DUBs (deubiquitinating enzymes)

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1 DUBs (deubiquitinating enzymes) VOLANTE ANDREA [DIAPOSITIVA 1] INTRO L ubiquitinazione è un processo di modificazione posttrascrizionale delle proteine che richiede l instaurarsi di un legame covalente tra una molecola (o più molecole) di ubiquitina e le proteine target. Le proteine ubiquitinate subiscono sia modificazioni conformazionali, sia modificazioni per ciò che riguarda la loro attività che localizzazione che permettono loro di svolgere diverse funzioni. La specificità del meccanismo dell ubiquitinazione è regolata dalle differenti combinazioni degli enzimi E2 ed E3 che compongono il complesso multienzimatico promuovente appunto l ubiquitinazione. Come esistono gli enzimi che promuovono l ubiquitinazione su distinti substrati sono presenti anche enzimi che favoriscono il processo inverso. Questi enzimi sono chiamati DUB (enzimi deubiquitinanti) e sono enzimi che idrolizzano il legame che viene ad instaurarsi tra la Gly76 della molecola di ubiquitina e il gruppo ε-amminico di una Lys presente sulla proteina. La scoperta di questi enzimi ha permesso di considerare il meccanismo dell ubiquitinazione come un processo reversibile simile a quello della fosforilazione, e di evidenziare come i DUBs possano rivelarsi importanti enzimi regolatori. [DIAPOSITIVA 2] FAMIGLIA DUBs (1) Le famiglie di DUBs maggiormente caratterizzate e studiate. Famigli UCH (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase). Il nome della famiglia è dovuto all attività idrolizzante di piccole ammidi ed esteri al C-terminale dell ubiquitina. L analisi delle sequenze amminoacidiche provenienti da diversi organismi ha mostrato: 1) la presenza comune di un dominio catalitico di 210aa caratterizzato dalla presenza di 4 box altamente conservati. 2) il dominio catalitico delle UCH ha una marcata omologia di struttura con quello della Cathepsin B (una proteasi dei tioli) 3) il dominio catalitico è costituito da tre amminoacidi fondamentali per l attività enzimatica: Cys95 (3 box), His169 e Asp184 (4 box) [UCH-L3].

2 DUBs (deubiquitinating enzymes) Proteasi che idrolizzano il legame tra le proteine e il gruppo C-terminale Gly76 dell ubiquitina. L Ubiquitinazione è un processo REVERSIBILE SIMILITUDINE tra UBIQUITINAZIONE e FOSFORILAZIONE

3 Famiglia UCH Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolases Dominio catalitico: 210 aa (4 blocchi altamente conservati) Triade catalitica : Cys95, His169, Asp184. Omologia strutturale del dominio catalitico

4 Famiglia UBP Ubiquitin-specific processing proteases Domini catalitico: inserzioni di lunghezza variabile 2 regioni di omologia: Cys box, His box 2 nuove famiglie di DUBs Famiglia JAMM/MPN + Famiglia OTU

5 ruoli delle DUBs Disassemblamento a livello del proteasoma delle catene polimeriche di ubiquitina DUBs: PA700: isopeptidasi associata al complesso proteasomico 26S Forma intermedi di ubiquitina Ubp4p (Doa4p): rimuove il frammento di proteina dalla catena di ubiquitine Isopeptidasi T: idrolizza la catena forma monomeri di ubiquitina Regolazione Monoubiquitinazione/Deubiquitinazione di FANCD2

6 FANCD2 - Monoubiquitinazione è necessaria per una efficiente riparazione dei danni a livello del DNA - Mutazioni inattivanti del gene FANCD2 causano UNA FORMA della sindrome dell anemia di Fanconi Anemia di Fanconi (FA) è una rara sindrome autosomica recessiva caratterizzata da -anomalie congenite multiple -predisposizione ai tumori sia solidi che ematici

7 Osservate diverse mutazioni genetiche che causavano tutte l anemia di Fanconi FANCA FANCC FANCE FANCF FANCG FANCL BRCA2 eterogeneità genetica della sindrome Si è ipotizzato che tutti i geni coinvolti possano codificare per proteine appartenenti ad un medesimo pathway caratterizzante l anemia di Fanconi

8 Pathway Il complesso proteico FA (A/C/E/F/G/L) e necessario per la monoubiquitinazione di FANCD2? FANCD2 MONOUBIQUITINAZIONE FOSSFORILAZIONE Attività ubiquitina ligasica? - FANCL (complesso di Fanconi) - BRCA1 proteina che eterodimerizza con BARD1

9 FANCD2 - Si trova monoubiquitinata (FANCD2-L) durante la fase S - FANCD2-L scompare una volta che la cellula esce dalla fase S (MA è transitoriamente presente quando la cellula è stata esposta a danni del DNA) -Le forme FANCD2-L e FANCD2-S sono entrambi stabili e non soggette a degradazione proteasomale Ipotizzata la presenza di un enzima deubiquitinante di FANCD2 Rimuove l ubiquitina una volta avvenuta la riparazione del DNA danneggiato

10 USP1Ubiquitin-specific protease 1 1- Identificata USP1 come enzima regolatore di FANCD2-L shrnas per silenziare 55 geni umani di DUBs in cellule di U2-OS 2- USP1 è una proteina regolata dal ciclo cellulare -Livelli di USP1 sono alti nella fase S - Rimangono alti fino a quando FANCD2-L non scompare nella tarda fase S

11 3- USP1 localizza nella cromatina e associa con FANCD2 - Localizzazione di FANCD2-L e USP1 nella cromatina -Immunoprecipitazione di FANCD2-USP1 4- Inibizione di USP1 protegge le cellule dalle aberrazioni cromosomiche indotte da mitomicyn C (MMC) silacz siatr siusp1 contollo

12 CONCLUSIONE Che RUOLO ha USP1 nel riparo del DNA? MUTAZIONE INATTIVANTE USP1 FUNZIONE PROTETTIVA verso DANNI causati al DNA MUTAZIONE ATTIVANTE USP1? che determini una deubiquitinazione FANCD2 prima che il DNA venga riparato NO RIPARAZIONE DNA? ANEMIA di FANCONI? Necessaria la Ricerca di Mutazioni ATTIVANTI

13 L enzima che non è legato al susbtrato presenta il sito catalitico nascosto da 2 loop formati dai residui 9-12 e Il legame con l ubiquitina comporta uno spostamento del loop dei residui 9-12 e contemporaneamente la Gln89 forma un sito di attacco per l anione ossido che lega anch esso il substrato permettendo il ri-arrangiamento del loop (90-94) e l esposizione del sito catalitico. [DIAPOSITIVA 3] FAMIGLIA DUBs (2) Famiglia UBP (ubiquitin-specific processing protease). È una famiglia di enzimi molto distanti tra loro e possiedono solo due regioni altamente conservate: Cys box e His box. Il dominio catalitico presenta inserzioni di amminoacidi di lunghezza variabile che non inficiano l attività enzimatica dell enzima stesso ma potrebbero conferire una specificità per il substrato. [DIAPOSITIVA 4] RUOLI DELLE DUBs I ruoli delle DUBs sono molteplici (fig.) Proprotein processing: a) processo proteolitico dei prodotti genici dell ubiquitina, b) per permettere l assemblamento corretto delle due subunità del ribosoma mediante la rimozione dell ubiquitina. Salvage: per il recupero delle ubiquitine intrappolate da reazioni con piccole molecole cellulari nucleofile. Disassembly of degradation intermediate: in tutte le cellule, le proteine sono costantemente degradate mediante processi selettivi, per impedire l accumulo di quelle proteine anormali o non necessarie e per facilitare il riciclaggio degli amminoacidi. L ubiquitina è una molecola importante per questi processi, infatti, l attacco di un catena polimerica di ubiquitina ad un proteina è fondamentale per promuovere l indirizzamento della proteina verso la via di degradazione del proteasoma. Solo una volta dopo avvenuta la degradazione della proteina, è necessario disassemblare la catena poliubiquitinata. Il metabolismo della catena di ubiquitine è una delle funzioni meglio caratterizzate degli enzimi di deubiquitinazione. Un attività isopeptidasica è associata alla PA700 una subunità del complesso proteasomico 26S; PA700 accorcia la catena di poliubiquitine dall estremità distale per formare intermedi della catena di ubiquitina. Ubp4p (Doa4), un altro enzima, rimuove invece il frammento di peptide dalla catena poliubiquitinata. Isopeptidasi T invece idrolizza la catena e gli intermedi di ubiquitine per formare i monomeri della molecola.

14 Editing of ubiquitinated proteins: cura dello stato di ubiquitinazione delle proteine sia poli- che mono-ubiquitinate. Questa ultima funzione è importante per ciò che riguarda il meccanismo di regolazione dell ubiquitinazione. [DIAPOSITIVA 5] FANCD2 La proteina FANCD2 è una proteina osservata essere monoubiquitinata ed andare incontro a regolazione. La monoubiquitinazione di FANCD2 risulta necessaria per una normale ed efficiente riparazione dei danni a livello del DNA, infatti, una volta ubiquitinata FANCD2 migra nei foci nucleari dove interagisce con BRCA1, BRCA2, e la ricombinasi RAD51 (le alterazioni dei meccanismo di riparazione del DNA possono influenzare la suscettibilità al cancro). Mutazioni inattivanti di FANCD2 portano ad una forma dell ANEMIA DI FANCONI. L anemia di Fanconi (FA) è una sindrome autosomica recessiva suscettibile al cancro, ed è caratterizzata da anomalie congenite multiple tra le quali aberrazioni cromosomiche quali rotture dei cromosomi o la formazione di cromosomi triradiali e quadriradiali (1) e da una predisposizione alla comparsa di tumori sia solidi che ematici (2). Le cellule soggette alla sindrome di Fanconi risultano essere sensibili ad agenti crosslinkanti del DNA [es. mitomicina C, Raggi Ionizzanti( IR)]. [DIAPOSITIVA 6] ETEROGENEITA GENETICA DELLA SINDROME DI FANCONI Lo sviluppo della sindrome di FA non solo è determinata dalle mutazioni recessive del gene di FANCD2, ma anche da mutazioni di altri geni quali FANCA, FANCC, FANCE, FANCG, FANCF, FANCL e BRCA2. Diversi sono i geni le cui mutazioni provocano l insorgere della sindrome, in qualche modo i prodotti di tali geni debbono interagire tra loro in un pathway medesimo. Infatti, i prodotti di FANCA, FANCC, FANCE, FANCG, FANCF e FANCL danno luogo alla formazione di un complesso multiproteico FA studiato essere indispensabile per la ubiquitinazione di FANCD2.

15 [DIAPOSITIVA 7] PATHWAY Monoubiquitinazione di FANCD2 (Lys 561). a) I danni del DNA attivano ATM che a sua volta attiva ATR o altre proteine chinasiche. b) ATM attivato può sua volta attivare il complesso multiproteico dell anemia di Fanconi. Mentre contemporaneamente ATM/ATR promuovono le fosforilazioni di BRCA1 (che eterodimizza con BARD1) e di FANCD2. c) Il complesso multiproteico di FA permette la monoubiquitinazione di FANCD2, molto probabilmente attraverso l attività ubiquitina ligasica di FANCL. d) FANCD2 monoubiquitinata trasloca nei foci nucleari dove avviene la riparazione del DNA. e) BRAC1-BARD1 è un eterodimero richiesto per una efficiente accumulo di FANCD2 nei foci nucleari f) BRAC1-BARD1 colocalizza anch esso nei foci Fosforilazione di FANCD2 (Ser 222). La fosforilazione di FANCD2 avviene per merito del complesso ATM. La fosforilazione di della Ser 222 di FANCD2 è necessaria per promuovere l arresto cellulare nella fase S. Attività ubiquitina ligasica. Sia la subunità FANCL del complesso multiproteico di FA che l eterodimero BRCA1-BARD1 possiedono un dominio ring finger con attività enzimatica simile all ubiquitina ligasi E3. Ma la monoubiquitinazione di FAND2 sarebbe però dovuta a FANCL, perché è stato osservato come, anche alla presenza di mutazioni bialleliche di BRCA1, FANCD2 monoubiquitinata era presente. Si ipotizza per l eterodimero BRCA1-BARD1 un ruolo nella regolazione della localizzazione o della stabilità di FANCD2. [DIAPOSITIVA 8]?? - FANCD2 monoubiquitinata (FANCD2-L) è presente durante la fase S del ciclo cellulare - FANCD2-L scompare quando la cellula esce dalla fase S

16 - Le forme di FANCD2-L e FANCD2-S (non ubiquitinata) sono entrambi stabili e non soggette a degradazione proteasomale. [DIAPOSITIVA 9] USP1 Si è ipotizzata la presenza di un enzima deubiquitinante (DUB) necessario per regolare i meccanismi di riparazione attivati da FANCD2. E si è supposto che l inibizione di questo enzima regolatore avrebbe dovuto aumentare la presenza della forma FANCD2-L. Attraverso l utilizzo di una libreria di plasmidi, codificanti per shrnas diretti verso 55 DUB umane, attuando un immunoblot con Ab specifici per FANCD2, si è identificato un enzima deubiquitinante, USP1, la cui soppressione portava ad un aumento significante dei livelli di FAND2-L. In più, le inibizioni dell espressione di USP1 non causano né alterazioni della distribuzione del ciclo cellulare né ritardi della fase S. USP1 è una proteina regolata dal ciclo cellulare. I livelli di USP1 sono alti nella fase G1/S e rimangono alti fino a quando i livelli di FANCD2-L scompaiono nella tarda fase S. Quindi la presenza di USP1 potrebbe essere indispensabile per [DIAPOSITIVA 10] USP1 (2) USP1 localizza nella cromatina ed associa con FANCD2. - FANCD2-L viene trova principalmente in frazioni della cromatina in cellule trattate con mitomicyn C (MMC), mentre USP1 localizza nella cromatina sia nelle cellule trattate con MMC sia in quelle non trattate. FANCD2-L si lega alla cromatina attivando i meccanismi di riparazione mentre USP1 sembrerebbe promuove la deubiquitinazione di FANCD2, e quindi un distaccamento di quest ultima dalla cromatina, per far sì che avvenga una corretta riparazione. - attraverso analisi di immunoprecipitazione è stato osservato che FANCD2 si associa con USP1. Inibizione di USP1 protegge le cellule dalle aberrazioni cromosomiche indotte da (MMC). Nel tentativo di comprendere le conseguenze dell inibizione di USP1 in una corretta riparazione del DNA, si è inibita l espressione di USP1 attraverso RNAi, in cellule trattate con MMC, andando ad analizzare successivamente le aberrazioni cromosomiche presenti nelle cellule. Si sono usati RNAi diretti al silenziamento di LacZ (silacz = controllo), ATR una proteina coinvolta nella monoubiquitinazione di FANCD2 (siatr) e di USP1 (siusp1). Contro intuitivamente, in cellule trattate con MMC, l inibizione di USP1 riduceva il numero di aberrazioni

17 cromosomiche in confronto al controllo. Questo esperimento mette in evidenza come la deplezione di USP1 promuova la riparazione, che quindi sembra non essere assolutamente indispensabile. [DIAPOSITIVA 11] CONCLUSIONE Dagli esperimenti specifici su USP1 nascono dubbi riguardanti l effettiva utilità e funzione dell enzima. Alterazioni di USP1 potrebbero cambiare la sensibilità dei meccanismi di riparazione. Mutazioni inattivanti di USP1 sembrano avere una funzione protettiva verso i danni causati da agenti crosslinkanti. Mutazioni attivanti? Non sono ancora state studiate.

18 REFERENZE: - Regulation of ubiquitin-dependent processes by deubiquitinatin enzymes, Wilkinson. - Regulation of the Fanconi anemia pathway by monoubiquitination, Gregory, et al. - The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway, Nijman et al.; Molecular Cell. - Tracing the network connecting BRCA and Fanconi anemia proteins, Venkitaraman. - DUBing down a tumor suppressor, Venkitaraman.