DETERMINAZIONE SPERIMENTALE DEI pka E DEL pi DI UN AMMINOACIDO DIPROTICO: CURVA DI TITOLAZIONE DELLA GLICINA COO - + Zwitterione

DETERMINAZIONE SPERIMENTALE DEI pka E DEL pi DI UN AMMINOACIDO DIPROTICO: CURVA DI TITOLAZIONE DELLA GLICINA p 1 2.34 5.97 9.6 14 pka1 pka2 pi COO + 3 N- C + 3 N- C 2 N- C AA +1 Catione AA 0 Zwitterione AA -1 anione Vale la regola che a valori di p superiori al punto isoelettrico l amminoacido diprotico è prevalentemente nella forma ionica negativa (completamente deprotonata) A valori di p inferiori al p. isoelettrico è prevalente la sua forma ionica positiva (completamente protonata) Il punto isoelettrico corrisponde ad un punto di equivalenza della curva di titolazione mentre i pka corrispondono a punti di semiequivalenza

COO + 3 N C = COO + 3 N C p = pka 1 abbiamo un uguale concentrazione delle forme ioniche AA +1 e AA 0 p > pka 2 prevale la forma AA -1 13 p 7 COO 2 N C 0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 COO 2 N C = COO + 3 N C p = pka 2 abbiamo un uguale concentrazione delle forme ioniche AA 0 e AA -1 p < pka 1 prevale la forma AA +1 COO + 3 N C Moli O - /mole di amminoacido A valori di p compresi fra il pka1 e il pka2 prevale la forma ionica AA 0 e raggiunge la massima concentrazione a p uguale al p. Isoelettrico COO + 3 N C

1 punto di semiequivalenza. Ordinata: p uguale al pka 1 Ascissa: 0.5 moli di titolante/mole di AA COO + 3 N C = COO + 3 N C 13 p 7 0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 Moli O - /mole di amminoacido 1 punto di equivalenza. Ordinata: p uguale al pi Ascissa: 1 mole di titolante/mole di AA COO 2 N C = COO + 3 N C 2 punto di semiequivalenza. Ordinata: p = pka 2 Ascissa: 1.5 moli di titolante/mole di AA. COO + 3 N C

GLI AMMINOACIDI FUNZIONANO DA TAMPONI ESISTONO ALMENO DUE REGIONI NELLA SCALA DEL p IN CUI L AMMINOACIDO è UN BUON TAMPONE Es.: Glicina: due gruppi dissociabili che funzionano da acidi deboli in due diverse zone della scala del p α-coo (pka1 2.34) e α-n 3+ (pka2 9.60). (50% di AA - e AA 0 ) (50% di AA + e AA 0 ) In corrispondenza del pka si ha la massima capacità tamponante Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCIMICA DI LENINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2014 3 27

Ciascuno dei 2 gruppi dissociabili dell amminoacido ha capacità tamponante in un pka1 2.34 p = pka1 + log [AA0 ] [AA +1 ] intervallo di p p = pka ± 1 tra p 1.34 e p 3.34 la glicina funziona da tampone p = 1.34 = 2.34 + Log [AA 0 ]/[AA + ] Log [AA 0 ]/[AA + ] = -1 [AA 0 ]/[AA + ] = 10-1 = 1/10 a p 1.34 avremo il 90% di AA + e il 10% di AA 0 (cioè il 10% della glicina presenta il gruppo α-coo in forma deprotonata α- ) p = 3.34 = 2.34 + Log [AA 0 ]/[AA + ] Log [AA 0 ]/[AA + ] = 1 [AA 0 ]/[AA + ] = 10 1 = 10/1 a p 3.34 avremo il 10% di AA + e il 90% AA 0 (il 90% della glicina presenta il gruppo α-coo in forma deprotonata α- )

frazione molare (%) AA +1 100 90-50 - Entrambi i gruppi protonati AA 0 AA -1 [AA +1 ]= [AA 0 ] [AA 0 ]= [AA -1 ] 10-1.34 3.34 pka2 = 9.60 pka1 = 2.34

Il pka2 vale 9.60 (gruppo α-n 3+ ) quali sono i limiti della seconda regione tamponante della glicina? Quali forme ioniche della glicina sono coinvolte e in quale rapporto si trovano tra di loro in corrispondenza dei p limite della seconda regione tamponante?

frazione molare (%) pka2 9.60 la glicina funziona da tampone tra p 8.60 e p 10.60 p = 8.60 [AA -1 ]/[AA 0 ] = 10-1 = 1/10 p = 10.60 [AA -1 ]/[AA 0 ] = 10 1 = 10/1 AA +1 100 90-50 - Entrambi i gruppi protonati AA 0 AA -1 [AA 0 ]= [AA -1 ] 10-8.6 10.6 pka2 = 9.60

A che p si trova la soluzione di Glicina se il rapporto fra le sue forme ioniche AA 0 e AA +1 è 100:1 (~99% AA 0 e ~1% AA +1 )?

Se [AA 0 ]/[AA + ] = 100/1 (~99% AA0 e ~1% AA+1) [AA 0 ]/[AA + ] = 100/1 = 10 2 vuol dire che Log [AA 0 ]/[AA + ] = 2 Devo considerare la dissociazione dell α-coo (pka1 2.34) p = pka1 + log [AA0 ] [AA +1 ] p = 2.34 + 2 = 4.34 a p 4.34 (2 unità sopra il valore del pka1) avremo l ~1% di AA + e il ~99% AA 0 (il 99% della glicina presenta il gruppo α-coo in forma deprotonata α- )

AMMINOACIDO TRIPROTICO (3 gruppi ionizzabili): in soluzione saranno presenti 4 forme ioniche dell AA in equilibrio tra loro. Sono 3 i pka da considerare (α-carbossilico, α-amminico, catena laterale). Es.: Acido glutammico (Glu, E) AA +1 COO + 3 N C COO pka1 AA 0 AA -1 AA -2 + 3 N C COO pkar + 3 N C pka2 2 N C CATIONE - αcoo - αn 3 + (R) - COO ZWITTERIONE - α - αn 3 + (R) - COO ANIONE -1 - α - αn 3 + (R) - ANIONE -2 -α - αn 2 -(R) -

AA +1 COO + 3 N C COO pka2 = 9.67 p 10 8 7 6 pkar = 4.25 4 3.22 pka1 = 2.19 2 pka1 AA +1 AA 0 AA -1 AA -2 + 3 N C COO AA +1 = AA 0 pkar AA 0 =AA -1 AA 0 + 3 N C AA -1 = AA -2 AA -1 pka2 AA -2 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Moli di O - /moli amminoacido 2 N C Quante moli di O - devo aggiungere per avere l ac. glutammico al suo p. isoelettrico? 1 Come calcolo il punto isoelettrico di un amminoacido acido? pi = A quali valori di p avrò la massima concentrazione di AA +1, AA 0, AA -1, AA -2? pka1 + pkar 2 pi = (2.19 + 4.25)/2 =3.22

10 pka2 = 9.67 8 7 p 6 pkar = 4.25 4 pka1 = 2.19 2 QUALI SONO E QUANTE SONO LE REGIONI TAMPONANTI? Individuare gli intervalli di p Le regioni tamponanti sono 3: pka1 ± 1 (1.19-3.19); pkar ± 1 (3.25-5.25); pka2 ± 1 (8.67-10.67). 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Moli di O - /moli amminoacido

Come si dissociano i gruppi ionizzabili della tirosina (Tyr)? Quale sarà la forma ionica prevalente a p neutro? Disegnare su un grafico la curva di titolazione della Tyr (pka1 = 2.2; pka2 = 9.1; pkar = 10.1) Calcolare il suo punto isoelettrico e individuarlo sul grafico

Tyr: pka1 = 2.2; pka2 = 9.1; pkar = 10.1 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 0.5 1.5 2.5 moli O - / mole di Tyr