri tessuti o fluidi possono produrre artefatti, bloccare l anticorpo o portare a risultati falsi negativi. L uso di fissativi non tamponati, vecchi o l esposizione dei tessuti a calore eccessivo (superiore a 60 C) durante il processamento può determinare una riduzione dell intensità della colorazione. L attività della perossidasi o della pseudo perossidasi endogena può essere osservata in emoproteine, quali emoglobina, mioglobina, citocromo e catalasi, come anche negli eosinofili. 4,5 Questa attività può essere inibita incubando i campioni con il reagente di blocco della perossidasi per 5 minuti, prima dell aggiunta dell anticorpo primario. Anche gli strisci di sangue e di midollo osseo e i tessuti congelati possono essere trattati con questo reagente. In ogni caso questa procedura non elimina il pigmento rossastro-marrone delle emoproteine. In alternativa può essere utilizzata una soluzione di perossido d idrogeno-metanolo, ma questa procedura denatura alcuni antigeni. I tessuti di individui con infezione da virus dell epatite B e che contengono l antigene di superficie dell epatite B (HbsAg) possono mostrare colorazione aspecifica con la perossidasi di rafano. 6 I sieri normali/non immuni dalla stessa fonte animale come gli antisieri secondari utilizzati nelle fasi di blocco possono dare risu.ltati falsi negativi o falsi positivi a causa degli autoanticorpi o degli anticorpi naturali. I reagenti forniti in questo kit devono essere diluiti in modo opportuno. Ulteriori diluizioni possono causare perdita di rilevazione antigenica. (107940-004) 302063IT_003 p. 5/7

Eventuali problemi e risoluzione Problema Causa probabile Azione suggerita 1. Colorazione assente su tutti i vetrini 1a. I reagenti non stati utilizzati nell ordine corretto. 1a. Rivedere l applicazione dei reagenti. 2. Colorazione debole di tutti i vetrini 3. Background eccessivo su tutti i vetrini 1b. Presenza di azide sodica nel bagno tamponato. 2a. Le sezioni hanno trattenuto troppa soluzione dopo il bagno di lavaggio. 2b. I vetrini non sono stati incubati il tempo necessario con gli anticorpi o la miscela del substrato. 3a. I campioni contengono un elevata attività della perossidasi endogena. 3b. La paraffina non è stata rimossa completamente. 3c. I vetrini non sono stati sciacquati a sufficienza. 3d. La reazione del substrato è stata più veloce del normale a causa dell eccessiva temperatura, ad esempio. 3e. Le sezioni si sono essiccate durante la procedura di colorazione. 3f. Si è verificato un legame aspecifico dei reagenti alle sezioni di tessuto 3g. L anticorpo era troppo concentrato. 1b. Utilizzare un tampone senza azide sodica preparato al momento. 2a. Eliminare delicatamente la soluzione in eccesso, prima di asciugare intorno alla sezione. 2b. Rivedere i tempi di incubazione raccomandati. 3a. Utilizzare un tempo di incubazione più lungo con il reagente di blocco della perossidasi, flacone 1. 3b. Utilizzare nuovi bagni di xilene o toluene. Se si colorano contemporaneamente diversi vetrini, il secondo bagno di xilene deve contenere xilene fresco. 3c. Utilizzare soluzioni fresche in bagni di lavaggio e flaconi di lavaggio. In alternativa usare TBST 0.05 mol/l Tris Buffer (codice S3306) contenente NaCl 0,3 mol/l e 0,1% Tween. 3d. Utilizzare tempi di incubazione più brevi con la soluzione substrato-cromogeno 3e. Utilizzare una camera umida. Asciugare solo 3 dei 4 vetrini alla volta, prima di applicare il reagente. 3f. Applicare una reazione di blocco che contiene una proteina estranea. 3g. Utilizzare la diluizione più alta dell anticorpo primario. NOTA: se il problema non può essere attribuito ad alcuna delle cause citate o se l azione correttiva suggerita non risolve il problema, contattare il Servizio tecnico della Dako per ulteriore assistenza. Ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla preparazione dei campioni possono essere trovate su Handbook -Immunochemical Staining Methods 7 (disponibile presso Dako), Atlas of Immunohistology 8 e Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 9 Riferimenti bibliografici 1. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. J Clin Pathol 1989;92:836-8. 2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 :4 3. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 4. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 5. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 6. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. J Clin Pathol 1980;73:626-8. 7. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 8. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 9. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Additional references Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 5 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 5 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 5 (107940-004) 302063IT_003 p. 6/7

Edition 11/12 (107940-004) 302063IT_003 p. 7/7