Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx

Ottobre 2004 Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 1152 Il sistema BioRobot MDx DSP è un sistema generico che si avvale della tecnologia QIAamp per l isolamento e la purificazione in automatico degli acidi nucleici virali da campioni umani di plasma o siero per analisi diagnostiche in vitro. Per uso diagnostico in vitro 61762 1027740IT 10/2004 QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden Tel: +49-2103-29-0 WWW.QIAGEN.COM

Marchi: QIAGEN, QIAamp, BioRobot (QIAGEN Group); AMPLICOR, COBAS (Roche Molecular Systems, Inc., concesso in licenza a Roche Diagnostic Systems, Inc.); BD Falcon, BD PPT, BD Vacutainer, (Becton, Dickinson and Company); CryoTube (Nalge Nunc International); LCx (Abbott Laboratories); MONITOR, TaqMan (Roche Group); Monovette (Sarstedt AG & Co.); Nalgene (Nalge Corp.); Vacuette (C.A. Greiner & Söhne GmbH). Il processo PCR è protetto dai brevetti USA 4,683,195 e 4,683,202 e dai rispettivi equivalenti degli altri Paesi, di proprietà di Hoffmann-La Roche AG. 2004 QIAGEN, tutti i diritti riservati.

Sommario Contenuto del kit 4 Simboli 5 Conservazione 6 Controllo di qualità 6 Uso previsto 6 Limiti all utilizzo del prodotto 7 Informazioni di sicurezza 7 Introduzione 9 Principio e procedura 10 Caratteristiche di prestazione del sistema BioRobot MDx DSP 14 Strumenti e reagenti forniti dall operatore 24 Note importanti 25 Punti generali importanti 25 Preparazione dell RNA 26 Conservazione dei campioni 26 Preparazione di reagenti e tamponi 26 Preparazione degli oggetti in plastica 30 Preparazione dei contenitori grandi di liquido 31 Eluizione di acidi nucleici virali 31 Resa e qualità degli acidi nucleici virali 32 Impostazione della stazione di lavoro BioRobot MDx 32 Pulizia della stazione di lavoro BioRobot MDx 32 Protocollo Isolamento e purificazione in automatico degli acidi nucleici virali da plasma e siero 36 Appendice A: messaggi visualizzati 41 Appendice B: file dei risultati 61 Appendice C: calcolo della quantità di controllo interno 63 Distributori QIAGEN 66 Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 3

Contenuto del kit Kit QIAamp DSP 96 Virus MDx Numero di catalogo 61762 Numero preparazioni 1152 Kit principale QIAamp DSP 96 Virus MDx 1 scatola QIAamp 96 Piastra QIAamp 96 12 CARRIER RNA carrier (tappo rosso) 12 x 1350 μg QP Proteasi QIAGEN * 12 fiale PS Solvente della proteasi 12 x 6 ml AL Tampone di lisi 12 x 33 ml AW1 Tampone di lavaggio 1 (concentrato) AW2 Tampone di lavaggio 2 (concentrato) AVE Tampone di eluizione (tappo viola) 4 x 151 ml 4 x 127 ml 108 x 2 ml TOPE Fluido di eluizione (tappo arancione) 48 x 1,4 ml Q-Card 1 Manuale 1 Materiali in plastica QIAamp DSP 96 Virus MDx 1 scatola SB S-Block 12 CAP Tappi per strisce 3 x 55 EMT Microprovette di eluizione CL 12 DT Recipiente monouso 3 x 10 BOT Flacone di etanolo 1 * Volume di risospensione: 6 ml. Contiene idrocloruro di guanidina. Vedere pagina 7 per le informazioni di sicurezza. Contiene sodio azide come conservante. Non smaltire la Q-Card. Le informazioni contenute nel codice a barre sulla Q-Card sono necessarie per avviare il sistema BioRobot MDx DSP. 4 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Simboli <N> Il contenuto è sufficiente per <N> test Fare riferimento alle informazioni riportate nel manuale Da utilizzarsi entro Dispositivo medico per diagnostica in vitro Numero di catalogo Numero di lotto Numero di materiale Componenti Numero Volume Limiti di temperatura Produttore autorizzato Nota importante Trascrivere la data corrente dopo aver aggiunto etanolo al flacone Aggiunta Contiene Etanolo puro Idrocloruro di guanidina Liofilizzato Ricostituire in Subtilisina Da utilizzarsi esclusivamente con Porta a Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 5

Conservazione Il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx deve essere conservato alla temperatura indicata sull etichetta del kit stesso. La data di scadenza del kit è stampata sulla Q-Card e sull etichetta del kit ed è valida solo se il kit è conservato alla temperatura indicata sull etichetta. L RNA carrier può essere disciolto soltanto nel tampone di eluizione (AVE); l RNA carrier disciolto deve essere aggiunto immediatamente al tampone di lisi (AL), come descritto a pagina 27. Questa soluzione deve essere preparata al momento e rimane stabile per diverse ore se conservata a 2 8 C. La QIAGEN proteasi (QP) ricostituita è stabile fino a un anno se conservata a 2 8 C, ma comunque non oltre la data di scadenza del kit. Il tampone di lavaggio 1 (AW1) e il tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituiti sono stabili per un anno se conservati a temperatura ambiente (15 25 C), ma comunque non oltre la data di scadenza del kit. Controllo di qualità In conformità al sistema certificato di QIAGEN per la gestione della qualità totale, ogni lotto del kit QIAamp DSP 96 Virus MDx viene testato in rapporto a specifiche prestabilite, per garantire la costante qualità del prodotto. Uso previsto Il sistema BioRobot MDx DSP è un sistema generico che si avvale della tecnologia QIAamp per l isolamento e la purificazione in automatico degli acidi nucleici virali da campioni umani di plasma o siero per analisi diagnostiche in vitro. Il sistema BioRobot MDx DSP è progettato per essere usato esclusivamente come un sistema chiuso. Il sistema è composto dalla stazione di lavoro BioRobot MDx, dagli armadietti del laboratorio e degli accessori, da un computer con il software QIAsoft MDx DSP e il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx e dal kit QIAamp DSP 96 Virus MDx. Il sistema BioRobot MDx DSP è concepito per l uso da parte di personale professionista, come tecnici e medici esperti nelle tecniche di biologia molecolare. Qualsiasi risultato diagnostico in vitro generato tramite la procedura di preparazione del campione, in combinazione con un qualunque test diagnostico in vitro di analisi degli acidi nucleici (NAT) downstream, deve essere interpretato in un quadro più ampio che tenga conto di eventuali altri riscontri clinici o di laboratorio. 6 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Per ridurre al minimo il rischio di un impatto negativo sui risultati diagnostici in vitro, all utente sono fornite informazioni per l utilizzo di un controllo interno durante i processi di preparazione, amplificazione e rilevamento del campione, conformemente al test downstream in uso, al fine di controllare eventuali irregolarità. Limiti all utilizzo del prodotto Il sistema BioRobot MDx DSP non deve essere utilizzato per l isolamento e la purificazione dell RNA e del DNA da campioni di sangue intero, tessuto, midollo spinale e cellule in coltura umani. Inoltre, non deve essere impiegato per isolare e purificare acidi nucleici di origine batterica, di funghi o parassiti. Non sono state determinate le prestazioni del prodotto per campioni di liquido cerebrospinale, urina e sospensioni fecali. Informazioni di sicurezza Quando si utilizzano sostanze chimiche, indossare sempre un adeguato camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali di protezione. Per ulteriori informazioni, consultare le appropriate schede di sicurezza (MSDS). Le schede MSDS, nel pratico e compatto formato PDF, sono disponibili online all indirizzo www.qiagen.com/ts/msds.asp. Qui è possibile trovare, visualizzare e stampare la scheda MSDS per ciascun kit QIAGEN e i relativi componenti. ATTENZIONE: NON aggiungere candeggina o soluzioni acide direttamente alle preparazioni di campione da eliminare. Il tampone di lisi (AL) e il tampone di lavaggio 1 (AW1) contengono idrocloruro di guanidina, che può formare composti altamente reattivi in combinazione con la candeggina. Nel caso in cui si rovesciassero dei liquidi contenenti questi tamponi, pulire con acqua e detergente idoneo per l uso in laboratorio. Se il liquido rovesciato contiene agenti potenzialmente infetti, pulire l area interessata con acqua e detergente da laboratorio, quindi con una soluzione di ipoclorito di sodio all 1% (v/v). Se i flaconi di tampone sono danneggiati o si riscontrano perdite, indossare guanti e occhiali di protezione per l operazione di smaltimento, onde evitare lesioni personali a sé o ad altri. QIAGEN non ha testato i liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx per la presenza di materiali infetti residui. La contaminazione dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è altamente improbabile, ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i liquidi di scarico devono essere considerati infetti e vanno smaltiti in conformità alle normative di sicurezza locali vigenti in materia. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 7

Ai componenti del kit QIAamp DSP 96 Virus MDx sono associate le seguenti frasi di rischio e consigli di prudenza. Tampone di lisi (AL) e tampone di lavaggio 1 (AW1) Xn Contengono idrocloruro di guanidina: pericoloso, irritante. Frasi di rischio e consigli di prudenza:* R22-36/38, S13-26-36-46 Proteasi QIAGEN (QP) Xn Contiene subtilisina (proveniente da Bacillus subtilis): sensibilizzante, irritante. Frasi di rischio e consigli di prudenza:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46 Informazioni di emergenza 24 ore su 24 È possibile ottenere informazioni mediche di emergenza in inglese, francese e tedesco, 24 ore su 24, presso: Centro di informazioni antiveleni, Mainz, Germania. Tel: +49-6131-19240 * R22: nocivo per ingestione; R36/38: irritante per gli occhi e la pelle; R37/38: irritante per le vie respiratorie e la pelle; R41: rischio di gravi lesioni oculari; R42: può provocare sensibilizzazione per inalazione; S13: conservare lontano da cibi, bevande e alimenti per animali; S22: non respirare le polveri; S24: evitare il contatto con la pelle; S26: in caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico; S36: usare indumenti protettivi adeguati; S36/37/39: usare indumenti protettivi, guanti e dispositivi di protezione per gli occhi e il viso adeguati; S46: in caso di ingestione consultare immediatamente un medico e mostrargli il contenitore o l etichetta. 8 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Introduzione Il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx si avvale di una tecnologia consolidata per isolare e purificare simultaneamente il DNA e l RNA virale da un ampia gamma di virus. Il kit combina le proprietà di legame selettivo di una membrana alla silice con un formato a 96 pozzetti ad alta velocità di elaborazione ed è progettato per l elaborazione simultanea e completamente computerizzata di 96 campioni sul sistema BioRobot MDx DSP. Il processo completamente computerizzato, che comprende la lettura del codice a barre, il controllo del caricamento, il monitoraggio dei campioni e la documentazione completa del processo, richiede un massimo di 2,5 ore per elaborare 96 campioni, senza alcun intervento da parte dell utente. La manipolazione manuale di campioni potenzialmente infetti è ridotta, assicurando la sicurezza per l utente nonché un elaborazione affidabile dei campioni. Il tempo di elaborazione tra analisi consecutive è di circa 25 minuti per la preparazione dei reagenti e per l avvio della stazione di lavoro BioRobot MDx DSP, più 15 minuti per la pulizia degli strumenti. La procedura è idonea per campioni di plasma e siero, contenenti citrato o EDTA. I campioni di plasma che contengono eparina non devono essere utilizzati, poiché questo anticoagulante può interferire con i test diagnostici downstream eseguiti in un secondo tempo, come la reazione di polimerizzazione a catena. I campioni possono essere prelevati di recente, liofilizzati o congelati, purché non siano stati congelati e scongelati più volte. Gli acidi nucleici virali vengono eluiti nel tampone di eluizione (AVE) e sono pronti per essere utilizzati in reazioni di amplificazione. Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx consente di scegliere tra due procedure di lavaggio diverse. Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx standard utilizza procedure di lavaggio con tampone di lavaggio 2 (AW2) ed etanolo (EtOH). Il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) fornisce una procedura di lavaggio più rigida, eseguita con entrambi i tamponi di lavaggio (AW1 e AW2) ed etanolo (EtOH). In questo modo, si gode della flessibilità di scegliere la purezza desiderata per le analisi downstream da eseguire in un secondo tempo. L utente deve convalidare il protocollo che meglio si adatta a un test specifico, seguendo le linee guida della International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) in ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and terminology e ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology. Entrambi i protocolli possono essere eseguiti sullo stesso sistema BioRobot MDx DSP, secondo le necessità. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 9

Principio e procedura La procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx prevede 6 fasi: installazione guidata da un software del sistema BioRobot MDx, compresa la lettura dei codici a barre dei campioni; la lisi delle particelle del virus nel campione; il legame degli acidi nucleici virali presenti nei lisati alle membrane di una piastra QIAamp 96; il lavaggio degli acidi nucleici virali legati alle membrane; l eluizione degli acidi nucleici virali dalle membrane; la creazione di un file di risultati. Volume del campione Il sistema BioRobot MDx DSP è in grado di rimuovere un volume di campione di 265 μl da provette primarie e secondarie di diverse grandezze, come le provette CryoTube o BD Vacutainer, che contengono un volume di campione minimo di 500 μl. Le tabelle 1 3 (pagine 10 11) elencano le provette compatibili con i diversi portaprovette del BioRobot MDx DSP. L uso del BioRobot MDx DSP non è limitato a queste provette. Se l utente preferisce utilizzare altre provette, il tecnico specializzato per lo strumento QIAGEN le testerà durante l installazione del BioRobot MDx DSP. Nota: le provette con dimensioni identiche possono essere disponibili con diversi numeri di catalogo, ma con anticoagulanti diversi. Tabella 1. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 15 mm (contiene provette con diametro interno di 14 16 mm) Produttore/ marchio Volume Altezza Forma provetta Distributore N. cat.* BD Falcon 14 ml 96 mm Rotonda BD 352051 BD Vacutainer 10 ml 100 mm Rotonda BD 368430/ 366457 VENOJECT II 10 ml 100 mm Rotonda Terumo VP-100 SHL * I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore. 10 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Tabella 2. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 12 mm (contiene provette con diametro interno di 11 13 mm) Produttore/ marchio Volume Altezza Forma provetta Distributore N. cat. Sarstedt 7 ml 81 mm Rotonda Sarstedt 60550109 VENOJECT II 5 ml 78 mm Rotonda Terumo VP-050 SDK I numeri di catalogo sono soggetti a cambiamento; verificare con il produttore o con il fornitore. Tabella 3. Provette compatibili per portaprovette, STS MDx, 9 mm (contiene provette con diametro interno di 8 10 mm) Produttore/ marchio Volume Altezza Forma provetta Distributore N. cat.* BD Falcon 5 ml 75 mm Rotonda BD 352063 KABE EDTA 5 ml 75 mm Rotonda KABE 53101 NALGENE 2 ml 45 mm Fiala criogenica Nalge 5000-0120 NUNC 1,8 ml 40 mm Rotonda Nunc 363401 NUNC 3,6 ml 60 mm Rotonda Nunc 366524 NUNC 4,5 ml 80 mm Rotonda Nunc 363452 Sarstedt 2 ml 45 mm Conica Sarstedt 72693005 Sarstedt 5 ml 75 mm Rotonda Sarstedt 62526028 BD Vacutainer 6 ml 75 mm Rotonda BD 367815 * I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore. Lisi delle particelle virali I campioni vengono lisati in condizioni denaturanti a temperature elevate. La lisi viene eseguita in presenza di proteasi QIAGEN (QP) e di tampone di lisi (AL), che insieme assicurano l inattivazione delle RNasi. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 11

Legame degli acidi nucleici alle membrane della piastra QIAamp 96 Per ottimizzare il legame di DNA e RNA virale con le membrane della piastra QIAamp 96, si aggiunge etanolo ai lisati. Successivamente si applica il lisato a un pozzetto della piastra QIAamp 96 e gli acidi nucleici virali, al passaggio dei lisati, vengono assorbiti sulla membrana in gel di silice per effetto della pressione indotta dal vuoto. Rimozione dei residui contaminanti Mentre gli acidi nucleici virali rimangono legati alle membrane della piastra QIAamp 96, nel protocollo standard QIAamp DSP 96 Virus MDx i contaminanti vengono rimossi efficacemente dal lavaggio eseguito mediante tampone di lavaggio 2 (AW2) e infine etanolo (EtOH). In alternativa, il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) fornisce una procedura di lavaggio più rigida. Questo protocollo differisce dal protocollo standard per l aggiunta di un passaggio di lavaggio con il tampone di lavaggio 1 (AW1) prima del lavaggio con il tampone di lavaggio 2 (AW2) e infine con etanolo (EtOH). Eluizione di acidi nucleici puri Gli acidi nucleici virali vengono eluiti dalle membrane della piastra QIAamp 96 aggiungendo il tampone di eluizione (AVE). L eluato dell acido nucleico può corrispondere anche al 50% del volume di reazione, a seconda del test downstream da eseguire successivamente, senza causare alcun effetto inibitore. 12 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) QIAsoft MDx DSP Setup guidato del tavolo di lavoro QIAsoft MDx DSP Setup guidato del tavolo di lavoro Controllo caricamento Esegui scansione codici a barre dei campioni Controllo caricamento Esegui scansione codici a barre dei campioni Aliquotare i campioni di trasferimento QP e aggiungere RNA carrier contenente AL e controllo interno Aliquotare i campioni di trasferimento QP e aggiungere RNA carrier contenente AL e controllo interno Lisi del campione Lisi del campione Aggiungere etanolo Aggiungere etanolo Trasferire lisati Trasferire lisati Legare acidi nucleici Vuoto Legare acidi nucleici Vuoto Lavare con AW1 Vuoto Lavare con AW2 Lavare con AW2 Vuoto Vuoto Lavare con etanolo Lavare con etanolo Vuoto Vuoto Piastra QIAamp 96 asciutta Piastra QIAamp 96 asciutta Vuoto Riscaldamento Vuoto Riscaldamento Aggiungere AVE e TOPE Aggiungere AVE e TOPE Vuoto Eluire acidi nucleici Vuoto Eluire acidi nucleici Acidi nucleici virali purificati in EMT Acidi nucleici virali purificati in EMT Creare file di risultati Creare file di risultati Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 13

Caratteristiche di prestazione del sistema BioRobot MDx DSP Range lineare Il range lineare di entrambi i protocolli QIAamp DSP 96 Virus è stato valutato per i virus HIV, HCV RNA e HBV DNA. I test stati eseguiti con diluizioni di pannelli di virus calibrati realizzati in plasma umano negativo a HIV, HBV e HCV. La quantificazione dei pannelli dei virus HIV e HBV è stata eseguita utilizzando gli standard internazionali dell Organizzazione Mondiale della Sanità 97/656 e 97/746, rispettivamente, come materiale di riferimento. Un pannello di virus calibrato disponibile in commercio di AcroMetrix è stato utilizzato per la serie di diluizione dell HCV. Le serie di diluizione con 7 titoli di virus diversi sono state testate con 24 replicati per ogni serie. Il range lineare della procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato per i virus HIV, HCV RNA e HBV DNA in diversi test diagnostici successivi (Tabella 4, Figure 1 3). Il calcolo dei titoli (conversione da cp a valori in UI) è stato eseguito seguendo le specifiche del produttore corrispondente del test downstream corrispondente (Tabella 4). Tabella 4. Test diagnostici downstream utilizzati per la determinazione del range lineare delle rese con i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx Virus Test downstream HIV Analisi quantitativa LCx HIV RNA (ABBOTT Laboratories) Manuale test utilizzato Fattore di conversione 12/2003 1 UI = 0,1412 cp HBV Test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR (Roche Diagnostics GmbH) 7/2003, Revisione 1.0 1 UI = 5,26 cp HCV Test COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics GmbH) 9/2003 1 UI = 1 cp 14 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Range lineare di rese utilizzando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx HIV A Risultato (in UI/ml) 8 7 6 5 4 3 2 y = 0,8867x + 0,3878 R 2 = 0,9972 2 3 4 5 6 7 8 Input (in UI/ml) B Risultato (in UI/ml) 8 7 6 5 4 3 2 y = 0,8838x + 0,3818 R 2 = 0,9976 2 3 4 5 6 7 8 Input (in UI/ml) Figura 1. Il range lineare dei protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato utilizzando: A) l analisi quantitativa LCx HIV RNA con il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) e B) il protocollo standard QIAamp DSP 96 Virus MDx. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 0,1412 cp). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 15

Range lineare di rese utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx HCV Risultato (in UI/ml) 7 6 5 4 3 2 1 y = 0,9054x + 0,3011 R 2 = 0,9982 1 2 3 4 5 6 7 Input (in UI/ml) Figura 2. Il range lineare del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx è stato determinato utilizzando il test COBAS TaqMan HCV. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 1 cp). Range lineare di rese utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) HBV 5 Risultato (in UI/ml) 4 3 2 1 y = 1,0577x 0,5599 R 2 = 0,9987 0 0 1 2 3 4 5 Input (in UI/ml) Figura 3. Il range lineare del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) è stato determinato utilizzando il test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 5,26 cp). 16 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Precisione I coefficienti di variazione (CV) sono stati determinati per le serie di diluizione dell HIV, dell HCV e dell HBV nel range lineare del test successivo appropriato. Per l analisi di precisione, sono stati utilizzati gli stessi test downstream, le stesse serie di diluizione e gli stessi insiemi di dati utilizzati per la determinazione del range lineare. Il calcolo dei titoli (conversione da cp a valori in UI) è stato eseguito seguendo le specifiche del produttore corrispondente del test downstream (vedere Tabella 4, pagina 14). I dati intra-esecuzione, interesecuzione e di precisione totali sono mostrati nel coefficiente di variazione percentuale (%CV) nelle Tabelle 5 8. Tabella 5. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) nell analisi quantitativa LCx HIV RNA Media titolo (UI/ml) Precisione intraesecuzione (%CV) Precisione interesecuzione (%CV) Precisione totale (%CV) 8,01 x 10 6 9,38 5,03 10,64 2,86 x 10 6 13,62 0,00 13,62 2,63 x 10 5 25,09 10,28 27,11 5,09 x 10 4 11,38 5,50 12,63 7,00 x 10 3 19,93 15,77 25,41 3,71 x 10 3 32,41 0,00 32,41 1,44 x 10 3 78,10 0,00 78,10 Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 17

Tabella 6. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx nell analisi quantitativa LCx HIV RNA Media titolo (UI/ml) Precisione intraesecuzione (%CV) Precisione interesecuzione (%CV) Precisione totale (%CV) 7,49 x 10 6 14,37 3,89 14,89 2,74 x 10 6 11,06 5,47 12,34 2,61 x 10 5 12,45 0,00 12,45 4,71 x 10 4 12,92 0,00 12,92 5,64 x 10 3 26,98 0,00 26,98 3,69 x 10 3 45,35 0,00 45,35 1,56 x 10 3 74,41 11,40 75,28 Tabella 7. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx nel test COBAS TaqMan HCV Media titolo (UI/ml) Precisione intraesecuzione (%CV) Precisione interesecuzione (%CV) Precisione totale (%CV) 5,92 x 10 5 10,31 11,05 15,12 6,01 x 10 4 16,24 4,09 16,75 7,47 x 10 3 16,46 8,62 18,58 1,16 x 10 3 17,73 0,00 17,73 6,13 x 10 2 25,15 0,00 25,15 2,74 x 10 2 35,74 28,56 45,75 1,07 x 10 2 39,97 0,00 39,97 18 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Tabella 8. Precisione del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) nel test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Media titolo (UI/ml) Precisione intraesecuzione (%CV) Precisione interesecuzione (%CV) Precisione totale (%CV) 8,30 x 10 3 11,24 23,79 26,31 2,85 x 10 3 24,52 24,91 34,95 8,04 x 10 2 19,08 25,84 32,12 2,39 x 10 2 20,51 24,98 32,32 7,77 x 10 1 15,02 25,28 29,40 1,71 x 10 1 53,02 0,00 53,02 6,34 x 10 0 47,56 48,59 67,99 Limite di rilevamento Il limite di rilevamento è stato determinato dal valore di probit al 95% per entrambi i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx utilizzando rispettivamente gli standard internazionali sui virus HIV e HBV dell OMS 97/656 e 97/746. Il limite di rilevamento è stato determinato elaborando le serie di diluizione dei virus appropriati (standard internazionali OMS sui virus in plasma umano negativo a HIV e HBV con citrato). Ogni passaggio di diluizione è stato testato in 3 esecuzioni sul sistema BioRobot MDx DSP, con 36 replicati per diluizione. Per il rilevamento di RNA HIV è stato utilizzando un test RT-PCR real-time interno. Il DNA dell HBV è stato analizzando utilizzando un metodo PCR interno endpoint seguito da elettroforesi del gel dell agarosi. Gli ampliconi della dimensione attesa sono stati contati come risultati. I dati combinati per tutti i campioni sono stati valutati utilizzando analisi di probit (Logistic regression, Arcus Quickstat, Biomedical Version 1.1). I dati sono presentati nelle Tabelle 9 e 10. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 19

Tabella 9. Limite di rilevamento di RNA HIV usando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx e un test RT-PCR in tempo reale interno Titolo di input (UI/ml) Replicati Risultati Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) Risultati (%) Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx Risultati Risultati (%) 800 36 36 100,00 36 100,00 600 36 36 100,00 36 100,00 400 36 36 100,00 36 100,00 200 36 36 100,00 35 97,22 100 36 35 97,22 33 91,67 50 36 23 63,89 27 75,00 10 36 6 16,67 7 19,44 0 18 0 0,00 0 0,00 Valore di probit al 95% 123,08 133,92 Intervallo di confidenza 87,84 205,19 92,38 234,94 20 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Tabella 10. Limite di rilevamento di RNA HBV usando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx e un test PCR interno Titolo di input (UI/ml) Replicati Risultati Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1) Risultati (%) Protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx Risultati Risultati (%) 50 36 36 100,00 36 100,00 35 36 33 91,67 36 100,00 20 36 31 86,11 33 91,67 10 36 27 75,00 23 63,89 5 36 11 30,56 19 52,78 2 36 9 25,00 11 30,56 0,5 36 4 11,11 4 11,11 0 18 0 0,00 0 0,00 Valore di probit al 95% 51,73 37,51 Intervallo di confidenza 33,08 100,01 24,27 72,53 Robustezza del sistema È stato eseguito un confronto dei risultati relativi ai campioni di plasma e siero da donatori singoli raccolti utilizzando provette di prelievo di sangue diverse (Tabella 11) a cui sono stati aggiunti standard dei virus HIV e HCV. I campioni sono stati elaborati utilizzando i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx (Figure 4 e 5). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 21

Tabella 11. Combinazioni di provette e virus aggiunti a campioni di plasma per la determinazione della variazione del sistema Virus Provetta Abbreviazione Fornitore N. cat.* HIV Vacutainer PPT PPT BD 362788 HIV Vacuette EDTA Vacuette Greiner bio-one 454036 HIV Primavette S EDTA Primavette Kabe Labortechnik 0959 0540 HCV Vacutainer PPT PPT BD 362788 HCV Monovette Coagulation 9 NC S 9NC Sarstedt 02.1067.001 HCV Monovette Serum Gel S 9 S Gel Sarstedt 02.1388.001 * I numeri di catalogo sono soggetti a modifica; verificare con il produttore o con il fornitore. Robustezza del sistema utilizzando provette diverse HIV 6 Risultato (in UI/ml) 5 4 3 2 1 0 PPT Vacuette Primavette Provette Figura 4. Per aggiungere ai campioni di plasma HIV a un titolo di 1,4 x 10 5 UI/ml è stato utilizzato uno standard funzionante interno di virus HIV calibrato allo standard internazionale dell OMS L RNA HIV è stato purificato utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx e rilevato utilizzando il test COBAS TaqMan HIV-1 (Roche Diagnostics GmbH). Le provette utilizzate sono elencate nella Tabella 11. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 0,61 cp). 22 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Robustezza del sistema utilizzando provette diverse HCV 4 3 2 1 Risultato (in UI/ml) 0 PPT S 9NC S Gel Provette Figura 5. Ai campioni dei donatori è stato aggiunto uno standard di virus HCV calibrato disponibile in commercio di AcroMetrix a un titolo di 500 UI/ml. Per il rilevamento, è stato utilizzato il test COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics GmbH) come test diagnostico downstream. La preparazione del campione è stata eseguita utilizzando il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1). Le provette utilizzate sono elencate nella Tabella 11, pagina 22. I valori UI sono stati calcolati utilizzando le specifiche presenti nel manuale per il test downstream (1 UI = 1 cp). Esclusione del carryover dei campioni Sul sistema BioRobot MDx DSP sono state effettuate sei esecuzioni, per valutare il rischio di eventi di contaminazione crociata durante e tra i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx. Il test è stato eseguito utilizzando uno standard virus HBV quantificato HBV messo in commercio da AcroMetrix. Il carico virale dei campioni positivi utilizzati per i test del carryover era di 2,0 x 10 5 UI/ml. Per la diluizione di campioni positivi e come campioni di controllo negativi, è stato utilizzato plasma umano negativo all HBV con citrato. Per rilevare il carryover da campione a campione, sono state effettuate 3 esecuzioni con una disposizione a scacchiera di campioni negativi e fortemente positivi. Dopo ogni esecuzione a scacchiera, per monitorare il possibile carryover da una esecuzione all altra, è stata effettuata un esecuzione con campioni tutti negativi. Il DNA HBV è stato rilevato utilizzando un test PCR interno endpoint seguito da elettroforesi del gel dell agarosi. È stato convalidato che il test è in grado di rilevare il DNA HBV con una probabilità del 95% a un titolo del virus pari a 16,76 UI/ml (probit al 95%). Tramite l utilizzo del test PCR HBV interno, tutti i campioni altamente positivi sono stati rilevati come positivi. Tutti i campioni negativi, nelle esecuzioni a scacchiera e nelle esecuzioni in cui erano presenti solo campioni negativi, non hanno fornito risposta. Questi esperimenti dimostrano che i protocolli QIAamp DSP 96 Virus MDx, in queste condizioni, non presentano carryover di campioni. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 23

Strumenti e reagenti forniti dall operatore Quando si utilizzano sostanze chimiche, indossare sempre un adeguato camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali di protezione. Per ulteriori informazioni, consultare le appropriate schede di sicurezza (MSDS), disponibili presso il fornitore dei prodotti. Il sistema BioRobot MDx DSP, compresi la stazione di lavoro BioRobot MDx, il software QIAsoft MDx DSP e il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx Puntali dei filtri monouso, 1100 μl (960) (n. di catalogo 9012598) Etanolo (96 100%, grado di purezza p.a.) Acqua distillata deionizzata Guanti monouso Cilindri di misurazione (200, 500 e 1000 ml) Centrifuga con rotore compatibile per la centrifugazione delle provette del campione Pipette e relativi puntali (per evitare la contaminazione crociata, si raccomanda di utilizzare puntali con filtro) 24 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Note importanti Punti generali importanti Dopo aver ricevuto il kit, verificare che i singoli componenti non siano danneggiati. Se le confezioni blister o i flaconi appaiono danneggiati, rivolgersi al servizio di assistenza QIAGEN o al distributore locale. In caso di rovesciamento dei liquidi, consultare le Informazioni di sicurezza (pagina 7). Non utilizzare componenti del kit danneggiati, poiché potrebbero inficiare le prestazioni del kit. Utilizzare sempre attrezzature prive di RNasi. Sostituire sempre i puntali delle pipette quando si eseguono trasferimenti manuali di liquidi (per es., al momento della preparazione, dell unione o della divisione di campioni virali da posizionare sul tavolo di lavoro BioRobot MDx). Utilizzare sempre puntali dei filtri monouso di QIAGEN (vedere pagina 24) per evitare la contaminazione crociata. Utilizzare sempre guanti monouso e controllare regolarmente che non siano contaminati da materiale campione. Se i guanti risultano contaminati, gettarli. Per escludere i rischi associati all uso di materiale potenzialmente infetto, si raccomanda di operare in condizioni di flusso d aria laminare, finché non ha avuto luogo il posizionamento dei campioni sul tavolo di lavoro BioRobot MDx. Non utilizzare componenti appartenenti a un altro kit QIAamp DSP 96 Virus MDx, a meno che i numeri del materiale e di lotto dei due kit non siano identici. Non unire reagenti da flaconi o provette diversi, anche se provengono dallo stesso lotto o dallo stesso kit. Dopo l utilizzo, chiudere tutti i flaconi per evitare perdite. Non utilizzare un kit o un suo componente dopo la data di scadenza. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti del kit. Il sistema deve essere utilizzato esclusivamente da personale esperto nelle pratiche di laboratorio per la diagnostica in vitro e nel funzionamento del sistema BioRobot MDx DSP. Il personale deve inoltre far riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 25

Preparazione dell RNA Il tampone di eluizione (AVE) è testato per l assenza di livelli rilevabili di RNasi e contiene sodio azide, un agente antimicrobico in grado di impedire la crescita di organismi che producono RNasi. Tuttavia, poiché questo tampone non contiene agenti chimici di degradazione delle RNasi, non può inibire le RNasi introdotte da una manipolazione scorretta. Manipolare con cura il tampone di eluizione (AVE), onde evitare la contaminazione con le RNasi. Conservazione dei campioni Dopo il prelievo e la preparazione, è possibile conservare plasma e siero a 2 8 C per un massimo di 6 ore. Per una conservazione a lungo termine, è consigliato il congelamento a -20 C o -80 C in aliquote. I campioni di siero e plasma non devono essere scongelati più volte. Congelamento e scongelamento, se ripetuti, possono provocare la denaturazione e la precipitazione delle proteine, riducendo i titoli virali e limitando di conseguenza la resa di acidi nucleici virali. Inoltre, i crioprecipitati che si formano durante il congelamento e lo scongelamento ripetuti possono ostruire le membrane della piastra QIAamp 96. Se sono visibili crioprecipitati, farli sedimentare per centrifugazione a circa 6800 x g per 3 minuti. Aspirare e processare immediatamente il sovranatante limpido, senza toccare il pellet. Prima di iniziare la procedura di purificazione dell acido nucleico virale, i campioni scongelati devono essere equilibrati a temperatura ambiente (15 25 C). Preparazione di reagenti e tamponi Preparazione della proteasi QIAGEN Aggiungere l intero contenuto di un flacone di solvente della proteasi (PS) contenente 6 ml a un tubo contenente la proteasi QIAGEN (QP) liofilizzata e miscelare con cura. Per evitare la formazione di schiuma, miscelare più volte la fiala capovolgendola. Assicurarsi che la proteasi QIAGEN (QP) sia completamente disciolta. Aprire la fiala e posizionarla nel portareagenti per 1 flacone (QP) sul tavolo di lavoro BioRobot MDx. 26 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Aggiunta dell RNA carrier al tampone di lisi L RNA carrier svolge una duplice funzione. In primo luogo potenzia il legame degli acidi nucleici virali alla membrana della piastra QIAamp 96, soprattutto se i campioni contengono un numero molto limitato di molecole target. Secondariamente, aggiungendo grandi quantità di RNA carrier si riduce la possibilità di degradazione dell RNA virale, nel raro caso che le molecole dell RNasi non vengano denaturate dai sali caotropici e dal detergente nel tampone di lisi (AL). Se non si aggiunge RNA carrier al tampone di lisi (AL), si può osservare una diminuzione della quantità di DNA o RNA virale ottenuto. Inoltre l RNA carrier può rientrare nella composizione di alcuni reagenti per controllo interno dei test commerciali downstream. In tali casi, consultare le istruzioni per l uso fornite dal produttore del test downstream. Per preparare la soluzione di RNA carrier, aggiungere 450 μl di tampone di eluizione (AVE) a una fiala contenente 1.350 μg di RNA carrier liofilizzato. È fornita una provetta di tampone di eluizione (AVE) per ogni fiala di RNA carrier. L RNA carrier non si dissolve nel tampone di lisi (AL). È prima necessario discioglierlo nel tampone di eluizione (AVE) e successivamente aggiungerlo al tampone di lisi (AL). Assicurarsi che l RNA carrier sia completamente disciolto nel volume appropriato di tampone di eluizione (AVE), prima di miscelarlo con il tampone di lisi (AL). Trasferire 230 μl di RNA carrier ricostituito nel tampone di eluizione (AVE) a un flacone contenente 33 ml di tampone di lisi (AL) per ottenere una concentrazione finale di 5,6 μg di RNA carrier per la preparazione del campione. Miscelare delicatamente il flacone capovolgendolo 10 volte. Per evitare la formazione di schiuma, non utilizzare il vortex. Versare la miscela di tampone di lisi (AL) e RNA carrier in un recipiente monouso (DT) nel portareagente per 2 recipienti (posizione AL) e rimuovere tutte le bolle d aria più grandi toccandole con il puntale di una pipetta. Versare con attenzione il tampone di lisi (AL) contenente l RNA carrier nel recipiente monouso (DT) al fine di evitare la creazione di bolle grandi che potrebbero interferire con il sistema di rilevamento del liquido. Aggiunta di un controllo interno al tampone di lisi Si raccomanda fortemente l impiego di un controllo interno quando si utilizza il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx in combinazione con sistemi di amplificazione diagnostici e di rilevamento. In questo caso occorre aggiungere al tampone di lisi (AL) l RNA o il DNA di controllo interno e l RNA carrier ricostituito, quindi miscelarli con cura, invertendo il flacone 10 volte. Per evitare la formazione di schiuma, non utilizzare il vortex. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 27

Consultare le istruzioni del produttore per stabilire la concentrazione ottimale del controllo interno. L uso di una concentrazione diversa da quella consigliata può generare risultati scorretti. Quando si calcola la quantità appropriata di controllo interno da utilizzare, tenere in considerazione il volume iniziale del campione e quello dell eluato. Per i calcoli, utilizzare un volume di campione di partenza di 265 μl e un volume di eluato di 83 μl (vedere Eluizione di acidi nucleici virali, pagina 31). Consultare l Appendice C per un esempio di come calcolare la quantità di controllo interno da utilizzare con il sistema BioRobot MDx DSP e con i test diagnostici downstream. Utilizzare sempre il controllo interno corretto per il test downstream. Per ulteriori informazioni, vedere le istruzioni fornite dal produttore. Consultare l Appendice C per un esempio di come calcolare la quantità di controllo interno da utilizzare con il sistema BioRobot MDx DSP. Se si aggiunge un controllo interno al tampone di lisi (AL) e all RNA carrier, assicurarsi di trasferire non più di 33 ml della miscela nel recipiente monouso (DT). Smaltire il rimanente. L utilizzo di volumi maggiori potrebbe comportare una misurazione di liquido non corretta da parte del sistema di rilevamento del livello del liquido, causando il fallimento della procedura di controllo caricamento. Preparazione del tampone di lavaggio 1 (esclusivamente per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx AW1) Utilizzando un cilindro graduato, aggiungere 200 ml di etanolo (96 100%) a un flacone contenente 151 ml di tampone di lavaggio 1 (AW1) concentrato. Un flacone di tampone di lavaggio 1 (AW1) ricostituito contiene tampone sufficiente per 3 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il tampone di lavaggio 1 (AW1) ricostituito a temperatura ambiente (15 25 C). Per consentire l identificazione da parte del sistema BioRobot MDx DSP, ogni flacone di tampone di lavaggio 1 (AW1) riporta un codice a barre sull etichetta. Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei reagenti con il codice a barre rivolto verso l esterno. Il reagente è necessario esclusivamente per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1). Per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx standard, il flacone del tampone di lavaggio 1 (AW1) può essere rimosso dal rotore dei reagenti o lasciato in posizione. Miscelare sempre il tampone di lavaggio 1 (AW1) ricostituito, invertendo il flacone più volte prima di posizionarlo nel carosello dei reagenti. Dopo un esecuzione, se non si procede immediatamente a un altra esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un altra esecuzione. 28 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Preparazione del tampone di lavaggio 2 Utilizzando un cilindro graduato, aggiungere 300 ml di etanolo (96 100%) a un flacone contenente 127 ml di tampone di lavaggio 2 (AW2) concentrato. Un flacone di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito contiene tampone sufficiente per 3 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito a temperatura ambiente (15 25 C). Per consentire l identificazione da parte del sistema BioRobot MDx DSP, ogni flacone di tampone di lavaggio 2 (AW2) riporta un codice a barre sull etichetta. Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei reagenti con il codice a barre rivolto verso l esterno. Miscelare sempre il tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito, invertendo il flacone più volte prima di posizionarlo nel carosello dei reagenti. Dopo un esecuzione, se non si procede immediatamente a un altra esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un altra esecuzione. Preparazione dell etanolo Riempire il flacone vuoto di etanolo (BOT) con 350 ml di etanolo (96 100%). Aggiungere 350 μl di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito a tale flacone (per una diluizione finale 1/1000 di AW2); ciò consente al sistema BioRobot MDx DSP di rilevare il livello di riempimento nel flacone attraverso misurazioni della conducibilità. Il flacone riempito contiene etanolo sufficiente per 2 esecuzioni di 96 campioni ciascuna. Conservare il flacone a temperatura ambiente (15 25 C). Per consentire l identificazione da parte del sistema BioRobot MDx DSP, il flacone di etanolo (BOT) riporta un codice a barre sull etichetta. Il flacone aperto deve essere posizionato nel carosello dei reagenti con il codice a barre rivolto verso l esterno. Miscelare sempre l etanolo invertendo il flacone più volte prima di posizionarlo nel carosello dei reagenti. Dopo un esecuzione, se non si procede immediatamente a un altra esecuzione, chiudere il flacone. Togliere il tappo quando si inizia un altra esecuzione. Assicurarsi che siano aggiunti a 350 ml di etanolo (EtOH) 350 μl di tampone di lavaggio 2 (AW2) ricostituito, come descritto precedentemente, al fine di consentire la misurazione della conducibilità da parte del sistema BioRobot MDx DSP. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 29

Preparazione del liquido di sistema Riempire il flacone del liquido di sistema vuoto nel rotore dei reagenti con almeno 700 ml di acqua deionizzata. Il flacone riempito contiene liquido di sistema sufficiente per 1 esecuzione di 96 campioni e per la procedura di pulizia successiva all esecuzione. Il flacone aperto deve essere posizionato nell alloggiamento corrispondente nel carosello dei reagenti. Preparazione del tampone di eluizione Per 1 esecuzione di 96 campioni, sono necessarie 8 provette di tampone di eluizione (AVE). Aprire tali provette e posizionarle nel portareagente per microprovette e nel recipiente (posizione AVE). Fare attenzione a non contaminare i tamponi con RNasi. Smaltire il tampone di eluizione (AVE) in eccesso dopo ogni esecuzione. Preparazione del fluido di eluizione Per 1 esecuzione di 96 campioni, sono necessarie 4 provette di fluido di eluizione (TOPE). Aprire tali provette e posizionarle nel portareagente per microprovette e nel recipiente (posizione TOPE). Smaltire il fluido di eluizione (TOPE) in eccesso dopo ogni esecuzione. Preparazione degli oggetti in plastica S-Block Per ogni esecuzione, deve essere posizionato 1 S-Block (SB) nell adattatore di trasferimento del calore argentato del sistema di riscaldamento e raffreddamento. Assicurarsi che la posizione A1 si trovi nell angolo in alto a sinistra. Smaltire l S-Block dopo ogni esecuzione. Recipienti monouso Per ogni esecuzione, devono essere posizionati 2 recipienti monouso (DT) nel portareagente per 2 recipienti (posizioni AL e EtOH) nella fessura 2 dell MP. Smaltire i recipienti monouso (DT) dopo l esecuzione. Microprovette di eluizione CL Per ogni esecuzione, 1 provetta di eluizione CL (EMT) deve essere posizionata nell adattatore blu per microprovette di eluizione. L insieme delle provette di eluizione CL (EMT) e dell adattatore deve essere posizionato sulla parte superiore del portareagente per microprovette e del recipiente. Assicurarsi che il codice a barre delle microprovette di eluizione CL (EMT) sia rivolto verso destra. 30 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Piastra QIAamp 96 Per ogni esecuzione, una piastra QIAamp 96 deve essere posizionata nell apposito portapiastra a pozzetti multipli argentato. Assicurarsi che la posizione A1 si trovi nell angolo in altro a sinistra e che il codice a barre della piastra QIAamp 96 sia rivolto verso destra. Smaltire la piastra QIAamp 96 dopo l esecuzione. Preparazione dei contenitori grandi di liquido All avvio del protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx sul sistema BioRobot MDx DSP, appariranno sul display dei messaggi relativi alla preparazione del contenitore del liquido di sistema, del contenitore dei rifiuti e della trappola del vuoto. Contenitore del liquido di sistema Svuotare il contenitore del liquido di sistema (sotto la stazione di lavoro). Per aprire il contenitore del liquido di sistema, scollegare prima i tubi e poi rimuovere il coperchio. Sciacquare il contenitore accuratamente con acqua fresca deionizzata e riempirlo nuovamente con acqua fresca deionizzata. Dopo aver riempito il contenitore del liquido di sistema con acqua deionizzata, chiudere il coperchio e collegare i tubi. Irrorare il sistema del diluitore con 30 ml di acqua deionizzata selezionando Tools/Flush System (Strumenti/ Lava sistema). Contenitore di scarico e trappola del vuoto Svuotare la trappola del vuoto e il contenitore di scarico (sotto la stazione di lavoro). Quando si apre la trappola del vuoto, scollegare prima i tubi e poi rimuovere il coperchio. Dopo aver svuotato la trappola del vuoto, chiudere il coperchio e collegare i tubi. La trappola e il contenitore, e i rispettivi coperchi e tubi, possono essere puliti con detergente e sciacquati con acqua. I liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx non sono stati testati per la presenza di materiali infetti residui. La contaminazione dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è altamente improbabile, ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i liquidi di scarico devono essere considerati infetti e smaltiti in conformità alle normative di sicurezza locali vigenti in materia. Eluizione di acidi nucleici virali Gli acidi nucleici virali sono raccolti in microprovette di eluizione CL (EMT). Il volume medio di tampone di eluizione (AVE) aggiunto dal sistema BioRobot Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 31

MDx DSP per ciascun pozzetto della piastra QIAamp 96 è 91 μl. Il volume medio di ogni eluato raccolto nelle microprovette di eluizione CL (EMT) è 83 μl. Resa e qualità degli acidi nucleici virali La resa e la qualità degli acidi nucleici virali isolati sono idonee per tutti i tipi di applicazioni di diagnostica molecolare downstream. La resa e la purezza degli acidi nucleici virali possono variare, a seconda che il protocollo venga utilizzato con o senza tampone di lavaggio 1 (AW1). L utente deve convalidare il protocollo che meglio si adatta allo specifico test downstream, sulla base delle linee guida ICH in ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and terminology e ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology. Eseguire i test diagnostici attenendosi alle istruzioni dei produttori. Impostazione della stazione di lavoro BioRobot MDx Dopo aver aperto il software QIAsoft MDx DSP e avviato uno dei protocolli di preparazione dei campioni (vedere protocollo, pagina 37), appare una serie di messaggi che guidano l utente attraverso l impostazione della stazione di lavoro BioRobot MDx per la procedura di purificazione computerizzata degli acidi nucleici virali. È importante seguire ogni messaggio visualizzato prima di passare al successivo. La Figura 6 (pagina 33) e le Tabelle 12 e 13 (pagine 34 e 35) riassumono il layout del tavolo di lavoro BioRobot MDx e le posizioni nelle quali devono essere collocati gli elementi. Pulizia della stazione di lavoro BioRobot MDx Alla fine dell esecuzione di un protocollo, il software QIAsoft MDx DSP visualizza una serie di messaggi che guidano l utente attraverso i passaggi della procedura di pulizia. Dopo ogni esecuzione, smaltire sempre gli oggetti in plastica e i reagenti rimanenti sul tavolo di lavoro (AL, AVE, TOPE ed etanolo), al fine di evitare il carryover di acidi nucleici virali all esecuzione successiva del protocollo. I reagenti rimasti nel carosello dei reagenti (AW1 e AW2) possono essere utilizzati in diverse esecuzioni di protocollo fino alla data di scadenza specificata sulle etichette dei flaconi. Non unire reagenti da flaconi o provette diversi, anche se provengono dallo stesso lotto o dallo stesso kit. I liquidi di scarico generati dalla procedura QIAamp DSP 96 Virus MDx non sono stati testati per la presenza di materiali infetti residui. La contaminazione dei liquidi di scarico da parte di materiali infetti residui è altamente improbabile, ma non può essere esclusa completamente. Pertanto i liquidi di scarico devono essere considerati infetti e smaltiti in conformità alle normative di sicurezza locali vigenti in materia. 32 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Tavolo da lavoro BioRobot MDx Vassoio per puntali Portapiastra a pozzetti multipli nero (contiene l adattatore di canalizzazione) Portapiastra a pozzetti multipli argentato (contiene una piastra QIAamp 96) Base apparato da vuoto Coperchio apparato da vuoto Parte superiore dell apparato da vuoto Sistema di monitoraggio campioni Portareagente per 2 recipienti (posizione EtOH) Portareagente per 2 recipienti (posizione AL) Sistema di riscaldamento e raffreddamento Portareagente per 1 flacone QP Portareagente per microprovette e recipiente Posizione TOPE Posizione AVE Microprovette di eluizione CL (sull adattatore di microprovette di eluizione) Figura 6. Panoramica del tavolo di lavoro BioRobot MDx e dei suoi componenti principali. Fare riferimento alle Tabelle 12 e 14 per maggiori dettagli. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 33

Tabella 12. Caricamento degli oggetti in plastica e degli accessori Articolo Posizione Contenitore/adattatore Microprovette di eluizione CL (EMT) Portareagente per microprovette e recipiente Adattatore microprovette di eluizione blu Recipiente monouso (DT) Fessura 2 MP Portareagente per 2 recipienti (EtOH e AL) Piastra QIAamp 96 Adattatore di canalizzazione S-Block (SB) Puntali monouso (1100 μl) Coperchio apparato da vuoto Parte superiore dell apparato da vuoto Portapiastra a pozzetti multipli argentato Portapiastra a pozzetti multipli nero Sistema di riscaldamento e raffreddamento Porta puntale rosso A destra della base dell apparato da vuoto A destra della base dell apparato da vuoto e sopra il coperchio dell apparato da vuoto Adattatore di trasferimento di calore argentato 34 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Tabella 13. Caricamento dei tamponi e dei reagenti Articolo Posizione Volume Tampone di lisi (AL)* Recipiente monouso (DT) nel portareagente per 2 recipienti (posizione AL) 33 ml Proteasi QIAGEN (QP) Portareagente per 1 flacone (QP) 6 ml Tampone di eluizione (AVE) Portareagente per Otto provette da 2 ml microprovette e recipiente (tappo viola) (posizione AVE) Fluido di eluizione (TOPE) Tampone di lavaggio 1 (AW1) Tampone di lavaggio 2 (AW2) Portareagente per microprovette e recipiente (posizione TOPE) Carosello dei reagenti Carosello dei reagenti Quattro provette da 1,5 ml (tappo arancione) Minimo di 164 ml (ricostituito) Minimo di 191 ml (ricostituito) Etanolo Carosello dei reagenti Minimo di 350 ml Liquido di sistema Carosello dei reagenti Minimo di 700 ml di acqua deionizzata Campioni Sistema di monitoraggio campioni Minimo di 500 μl di campione in ogni provetta * Contenente RNA carrier e controllo interno. Ricostituito in 6 ml di solvente della proteasi (PS). La presenza di fluido di eluizione (TOPE) non è monitorata nel controllo di caricamento. Necessario esclusivamente per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1). Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 35

Protocollo: isolamento e purificazione in automatico degli acidi nucleici virali da plasma e siero Per isolare e purificare acidi nucleici virali da 265 μl di plasma o siero trattati con EDTA o citrato utilizzando il sistema BioRobot MDx DSP. Punti importanti prima di iniziare Ogni campione deve essere etichettato con un codice a barre; in caso contrario, non sarà elaborato. La persona con accesso da supervisore al software QIAsoft MDx DSP può selezionare se usare codici a barre univoci (l impostazione predefinita) o codici a barre non univoci. Per dettagli, fare riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. Utilizzando l opzione con codici a barre non univoci, lo stesso codice a barre può essere utilizzato per etichettare campioni diversi. In tal caso, prestare attenzione a non confondere i campioni aventi lo stesso codice a barre. Orientare i campioni etichettati con codice a barre nei portaprovette del sistema di monitoraggio dei campioni in modo tale che i codici a barre siano rivolti verso la telecamera del lettore di codici a barre sul lato sinistro della stazione di lavoro BioRobot MDx. Le etichette dei codici a barre devono essere attaccate alle provette dei campioni in modo tale che le linee dei codici a barre siano orizzontali. Le etichette dei codici a barre devono essere compatibili con la stazione di lavoro BioRobot MDx (per dettagli, vedere il Manuale utente BioRobot MDx DSP). Ogni provetta deve contenere almeno 500 μl di campione. Il contenitore di smaltimento dei puntali deve contenere una borsa di smaltimento dei puntali completamente aperta e vuota. Il cassetto con il contenitore di smaltimento dei puntali deve essere completamente inserito. Il contenitore del liquido di sistema, il contenitore dei rifiuti e la trappola del vuoto devono essere posizionati correttamente nei rispettivi contenitori e la loro parte esterna deve essere asciutta. Il sensore del contenitore del liquido di sistema deve essere asciutto. Se il sistema BioRobot MDx DSP visualizza un errore (per es., pressione indotta dal vuoto insufficiente) durante la preparazione computerizzata dei campioni, seguire le istruzioni visualizzate nei messaggi sullo schermo o fare riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. I messaggi visualizzati (che appaiono in inglese) o le loro traduzioni sono elencati nell Appendice A, pagina 41. 36 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Operazioni da eseguire prima di iniziare Aggiungere l RNA carrier ricostituito in tampone di eluizione (AVE) e il controllo interno al tampone di lisi (AL), secondo le istruzioni a pagina 27. Assicurarsi che il tampone di lavaggio 1 (AW1), il tampone di lavaggio 2 (AW2), la proteasi QIAGEN (QP) e l etanolo siano stati preparati secondo le istruzioni della sezione Preparazione di reagenti e tamponi a pagina 26. Procedura 1. Lasciar equilibrare i campioni a temperatura ambiente (15 25 C) e miscelare bene diverse volte per inversione. I crioprecipitati che si formano durante il congelamento e lo scongelamento ripetuti possono ostruire le membrane della piastra QIAamp 96. Se sono visibili crioprecipitati, farli sedimentare per centrifugazione a circa 6800 x g per 3 minuti. Aspirare e processare immediatamente il sovranatante limpido, senza toccare il pellet. Evitare la creazione di bolle grandi, poiché potrebbero interferire con il sistema di rilevamento del liquido. 2. Assicurarsi che la stazione di lavoro BioRobot MDx sia accesa. L interruttore è posizionato in basso a destra sul pannello frontale della stazione di lavoro BioRobot MDx DSP. 3. Accendere il computer e il monitor. 4. Avviare il software QIAsoft MDx DSP. Il software può essere avviato dal desktop. 5. Effettuare il login con il nome utente e la password. Il nome utente e la password di ogni operatore possono essere definiti dal supervisore. Per informazioni dettagliate su come assegnare un nome utente e una password a ogni operatore, fare riferimento al Manuale utente BioRobot MDx DSP. 6. Fare clic su per attivare la finestra di dialogo adiacente. Utilizzare il lettore di codice a barre manuale per effettuare la scansione del codice a barre della Q-Card in tale campo. Per ogni protocollo, sull etichetta della Q-Card è stampato un codice a barre. Dopo aver eseguito la scansione del codice a barre appropriato, il protocollo è selezionato automaticamente. Assicurarsi di scegliere il protocollo appropriato. Scegliere il codice a barre superiore per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx (AW1), con lavaggio AW1. Scegliere il codice a barre inferiore per il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx, senza lavaggio AW1. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 37

Il codice a barre della Q-Card contiene informazioni sul numero di materiale, sul numero di lotto e sulla data di scadenza dei reagenti. Queste informazioni e il protocollo scelto saranno registrati in un file di risultati generato per ogni esecuzione. 7. Fare clic su per avviare il protocollo QIAamp DSP 96 Virus MDx. 8. Scegliere se inserire un ID specifico dell utente per l esecuzione del protocollo. Se si sceglie questa opzione, appare una finestra di dialogo per l immissione di un ID specifico utilizzando esclusivamente lettere e numeri (l ID deve essere univoco e non può essere utilizzato nuovamente). Alla fine dell esecuzione del protocollo, il software crea dei file di risultati il cui nome sarà lo specifico ID inserito. I contenuti di tali file saranno gli stessi di quelli dei file di risultati predefiniti. 9. Attenersi alle istruzioni sullo schermo per impostare il tavolo di lavoro. Per i passaggi rimanenti necessari per impostare la stazione di lavoro BioRobot MDx (vedere pagina 41), è possibile scegliere di essere guidati da una serie di messaggi visualizzati o da una tabella di riferimento. L ultima opzione dovrebbe essere scelta solo da utenti esperti. Versare con attenzione il tampone di lisi (AL) contenente l RNA carrier (e il controllo interno opzionale) nel recipiente monouso (DT) al fine di evitare la creazione di bolle grandi che potrebbero interferire con il sistema di rilevamento del liquido. Quando il coperchio del tavolo di lavoro è bloccato, il sistema BioRobot MDx DSP controlla che ogni componente necessario per il protocollo sia in posizione e che sia possibile leggere i codici a barre. Se viene rilevato un errore (per es., manca un componente o il volume di un reagente è troppo basso), la stazione di lavoro si arresta e un messaggio suggerisce di ricontrollare attentamente la causa dell errore. Seguire i passaggi dettagliati in ogni messaggio prima di continuare. 38 Manuale QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit 10/2004

Se non è stato possibile leggere alcuni codici a barre, appare la finestra di dialogo seguente: I campioni non identificati sono evidenziati in rosso. Dopo aver corretto la causa dell errore di lettura dei codici a barre, fare clic su Scan Again (Nuova scansione) per eseguire nuovamente la scansione di tutti i codici a barre oppure su Scan Failed Positions Manually (Scansione manuale posizioni non riuscite) per eseguire solo la scansione dei codici a barre dei campioni non identificati. Se si seleziona Scan Failed Positions Manually, appare la finestra di dialogo seguente: Eseguire la scansione di ogni codice a barre utilizzando il lettore di codici a barre manuale oppure digitare il numero di ogni codice a barre. Quando si digitano i numeri dei codici a barre, ogni codice a barre deve essere inserito due volte. Manuale per il kit QIAamp DSP 96 Virus MDx 10/2004 39