DETERMINAZIONE SPERIMENTALE DEI pka E DEL pi DI UN AMMINOACIDO DIPROTICO: CURVA DI TITOLAZIONE DELLA GLICINA COO - + Zwitterione

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Gilda Orlando
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1 DETERMINAZIONE SPERIMENTALE DEI pka E DEL pi DI UN AMMINOACIDO DIPROTICO: CURVA DI TITOLAZIONE DELLA GLICINA p pka1 pka2 pi 3 N- C 3 N- C 2 N- C AA +1 Catione AA 0 Zwitterione AA -1 anione Vae a regoa che a vaori di p superiori a punto isoeettrico amminoacido diprotico è prevaentemente nea forma ionica negativa (competamente deprotonata) A vaori di p inferiori a p. isoeettrico è prevaente a sua forma ionica positiva (competamente protonata) I punto isoeettrico corrisponde ad un punto di equivaenza dea curva di titoazione mentre i pka corrispondono a punti di semi-equivaenza

2 COO + 3 N C = + 3 N C p = pka 1 α- dissociato a 50%. [AA +1 ] = [AA 0 ] p > pka 2 prevae a forma AA p 7 COO 2 N C COO 2 N C = COO + 3 N C p = pka 2 α-n + 3 dissociato a 50%. [AA 0 ] = [AA -1 ] 0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 p < pka 1 prevae a forma AA N C Moi O - /moe di amminoacido A vaori di p compresi fra i pka1 e i pka2 prevae a forma ionica AA 0 e raggiunge a massima concentrazione a p uguae a p. Isoeettrico COO + 3 N C

3 1 punto di semiequivaenza. Ordinata: p uguae a pka 1 Ascissa: 0.5 moi di titoante/moe di AA + 3 N C = COO + 3 N C 13 p ,5 1,0 1,5 2,0 Moi O - /moe di amminoacido 1 punto di equivaenza. Ordinata: p uguae a pi Ascissa: 1 moe di titoante/moe di AA COO 2 N C = COO + 3 N C 2 punto di semiequivaenza. Ordinata: p = pka 2 Ascissa: 1.5 moi di titoante/moe di AA. COO + 3 N C

4 GLI AMMINOACIDI FUNZIONANO DA TAMPONI ESISTONO ALMENO DUE REGIONI NELLA SCALA DEL p IN CUI L AMMINOACIDO è UN BUON TAMPONE Es.: Gicina: due gruppi dissociabii che funzionano da acidi deboi in due diverse zone dea scaa de p α- (pka1 2.34) e α-n 3+ (pka2 9.60). (50% di AA - e AA 0 ) (50% di AA + e AA 0 ) In corrispondenza de pka si ha a massima capacità tamponante Neson Cox, I PRINCIPI DI BIOCIMICA DI LENINGER, Zanichei editore S.p.A. Copyright

5 Ciascuno dei 2 gruppi dissociabii de amminoacido ha capacità tamponante in un pka p = pka1 + og [AA0 ] [AA +1 ] intervao di p p = pka ± 1 tra p 1.34 e p 3.34 a gicina funziona da tampone p = 1.34 = Log [AA 0 ]/[AA + ] Log [AA 0 ]/[AA + ] = -1 [AA 0 ]/[AA + ] = 10-1 = 1/10 a p 1.34 avremo i 90% di AA + e i 10% di AA 0 (cioè i 10% dea gicina presenta i gruppo α- in forma deprotonata α- ) p = 3.34 = Log [AA 0 ]/[AA + ] Log [AA 0 ]/[AA + ] = 1 [AA 0 ]/[AA + ] = 10 1 = 10/1 a p 3.34 avremo i 10% di AA + e i 90% AA 0 (i 90% dea gicina presenta i gruppo α- in forma deprotonata α- )

6 frazione moare (%) AA AA 0 AA Entrambi i gruppi protonati [AA +1 ]= [AA 0 ] pka1 = 2.34

7 ESERCIZIO 1 I pka2 vae 9.60 (gruppo α-n 3+ ) quai sono i imiti dea seconda regione tamponante dea gicina? Quai forme ioniche dea gicina sono coinvote e in quae rapporto si trovano tra di oro in corrispondenza dei p imite dea seconda regione tamponante?

8 ESERCIZIO 2 A che p si trova a souzione di Gicina se i rapporto fra e sue forme ioniche AA 0 e AA +1 è 100:1 (~99% AA 0 e ~1% AA +1 )?

13 AMMINOACIDO TRIPROTICO (3 gruppi ionizzabii): in souzione saranno presenti 4 forme ioniche de AA in equiibrio tra oro. Sono 3 i pka da considerare (α-carbossiico, α-amminico, catena aterae). Es.: Acido gutammico (Gu, E) AA +1 3 N C C 2 C 2 pka1 AA 0 AA -1 AA -2 3 N C C 2 C 2 pkar 3 N C C 2 C 2 pka2 2 N C C 2 C 2 CATIONE - α - αn 3 + (R) - ZWITTERIONE - α - αn 3 + (R) - ANIONE -1 - α - αn 3 + (R) - ANIONE -2 -α - αn 2 -(R) -

14 AA +1 3 N C C 2 C 2 pka2 = 9.67 p pkar = pka1 = pka1 AA +1 AA 0 AA -1 AA -2 3 N C C 2 C 2 AA +1 = AA 0 pkar AA 0 =AA -1 AA 0 3 N C C 2 C 2 AA -1 = AA -2 AA -1 pka2 AA Moi di O - /moi amminoacido 2 N C C 2 C 2 Quante moi di O - devo aggiungere per avere ac. gutammico a suo p. isoeettrico? 1 Come cacoo i punto isoeettrico di un amminoacido acido? pi = A quai vaori di p avrò a massima concentrazione di AA +1, AA 0, AA -1, AA -2? pka1 + pkar 2 pi = ( )/2 =3.22

15 ESERCIZIO 3 Ac. gutammico 10 - pka2 = p pkar = pka1 = QUALI SONO E QUANTE SONO LE REGIONI TAMPONANTI? Individuare gi intervai di p Moi di O - /moi amminoacido

ISTIDINA 3 N- C C 2 C N C C N + - 3 N- C C 2 C N C C N + - 3 N- C C 2 C N + C C N pka1 pkar pka2-32 N- C C 2 C N + C C N AA +2 AA +1 AA 0 AA -1 I gruppo imidazoico è un ibrido di risonanza + 3

16 ISTIDINA 3 N- C C 2 C N C C N N- C C 2 C N C C N N- C C 2 C N + C C N pka1 pkar pka2-32 N- C C 2 C N + C C N AA +2 AA +1 AA 0 AA -1 I gruppo imidazoico è un ibrido di risonanza + 3 N C C 2 C N + C C N + 3 N C C 2 C N + C C N + 3 N C C 2 C N C C N + Quando è carico, a carica + è deocaizzata fra i due atomi di azoto. Questo rende aneo imidazoico poco propenso a riasciare +

AA +1 + 3 N C C 2 C N + C C N pk R = 6,0 + 3 N C C 2 C N C C N AA0 È un ottimo tampone ne ambiente ceuare, Forme ioniche a p 7.

17 AA N C C 2 C N + C C N pk R = 6,0 + 3 N C C 2 C N C C N AA0 È un ottimo tampone ne ambiente ceuare, Forme ioniche a p 7.0: ~10 % dea forma AA +1 (imidazoo protonato) e ~90% di quea AA 0 (imidazoo deprotonato) (p 7.0 = pk R + 1) La catena R di un residuo di is che fa parte di una proteina può essere sia protonata che deprotonata >>> i suo pk R può variare, dipende dae condizioni che si creano ne microambiente in cui si trova.

18 3 N- C C 2 C N C C N N- C C 2 C N C C N N- C C 2 C N + C C N pka1 pkar pka2-32 N- C C 2 C N + C C N AA +2 AA +1 AA 0 AA p 6 4 pkar = 6,0 AA +1 AA 0 =AA +1 pka2 = 9.17 AA 0 AA 0 =AA -1 AA -1 pi = 7,59 pi = pkar + pka2 2 pi = (6,0 + 9,17)/ 2 pi = 7,59 pka1 = 1,82 AA 2 +2 =AA +1 AA Moi di O - /moi amminoacido

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