Penetrazione dei virus nelle cellule La replicazione dei virus (dal virus parentale ai virus della progenie) scaricato da www.sunhope.it 1
Prerequisito indispensabile: Essendo PARASSITI ENDOCELLULARI OBBLIGATI i virus devono: trovare entrare in contatto (aderire) penetrare in una cellula ospite dentro la quale si possa svolgere il loro ciclo replicativo La replicazione di un virus si può dividere in diverse fasi: Attacco del virus alla cellula Penetrazione del virus nella cellula Queste fasi sono le più restrittive, ma non le uniche ad essere condizionanti l esito dell infezione Replicazione del genoma virale Assemblaggio delle neo-particelle Maturazione e rilascio dei virus neoformati scaricato da www.sunhope.it 2
La replicazione dei virus Moltiplicazione dei virus Le conoscenze di base che si susseguono nelle singole cellule durante un ciclo di moltiplicazione virale sono derivate da studi di curve di crescita one step di preparazioni virali in colture di cellule. In questo modello le varie fasi del ciclo replicativo virale vengono sincronizzate infettando le cellule delle colture simultaneamente e ad una alta molteplicità di infezione. Tempo dopo l infezione scaricato da www.sunhope.it 3
Replicazione virale: diagramma schematico pfu/ml Ore post-infezione Adsorbimento e penetrazione Eclisse Maturazione Rilascio Periodo di eclissi: piccole quantità di virus parentale sono presenti. I virus sono scomposti nei vari costituenti (uncoating) per liberare il genoma virale. La replicazione del genoma è iniziata. Durata, minuti-hrs. Replicazione virale: diagramma schematico pfu/ml Ore post-infezione Adsorbimento e penetrazione Eclisse Maturazione Rilascio Periodo di maturazione:il materiale virale si accumula nelle cellule e nell ambiente extracellulare. Le cellule infettate con virus citocidi si disorganizzano e muoiono, la produzione virale si interrompe. Il titolo virale, lentamente, decresce. Le cellule infettate con virus non citocidi possono continuare a produrre particelle virali indefinitamente. scaricato da www.sunhope.it 4
Replicazione virale: diagramma schematico Virus totale pfu/ml Virus intracellulare Virus extracellulare Ore post-infezione Adsorbimento e penetrazione Eclisse Maturazione Rilascio Un ciclo riproduttivo dura meno di un ora nel caso di vari batteriofagi, 6-8hrs nel caso di picornaviridae e più di 40 hrs nel caso di herpesviridae. Cellule infettate con poliovirus, possono portare alla produzione di più di 100000 copie di virus per cellula infetta. Replicazione virale Un infezione può essere: produttiva, i.e. penetrazione in cellule permissive seguita dalla produzione di una progenie virale. abortiva, i.e. penetrazione in cellule non permissive che non porta alla produzione di una progenie virale. Possono esserci una serie di motivi che rendono una cellula non permissiva, e.g. l infezione ha inizio ma si interrompe in una fase successiva: espressione del genoma virale, maturazione, liberazione. restrittiva, una cellula è permissiva al virus solo transitoriamente, quindi poche particelle virali vengono prodotte. La produzione della progenie virale si interrompe, ma il genoma rimane nelle cellule, esempi includono il virus di Epstein Barr e l herpes simplex virus. Questo tipo di infezione può avere conseguenze gravi, e.g trasformazione cellulare. scaricato da www.sunhope.it 5
Replicazione virale Una proteina presente sul virione (anti-recettore) si lega al recettore sulla superficie della cellula. Alcuni virus possono avere più di un anti-recettore. I recettori cellulari sono spesso delle glicoproteine. L espressione (oppure l assenza) dei recettori sulla superficie delle cellule determinano il tropismo dei virus, i.e. i recetori rendono la cellula permissiva o meno alla replicazione virale. A t t a c c o recettore (cellulare) recettore (virale) L attacco del virus consiste nel riconoscimento specifico tra il recettore virale e il recettore cellulare. Le molecole recettoriali possono essere: A) Proteine (di solito glicoproteine) recettori specifici B) Residui di carboidrati recettori meno specifici (presenti su glicoproteine o glicolipidi) (la stessa configurazione di catene laterali si può ritrovare su differenti molecole glicosilate delle membrane) Alcuni virus complessi usano più di un recettore e, quindi, hanno vie alternative di ingresso dentro le cellule. scaricato da www.sunhope.it 6
Adesione L adesione è un processo energia indipendente. L uptake (cioè l insieme dei processi che porta alla penetrazione del cappside nella cellula) è invece dipendente dall energia. Un fattore che accomuna tutti i recettori virali: Sono molecole di superficie le cui funzioni fisiologiche vengono sovvertite dai virus. scaricato da www.sunhope.it 7
Strategie sperimentali per l identificazione di geni cellulari che codificano per recettori virali Recettori e corecettori costituiti da proteine scaricato da www.sunhope.it 8
Recettori costituiti da carboidrati Recettori cellulari per i picornavirus Diagramma schematico per le proteine cellulari che funzionano come recettori per i diversi picornavirus. Nella figura sono indicati i diversi domini: Ig-like, short consensus repeat-like (SCR-like), low-density lipoprotein-like (LDL-like), threonine/serine/proline (T/S/P). Car = coxackievirus and adenovirus receptor Vcam-1 = vascular cell adhesion molecule 1 Ldlr = low-density lipoprotein receptor scaricato da www.sunhope.it 9
Poliovirus/Rhinovirus (Picornaviridae) Il legame avviene sul fondo di cosiddetti canyon (depressioni alla superficie del virus ) Zone a sequenza costante perchè non risentono della pressione selettiva del sistema immunitario, vista la loro difficile accessibilità Receptor, antibody, and drug binding to the picornavirus capsid scaricato da www.sunhope.it 10
Corecettori Alcuni virus usano un processo a due step per aderire e penetrare Step 1: adesione a bassa affinità del virus ad un primo recettore. Questo porta il virus in contatto con il secondo recettore (corecettore) Step 2: Il recettore secondario promuove un legame più forte tra virus e cellula e la fusione delle due membrane uno dei modi di penetrazione dei virus all interno delle cellule alle quali hanno aderito scaricato da www.sunhope.it 11
Corecettori Interazione dell HIV-1 con CD4 scaricato da www.sunhope.it 12
Sialic acid receptors for influenza viruses Close-up del sito di legame con una molecola di acido sialico Struttura del monomero dell HA dell influenza virus e dettagli del sito di legame con il recettore Le subunità HA1 (blu) e HA2 (rosso) sone tenute insieme da ponti disolfuro e da legami non-covalenti scaricato da www.sunhope.it 13
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Cosa avviene dopo l adsorbimento del virus sulle cellule? scaricato da www.sunhope.it 15
2) Penetrazione nella cellula ospite Endocitosi esterna interna Fusione esterna interna Meccanismi per l uptake di macromolecole dall ambiente extracellulare scaricato da www.sunhope.it 16
Endocitosi recettore-mediata Ruolo dell endocitosi nella penetrazione dei virus Gli endosomi sono normalmente utilizzati dalla cellula per l uptake di nutrienti e fattori di crescita I virus dirottano i pathway cellulari La caratteristica principale degli endosomi è la loro progressiva acidificazione i scaricato da www.sunhope.it 17
Penetrazione dei virus Penetrazione dei virus Fusione sulla membrana plasmatica Endocitosi Influenza, togavirus rabdhovirus scaricato da www.sunhope.it 18
Alcuni virus senza pericapside non fondono Possono o meno essere endocitati ma Inducono la Formazione di pori (es: Picornavirus ) Adenovirus cell entry La penetrazione avviene mediante endocitosi in vescicole ricoperte di clatrina. Invece di formare pori, l adenovirus, rompe o lisa la cellula. Lo stimolo è rappresentato dal bassi ph. Il virus viene tagliato proteoliticamente mediante proteasi codificate dal virus. scaricato da www.sunhope.it 19
Meccanismo di penetrazione dei Reovirus scaricato da www.sunhope.it 20
Ruolo dell endocitosi nella penetrazione dei virus È uno dei meccanismi più diffusi per permettere ai virus di invadere le cellule Non richiede nessuna proteina virale specifica (tranne quelle già utilizzate per legare i recettori cellulari), ma avviene per formazione normale ed internalizzazione di vescicole sulla membrana delle cellule scaricato da www.sunhope.it 21
La fusione è necessaria per la maggior parte dei virus con envelope La fusione può avvenire sulla membrana citoplasmatica ( fusione in esterno) oppure in vescicole endocitiche (fusione in interno) La fusione richiede la presenza di specifiche proteine virali, che promuovono l unione tra le membrane cellulari e virali Evidenza dei penetrazione virale al microscopio elettronico scaricato da www.sunhope.it 22
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Proteine virali specifiche di fusione Le proteine di fusione di I tipo sono le più comuni e conosciute e sono presenti su molti virus (Es: Influenza, VSV, Retrovirus) scaricato da www.sunhope.it 24
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Misura dell idrofobicità delle proteine E1 del SFV e F1 del Sendai virus. FP = Peptide di fusione TM = Dominio transmembrana Kyte-Doolittle Hydropathy index (linea sottile) Wimley-White interfacial hydrophobicity (linea doppia) scaricato da www.sunhope.it 26
Diagramma schematico delle proteine di fusione OUT IN Orthomyxovirus NH 2 HR1 HR2 COOH N-terminal fusion peptide HR1 NH 2 N-terminal Internal fusion peptide fusion peptide Paramyxovirus HR2 COOH Viral envelope Six-helix bundle scaricato da www.sunhope.it 27
Low-pH-induced structural changes in the influenza virus HA Proteine di fusione virali HA TM TM F Gp2 scaricato da www.sunhope.it 28
Proteine di fusione di classe I Paramyxovirus, orthomyxovirus, retrovirus, filovirus, rhabdovirus Caratteristiche principali: sono composte da tre sub-unità identiche generalmente prodotte a partire da un precursore la sub-unità con dominio TM, presenta anche il peptide di fusione presenza di due heptad repeats, che si dispongono a formare dei coiled-coil scaricato da www.sunhope.it 29
Class 1 HA from influenza gp120 from HIV F proteins from paramyxoviruses Gp2 from Ebola virus Class 2 E proteins from TBE E proteins from dengue virus E1 protein from Semliki Forest virus Proteine di fusione di classe II Flavivirus, alphavirus, togavirus Caratteristiche principali: presenza di pochissime eliche, ma elevata presenza di foglietti β le proteine sono distese sulla superficie del virus presenza di peptidi di fusione interni scaricato da www.sunhope.it 30
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Influenza HA Influenza virus HA ph neutro ph acido scaricato da www.sunhope.it 32
Penetrazione del virus dell influenza Penetrazione dei paramyxoviruses Modelli per la fusione di membrana indotta dalla proteina F Modello del ruolo del recettore per le chemiochine nella fusione di membrana indotta dell HIV-1 scaricato da www.sunhope.it 33
Fusione di membrana mediata da HIV Fusione di membrana mediata da HIV scaricato da www.sunhope.it 34
Fusione mediata dal virus Ebola Ruolo del peptide di fusione nel portare a compimento la fusione tra due membrane biologiche scaricato da www.sunhope.it 35
Fusione di membrana a) Avvicinamento delle due membrane b) Perturbazione dei lipidi dei foglietti esterni c) Emifusione d) Formazione del poro di fusione EMIFUSIONE scaricato da www.sunhope.it 36
Quattro differenti modelli di fusione di membrana mediata da proteine a) Pori di fusione proteici: si forma una struttura proteica che apre un vero e proprio canale nella membrana. In seguito le proteine si dissociano con infiltrazione di lipidi e completa fusione b) Nel modello detto a cancellata sono i lipidi a svolgere la maggior parte del lavoro, con le proteine che si dispongono come una cancellata per formare una sorta di anello. Anche in questo caso dopo la formazione del poro di fusione i complessi proteici si dissociano (a) (b) (c) (d) c) In questo modello, sono sempre i lipidi i protagonisti principali, ma le proteine intervengono in modo attivo per forzare le due membrane ad entrare in contatto e superare le forze repulsive. d) Molti peptidi anfifilici sono in grado di indurre la fusione di membrana, anche se il meccanismo resto poco chiaro. Probabilmente causano una perturbazione locale del bilayer, in modo da superare le barriere energetiche di attivazione Meccanismi di penetrazione dei virus e diversa sede di replicazione scaricato da www.sunhope.it 37
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