LA PROTEOLISI MEDIATA DA UBIQUITINA 1
Mentre si è spesa moltissima attenzione e ricerca scientifica verso la comprensione del meccanismo e del controllo della sintesi proteica nel secolo scorso, la funzione inversa, cioè la degradazione proteica, è stata considerata a lungo molto meno importante. Il concetto di turnover proteico ha meno di 60 anni. Fino agli anni 40-50 del secolo scorso le proteine intracellulari (strutturali e funzionali) erano considerate dei costituenti essenzialmente stabili, mentre le proteine della dieta agivano come entità separate ed erano soggette ad una degradazione a scopi energetici. Soltanto i primi esperimenti con marcature metaboliche che utilizzavano aminoacidi radioattivi dimostrarono che le proteine corporee andavano incontro ad un continuo turnover, erano cioè continuamente sintetizzate e degradate. Negli anni 50 la scoperta del lisosoma ha condotto a considerare che le proteine cellulari vengono degradate in questo organello. Tuttavia, quasi subito molti esperimenti hanno portato a distinguere una via di degradazione lisosomiale, per le proteine extracellulari, e una via di degradazione non lisosomiale per le proteine intracellulari. Per esempio, marcando metabolicamente le proteine endogene nel macrofago con 3H-leucina e dandogli da mangiare macrofagi morti marcati precedentemente con 14C-leucina, si potè seguire il destino delle proteine intracellulari ed extracellulari, rispettivamente. Utilizzando inibitori lisosomiali si trovò che inibivano specificamente la degradazione delle proteine extracellulari, ma non quella delle proteine intracellulari. Un altra differenza importante tra le due vie era data dall osservazione che la proteolisi intracellulare richiedeva energia, sotto forma di ATP. Questo è paradossale dal punto di vista termodinamico, dal momento che la proteolisi è un processo esoergonico. L energia doveva evidentemente essere richiesta non per il processo proteolitico di per sé stesso ma doveva essere usata indirettamente. 2
La linea del tempo qui sopra mostra le tappe principali che hanno portato alla scoperta della degradazione proteica intracellulare. La spiegazione per la paradossale osservazione che la proteolisi intracellulare richiede energia fu data dagli studi biochimici di Aaron Ciechanover e Avram Hershko negli anni 70-80. Per la loro scoperta hanno guadagnato il Nobel per la Chimica nel 2004, insieme con Irwin Rose. Essi dimostrarono che la degradazione delle proteine intracellulari avviene in una serie di reazioni successive che hanno lo scopo di etichettare con una catena di poliubiquitina le proteine substrato. Solo dopo essere state etichettate con l ubiquitina le proteine vengono distrutte. 3
Era stato descritto un sistema cell-free di degradazione ATP dipendente nei reticolociti (globuli rossi immaturi, senza lisosomi), che catalizzava la degradazione dell emoglobina denaturata in maniera ATP dipendente. Ciechanover e Hershko pensarono di rimuovere l emoglobina per cromatografia su scambio ionico, producendo due frazioni: la frazione 1, contenente l emoglobina nativa, e la frazione 2, con le proteine adsorbite. Ciascuna frazione era completamente inattiva da sola, mentre la combinazione delle due rocostituiva la degradazione ATP-dipendente. Aggiungendo i componenti isolati della frazione 1 alla frazione 2 cruda per determinare i componenti necessari, isolarono l APF-1 (ATP dependent Proteolytic Factor 1) una proteina di 9 kd che si dimostrò essere l ubiquitina. L ubiquitina si legava covalentemente alle molecole della frazione 2. La figura mostra un saggio di ubiquitinazione del lisozima: questo viene poliubiquitinato dalla frazione 2 solo in presenza di APF-1 e ATP 4
La scoperta che APF1 era legato covalentemente al substrato proteico e che ne stimolava la proteolisi in presenza di ATP e della frazione 2 portò al modello in cui le modificazioni al substrato arrecate dallla poli-ubiquitina lo rendevano riconoscibile come bersaglio di una non ancora identificata proteasi. Questa fu successivamente identificata nel proteosoma 26S. Dalla frazione 2, con esperimenti di ulteriore frazionamento e ricostituzione, furono identificati 3 enzimi: E1, l enzima che attiva l Ub; E2, l enzima di coniugazione ed E3, la proteina ligasi dell ubiquitina. Quest ultimo è il componente che possiede la specificità di substrato. In presenza di ATP e di E1, il gruppo carbossiterminale dell ubiquitina si lega all adenilato, liberando pirofosfato, e l ubiquitina attivata è trasferita sul gruppo sulfidrilico di una cisteina di E2. Successivamente, l ubiquitina viene trasferita su un gruppo sulfidrilico di E2. Infine E3, avvicinando E2 al substrato, catalizza il trasferimento dell Ub da E2 a un gruppo ε-amminico di una lisina della proteina substrato, con un legame isopeptidico. 5
Le successive reazioni di trasferimento legano l Ub sull aminoacido 46 dell Ub già coniugata. Sono possibili però anche altre reazioni che legano i residui di Ub su altre posizioni. A seconda del tipo di poliubiquitinazione il destino della proteina è diverso: catene su 46 indirizzano la proteina verso il proteasoma, mentre catene legate su altre Lys o eventi di monoubiquitiniazione regolano l attività di proteine nucleari. Nella via degradativa, le proteine ubiquitinate vengono direzionate al proteosoma. Il complesso, costituito da una gran numero di proteine, degrada il substrato in maniera ATP-dipendente in piccoli peptidi, mentre le Ub vengono rilasciate grazie all azione di idrolasi. 6
La linea cellulare di carcinoma mammario chiamata ts85 presentava un fenotipo caratteristico di arresto temperature-sensitive nella fase G2 del ciclo cellulare. Varshavsky osservò che in queste cellule. Questa linea cellulare ha l enzima (E1) attivante l ubiquitina temperature-sensitive. Diversamente dalle cellule parentali, le ts85 smettono di degradare le proteine a vita corta quando sono alla temperatura nonpermissiva. alfa, beta e gamma denotano le bande del lisozima che contengono quantità crescenti di 125Iubiquitina. 7
L enzima E1 purificato dalle cellule wt (FM3A) formava l ubiquitina-e1 tioestere, E1-S~u, un intermedio nel trasferimento dell ubiquitina attivata alle proteine accettrici in presenza di 125Iubiquitina e ATP. La figura mostra che alla temperatura permissiva (30 C), E1-S~u è presente anche nelle ts85, mentre non viene più evidenziato alla temperatura restrittiva (40 C). Le ts85 fornirono la prima evidenza che la coniugazione con l ubiquitina era necessaria per la degradazione proteica in vivo e che era coinvolta nella progressione del ciclo cellulare. Solo diversi anni più tardi fu dimostrato che il difetto nella progressione nel ciclo cellulare veniva recuperato in seguito alla trasfezione del cdna per l enzima wt E1, dimostrando che l ubiquitinazione regola il ciclo cellulare. Fu nel 1991 che si riconobbe il ruolo centrale giocato dalla via ubiquitina/proteosoma nella progressione nel ciclo cellulare. In particolare furono scoperte le due famiglie dei complessi ubiquitina ligasi E3, chiamate complesso SCF(Skp/Cullin/Fbox) e APC(Anaphase Promoting complex). Fu riconosciuto il ruolo essenziale della poliubiquitinazione nella degradazione del substrato da parte del proteasoma. 8
Come la maggior parte delle modificazioni proteine, l ubiquitinazione è un processo reversibile. La rimozione dell ubiquitina è effettuata dagli enzimi di deubiquitinazione (DUB), di cui si conoscono due famiglie DUB o UBP (ubiquitin-specific processing proteasis, che rimuovono l ubiquitina dalle proteine più grandi e rimuovono l intera catena di poli-ub, e le UCH (ubiquitin c-terminal hydrilases) che sono attive su piccoli peptidi. Alla metà degli anni 80 si conosceva soltanto un enzima E1 e pochi E2, E3. Oggi sappiamo che ci sono circa 50 E2 e più di 100 E3. Inoltre esistono anche altre sistemi di coniugazione con proteine ubiquitin-like come Nedd8 e Sumo. 9
Oggi Si sa che gli enzimi E3 sono di due tipi: quelli che utilizzano il dominio HECT, in cui lo stesso polipeptide lega sia E2 sia il substrato, e quelli che utilizzano il dominio Ring per legare E2 e un dominio o addirittura un polipeptide diverso per legare il substrato. Alcune famiglie di E3 con il Ring domain hanno sviluppato la costruzione modulare all estremo: per es. nel complesso SCF una proteina scaffold, cullin, adattatrice tiene insieme il modulo che lega E2 e quello che riconosce il substrato (F box). 10
La maggior parte delle proteine con vita corta sono degradate dalla via ubiquitina/proteasoma. Come avviene il riconoscimento del substrato? La maggior parte dei substrati contengono un amino gruppo alfa libero. Secondo la N-end rule gli aa basici (Arg, Lys, His) destabilizzano l N- terminale che viene riconosciuto da una speciale ubiquitina ligasi. Tutte le proteine sono inizialmente sintetizzate con una metionina come residuo N-terminale che è molto stabile per la regola N-end. Speciali proteasi remuovono questa metionina, lasciando spesso un altro residuo stabile, successivamente altre proteasi rimuovono un frammento N-terminale lasciando un arginina N-terminale, un residuo destabilizzante. Molte altre modificazioni post-traduzionali del substrato determinano il riconoscimento del substrato da parte delle E3. 11