Research Collection Doctoral Thesis The role of germline residues and redundant somatic mutations in the development of broadly influenza neutralizing antibodies Author(s): Pappas, Leontios Publication Date: 2014 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-010414749 This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library
DISS. ETH NO. 22122 The role of germline residues and redundant somatic mutations in the development of broadly influenza neutralizing antibodies A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) Presented by LEONTIOS PAPPAS MSc, University of Oxford Born on 18.02.1987 Citizen of Greece Accepted on the recommendation of Professor Dr. Antonio Lanzavecchia, examiner Dr. Federica Sallusto, co-examiner Professor Dr. Annette Oxenius, co-examiner Professor Dr. Antonius Rolink, co-examiner 2014
1.1 English Summary Influenza virus is responsible for 3.5-5 million cases of severe disease and 300,000-500,000 deaths annually[1, 2]. The neutralizing antibody response to influenza is dominated by antibodies that bind to the globular head of the hemagglutinin (HA), which undergoes a continuous antigenic drift, necessitating the re-formulation of influenza vaccines on a yearly basis. Recently, several laboratories have described a new class of rare influenza-neutralizing antibodies that target a conserved site in the HA stem[3-8]. Although such broadly neutralizing antibodies have the capacity for effectively neutralizing multiple different strains of the virus, to date there is little knowledge on how these antibodies develop. This study has attempted to address this issue by dissecting the evolutionary pathways broadly influenza neutralizing antibodies follow as a result of affinity maturation. Most anti-ha stem antibodies use the heavy chain variable region VH1-69 gene, and structural data demonstrate that they bind through conserved heavy chain complementarity determining region (HCDR) residues. However, the VH1-69 antibodies are highly mutated and are produced by several but not all individuals[8, 9], suggesting that multiple somatic mutations may be required for their development[10]. By analyzing 197 anti-stem antibodies from a single donor, the developmental pathways of several VH1-69 clones were reconstructed and two key elements that are required for the initial development of most VH1-69 antibodies were identified: a polymorphic germline-encoded F at position 54 and a conserved Y at position 98 in the HCDR3. Strikingly, in most cases a single P52aA mutation in the HCDR2 was sufficient to confer high affinity binding to the selecting H1 antigen, consistent with rapid affinity maturation. Surprisingly, additional favorable mutations continued to accumulate, increasing the breadth of reactivity and making the initial mutations, and even F54, redundant. These results define VH allele polymorphism, the VDJ rearrangement and single somatic mutations as the three requirements for the generation of broadly neutralizing VH1-69 antibodies, and reveal an unexpected redundancy in the affinity maturation process. By reconstructing the genealogy trees of several influenza-specific human B cell clones, two distinct evolutionary pathways leading to broadly VH1-69 influenza neutralizing antibodies were identified. Those bearing Y98 in their HCDR3 preferentially accumulate a P52aA/G mutation in the HCDR2. In contrast, antibodies without Y98 do not mutate the germline P52a residue and follow maturation 7
pathways via distinct substitutions in the HCDR1. Finally, this study elucidates the definitive role of the HCDR3 in determining whether different amino acid substitutions have a positive or neutral role in antigen binding on a particular antibody scaffold. This finding is especially relevant for identifying substitutions that may confer broad binding reactivity. The broadly neutralizing CR9114 antibody requires 8 amino acid substitutions in order to bind to Influenza A group 1 and 2 and Influenza B strains, which do not necessarily confer the same breadth of binding on different HCDR3 scaffolds. Taken together, these results demonstrate that the HCDR3 is important not only for defining the antigenic reactivity of naïve B cells, but it also constrains the maturation pathways a clone may follow to achieve broad, high affinity binding. This work has significantly advanced our understanding of how antibodies target the HA stem, by identifying the substitutions which have been selected to confer binding as the result of antigen-driven affinity maturation in the human antibody response. Such knowledge is critical for informing the design of HA stembased immunogens capable of eliciting antibodies of similar breadth and potency. Potent, broadly neutralizing antibodies play a key role for informing structurallyguided vaccine design, an approach that was recently applied for determining a promising vaccine candidate for Respiratory Syncytial Virus[11]. We hope that the novel findings on the maturation process of broadly neutralizing anti-stem antibodies presented in this study may eventually assist in the development of a universal influenza vaccine. 1.2 Riassunto in Italiano Il virus dell influenza è responsabile di 3,5-5 milioni di casi di gravi malattie e di 300.000-500.000 morti ogni anno [1, 2]. La risposta anticorpale neutralizzante nei confronti del virus dell influenza è costituita prevalentemente da anticorpi diretti contro la testa globulare dell emagglutinina (HA), la quale va incontro a continue mutazioni antigeniche, per cui è necessario riformulare i vaccini annualmente. Recentemente, diversi laboratori hanno descritto una nuova classe di rari anticorpi neutralizzanti il virus dell influenza che sono diretti contro un sito conservato nello stelo dell HA[3-8]. Nonostante questi anticorpi siano dotati di un ampio spettro neutralizzante nei confronti di una larga varietà di ceppi virali, attualmente la loro modalità di sviluppo è poco conosciuta. Questo studio si prefigge di analizzare questo 8
aspetto attraverso la dissezione delle modalità di evoluzione seguite dagli anticorpi ad ampio spettro di neutralizzazione come risultato della maturazione dell affinità. La maggior parte degli anticorpi contro lo stelo dell HA utilizzano il gene VH1-69 della regione variabile della catena pesante e dati strutturali mostrano che si servono di residui conservati della heavy chain complementarity determining region (HCDR) per il legame con l HA. Comunque, gli anticorpi VH1-69 sono altamente mutati e sono prodotti da molti ma non da tutti gli individui[8, 9], il che suggerisce che diverse mutazioni somatiche possano essere necessarie per il loro sviluppo[10]. Attraverso l analisi di 197 anticorpi contro lo stelo dell HA da un singolo donator, le vie di sviluppo di molti cloni VH1-69 sono state ricostruiti e due elementi chiave per lo sviluppo iniziale della maggior parte degli anticorpi VH1-69 sono stati identificati: un residuo F polimorfico codificato dalla linea germinale in posizione 54 ed un residuo Y conservato in posizione 98 nell HCDR3. E notevole il fatto che, nella maggioranza dei casi, una singola mutazione P52aA nell HCDR2 era sufficiente per conferire un alta affinità di legame al tipo di antigene H1 dal quale gli anticorpi sono stati selezionati, in accordo con una rapida maturazione dell affinità. Sorprendentemente, mutazioni favorevoli aggiuntive hanno continuato ad accumularsi, ampliando lo spettro di reattività e rendendo le mutazioni iniziali ridondanti, compresa la F54. Questi risultati definiscono il polimorfismo dell allele VH, il ri-arrangiamento VDJ e singole mutazioni somatiche come i tre elementi necessari per la generazione di anticorpi VH1-69 ad ampio spettro di neutralizzazione e rivelano un inaspettata ridondanza nel processo di maturazione dell affinità. Attraverso la ricostruzione dell albero genealogico di diversi cloni di linfociti B specifici per il virus dell influenza, due distinte vie evolutive che conducono alla generazione di anticorpi VH1-69 ad ampio spettro di neutralizzazione sono state identificate. Gli anticorpi che contengono Y98 nel loro HCDR3 accumulano preferenzialmente una mutazione P52aA/G nell HCDR2. Al contrario, gli anticorpi senza Y98 non mutano il residuo P52a della linea germinale e seguono vie di maturazione attraverso distinte sostituzioni aminoacidiche nell HCDR1. Infine, questo studio chiarisce il ruolo fondamentale di HCDR3 nel determinare il ruolo positivo o neutro di differenti sostituzioni aminoacidiche nel legame all antigene di particolari strutture anticorpali. Questa scoperta è di particolare rilevanza per l identificazione di sostituzioni che possono conferire una reattività di legame ad ampio spettro. L anticorpo ad ampio spettro di neutralizzazione CR9114, per legarsi a 9
ceppi di virus dell influenza di tipo A di gruppo 1 e 2 e virus dell influenza di tipo B, necessita di 8 sostituzioni aminoacidiche, le quali non necessariamente conferiscono lo stesso spettro di legame a differenti strutture di HCDR3. Nel complesso, questi risultati dimostrano che HCDR3 è importante non solo per definire la reattività antigenica di linfociti B naïve, ma anche nel regolare le vie maturative che un clone può seguire per raggiungere un legame ad ampio spettro e ad alta affinità. Attraverso l identificazione dei residui che sono stati selezionati come risultato della maturazione antigene-guidata della risposta anticorpale umana, questo lavoro accresce significativamente la nostra conoscenza di come gli anticorpi bersagliano lo stelo dell HA. Potenti anticorpi ad ampio spettro di neutralizzazione giocano un ruolo chiave nel disegno di vaccini basati sulla struttura antigenica, un approccio che è stato recentemente applicato nella definizione di un promettente candidato vaccino contro il virus Respiratorio Sinciziale[11]. Speriamo che le innovative scoperte sul processo maturativo degli anticorpi ad ampio spettro di neutralizzazione anti-stelo dell HA presentate in questo studio possano essere di aiuto nello sviluppo di un vaccino anti-influenza universale. 10