PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA

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1 ISTRUZIONI PER L USO TERRENI DIPSLIDE PRONTI PER L USO DA Rev.: luglio 2003 BD BBL Dermatoslide USO PREVISTO BBL Dermatoslide è un sistema di vetrini a due lati per la rilevazione e l isolamento di funghi patogeni da infezioni superficiali di cute, capelli e unghie. PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA Metodica microbiologica I funghi svolgono un ruolo primario nelle infezioni della cute e degli organi a essa adiacenti, come per esempio capelli e unghie. Come agenti infettivi si riscontrano più frequentemente ma non esclusivamente funghi miceliali come Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum. Anche specie di lieviti come Candida albicans possono essere causa di infezioni cutanee superficiali. Per consentire una corretta identificazione e terapia, è necessario usare terreni di isolamento selettivi e non selettivi per la rilevazione degli agenti interessati. Il terreno 1 è una Dermatophyte Test Medium Agar modificato secondo Taplin per la rilevazione di dermatofiti, in particolare, ma non esclusivamente, Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum spp. In questo terreno, i peptoni forniscono l azoto e sono la fonte dei prodotti alcalini, prodotti dai dermatofiti. 1 La metabolizzazione dei peptoni in prodotti alcalini determina il viraggio dell indicatore rosso fenolo dal giallo al rosso. Il glucosio viene aggiunto come sostanza nutritiva e per consentire l acidificazione da parte dei funghi in grado di usare prevalentemente glucosio. La maggior parte dei funghi non dermatofiti, inclusi lieviti e muffe (se in grado di crescere su questo terreno), utilizza il glucosio. Ciò determina la formazione di acido non associata al viraggio del rosso fenolo, indicatore di ph. 2,3 La cicloeximide è un inibitore per muffe e lieviti non patogeni. Cloramfenicolo e gentamicina sono inibitori antibatterici. Pochi microrganismi, quali saprofiti, lieviti e batteri, sono in grado di crescere su questo terreno e determinare il viraggio dal rosso al giallo, ma sono facilmente riconoscibili grazie alla morfologia delle colonie che li caratterizza. Il terreno 2 è un agar malto per la rilevazione dei lieviti. Questo terreno viene usato per la rilevazione di tutti i tipi di funghi, inclusi muffe e lieviti. L estratto di malto contiene tutte le sostanze nutritive necessarie per supportare la crescita dei funghi. Il basso ph del terreno determina una inibizione parziale completa dei batteri contaminanti, ma è ben tollerato dai funghi. 4,5 BBL Dermatoslide è usato per l isolamento primario dei funghi, specialmente dermatofiti, da svariate infezioni superficiali. Può anche essere usato come terreno di trasporto dall ambulatorio del medico al laboratorio d analisi. REAGENTI BBL Dermatoslide Formula* per L di acqua purificata Terreno 1 Terreno 2 Digerito pancreatico di caseina 15,0 g Estratto di malto 30,0 g Digerito papaico di farina di soia 5,0 Agar 18,0 Cloruro di sodio 5,0 ph 4,0 ± 0,2 Agar 20,0 Glucosio 10,0 Rosso fenolo 0,2 Cicloeximide 0,5 Cloramfenicolo 0,1 Gentamicina 0,1 ph 5,5 ± 0,1 *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance. DA

2 PRECAUZIONI. Esclusivamente per uso professionale. Non usare i vetrini se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore, essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento. In caso di impiego di BBL Dermatoslide come terreno di trasporto dall ambulatorio del medico al laboratorio d analisi, rispettare le normative locali vigenti in materia di spedizione di campioni clinici. Per le procedure di manipolazione in asepsi, i rischi biologici e lo smaltimento dei prodotti usati, consultare il documento ISTRUZIONI GENERALI PER L USO. Durante la raccolta e la manipolazione dei campioni e dei vetrini positivi contenenti agenti infettivi, indossare guanti protettivi. CONSERVAZIONE E VITA UTILE Al ricevimento, conservare i vetrini BBL Dermatoslide al buio a C nella confezione originale sino al momento dell uso. Evitare congelamento, correnti, oscillazioni di temperatura e surriscaldamento. I vetrini sigillati, prelevati da confezioni aperte da 10 vetrini, possono essere usati fino alla data di scadenza. Una volta aperti, usare immediatamente i vetrini. CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL UTENTE Preparare le sospensioni dei ceppi sottoelencati in modo da ottenere lo standard McFarland 0,5. Per ciascun microrganismo, preparare una provetta (abbastanza grande da consentire l introduzione di un supporto agar BBL Dermatoslide) con ml di soluzione fisiologica sterile e dispensare 1 ml della suddetta sospensione del ceppo. Aprire un vetrino BBL Dermatoslide, rimuovere il supporto agar, immergerlo brevemente nella sospensione del ceppo da testare e procedere come descritto nella sezione Procedura del test per campioni liquidi. Incubare per 5 7 giorni a 35 ± 2 C. Verificare le superfici agar per esaminare la crescita come descritto nella sezione Risultati e interpretazione. Ceppi Terreno 1 Terreno 2 Trichophyton mentagrophytes * ATCC 9533 Candida albicans ATCC Candida glabrata Inibizione parziale - completa ATCC 2001 Aspergillus niger Inibizione completa ATCC Pseudomonas aeruginosa Inibizione completa Inibizione parziale - completa ATCC Enterococcus faecalis Inibizione parziale - completa Inibizione parziale - completa ATCC Staphylococcus aureus Inibizione completa Inibizione parziale - completa ATCC Non inoculato Giallo, trasparente Incolore ambra chiaro leggermente opaco * Notare che la crescita di dermatofiti su questo terreno può essere più debole o richiedere un tempo maggiore rispetto al terreno 1. PROCEDURA Materiali forniti BBL Dermatoslide. Microbiologicamente controllato. Materiali non forniti Terreni di coltura accessori, reagenti, apparecchiature di laboratorio e dispositivi per la raccolta descritti. DA

3 Tipi di campioni BBL Dermatoslide può essere usato per tutti i campioni sospettati di contenere funghi che causano infezioni di cute, capelli, unghie, ecc. Raccolta dei campioni, inoculo e procedura del test Prima dell uso, controllare visivamente le superfici agar per verificare la sterilità, lasciando BBL Dermatoslide sigillato. Etichettare la provetta riportando il nome del paziente, il numero del campione e la data di inoculo. Prima dell inoculo, rimuovere il vetrino dalla provetta in plastica, senza toccare le superfici agar. Pelle - Pulire il sito interessato con alcol isopropilico o etilico al 70% prima di rimuovere le squame cutanee. Per la raccolta dei campioni, usare sempre strumenti sterili. Rimuovere le squame da lesioni secche e sfogliate raschiando con un bisturi dai bordi infiammati verso la cute sana. I bisturi monouso possono facilmente ferire la pelle (è preferibile usare soltanto il retro della lama). Raschiare accuratamente superfici estese e raccogliere la maggior quantità possibile di materiale. In caso di lesioni acute infiammate o vescicolari, rimuovere accuratamente la pelle della vescica con forbici e pinze. Porre in coltura con il contenuto della vescica e, se possibile, le squame dell area circostante. In caso di processi granulomatosi o infiltrati, raccogliere il materiale in profondità e dalle pliche cutanee con un cucchiaino affilato o una lancetta per vaccinazione. Raccogliere il materiale su un pezzo di carta da filtro o direttamente sul vetrino BBL Dermatoslide. Se per la raccolta dei campioni si adotta la tecnica della replica, raschiare accuratamente gli strati cutanei superficiali con uno strumento affilato e quindi premere delicatamente le superfici del vetrino BBL Dermatoslide contro il sito cutaneo da controllare, iniziando con il terreno 1. Capelli - Con una pinzetta, staccare la radice di un capello opaco, privo di lucentezza. I capelli infetti si rompono e cadono molto più facilmente di quelli sani. In caso di impiego di una lampada di Wood, raccogliere i capelli fluorescenti, anche se alla luce solare appaiono sani. Se appaiono i cosiddetti punti neri, staccare il capello infetto dal bulbo usando il bordo di un bisturi. Non usare un capello tagliato come campione. Distribuire il capello su entrambi i terreni del vetrino. Premere delicatamente il capello sull agar con le pinzette. Unghie - In caso di infezione subungueale, rimuovere con forbici, limetta o bisturi tutte le parti superficiali dell unghia macroscopicamente deformate. Prelevare quindi frammenti di unghia dal letto ungueale. In caso di infezione superficiale, raschiare frammenti ungueali o piccoli particolati dalla superficie del corpo dell unghia. Non inoculare il vetrino BBL Dermatoslide con grossi pezzi delle unghie estratte. È meglio usare una fresa da unghie. Inoculare entrambi i lati del vetrino con il campione. Campioni prelevati su tamponi o con pinzette - Con un tampone sterile o pinzette sterili, distribuire uniformemente il materiale su entrambi i terreni agar (cominciando dall agar 1). Premere delicatamente le particelle più grandi sull agar con le pinzette per consentire il contatto tra il campione e la superficie agar. Notare che i tamponi prelevati da aree infette non sono campioni appropriati per la raccolta di dermatofiti. Per una ulteriore descrizione dei metodi di raccolta e dei tipi di campioni, consultare la documentazione appropriata. 3,4,6 Dopo la raccolta del campione e l inoculo, riporre il vetrino nella provetta e avvitare accuratamente il tappo. Incubare il vetrino BBL Dermatoslide a C per un massimo di 4 settimane. Verificare ogni giorno le superfici agar. Per ulteriori trattamenti o identificazione dei patogeni, il vetrino inoculato può anche essere inviato a un laboratorio speciale. Risultati Dopo l incubazione, controllare visivamente le superfici agar senza aprire la provetta. DA

4 Terreno 1 - la crescita di dermatofiti determina il viraggio del terreno sotto le colonie dal giallo al rosso, ancor prima dello sviluppo completo delle colonie. Con il procedere della crescita, l intero terreno assume una colorazione rossa rendendo visibile un micelio bianco, grigio o giallastro. Il campione è considerato negativo per i dermatofiti se dopo l incubazione su questo terreno non si osserva crescita. Sul terreno 1 possono crescere anche alcune muffe saprofitiche contaminanti. Tuttavia, in questo caso le colonie e il micelio appaiono normalmente prima del viraggio del terreno. Anche alcuni lieviti cicloeximide-resistenti (es. Candida albicans) possono determinare il viraggio del terreno dal giallo al rosso dopo una incubazione prolungata. I lieviti possono essere differenziati dai dermatofiti perché formano colonie uniformi senza micelio. Terreno 2 - su questo terreno, crescono tutti i funghi (inclusi i lieviti). i lieviti cicloeximidesensibili (Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida [=Torulopsis] glabrata e altri) appaiono normalmente come colonie uniformi sul terreno 2, senza crescere sul terreno 1. Notare che alcuni dermatofiti sul terreno 2 possono richiedere un incubazione più lunga rispetto al terreno 1 oppure crescere soltanto debolmente. Ricordare che per identificare completamente i patogeni isolati su questo dipslide, sono necessari ulteriori test, come per esempio procedure microscopiche e/o biochimiche. 3,4 La maggior parte di queste metodiche è disponibile soltanto in laboratori diagnostici e di norma non può essere eseguita nell ambulatorio di un medico. Tutti i dipslide con risultati dubbi o chiaramente positivi devono pertanto essere inviati a un laboratorio di analisi che esegue test micologici. Dopo l uso e prima dello smaltimento, tutte le provette usate e gli altri materiali contaminati devono essere sterilizzati in autoclave o inceneriti. Per dettagli, vedere il documento ISTRUZIONI GENERALI PER L USO. PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA BBL Dermatoslide è un dipslide a due lati adatto all isolamento di funghi e deve essere usato soltanto per il recupero di funghi da infezioni superficiali (cute, capelli e unghie). 2-5 Il terreno 1 è un terreno selettivo standard per i dermatofiti (es. Trichophyton, Epidermophyton, e Microsporum spp.), 3,5 sul quale crescono anche lieviti cicloeximide-resistenti, es. Candida albicans. Questo terreno è inibente per i batteri. Alcuni funghi patogeni, inclusi determinati ceppi di Microsporum, sono inibiti dalla cicloeximide contenuta in questo terreno. Tuttavia, questi ceppi crescono sul terreno 2 di questo dipslide. Il terreno 2 è un terreno di isolamento universale per funghi, incluse le specie saprofitiche. La maggior parte dei batteri eventualmente presenti come contaminanti o patogeni, è inibita dal basso ph di questo terreno. 2,6 Il numero di specie che crescono sui terreni di questo sistema di vetrini è elevato e non limitato a quelle citate nella sezione Risultati e interpretazione. BD BBL Dermatoslide non è destinato a essere usato per l isolamento primario e la conta. Per ulteriori test, e soprattutto in caso di sviluppo di colture miste sui terreni di questo sistema, eseguire subcolture su terreni in piastra appropriati per ottenere colture pure, indispensabili per una completa identificazione e per i test di sensibilità. 3,6 Non usare i dipslide per eseguire test di sensibilità con disco. BIBLIOGRAFIA 1. Taplin, D., et al Isolation and recognition of dermatophytes on a new medium (DTM). Arch. Dermatol. 99: MacFaddin, J. D Media for isolation-cultivation-identification- maintenance of medical bacteria, vol. 1, p Williams & Wilkins, Baltimore, MD. 3. Summerbell, R.C Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, and agents of superficial mycoses. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. DA

5 4. Larone, D.H. 1995: Medically important fungi - a guide to identification. 3rd edition. ASM Press, Washington. 5. Atlas, R.M Handbook of Microbiological media. CRC Press, Boca Raton, FL. 6. Sutton, D.A Specimen collection, transport, and processing: mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ BBL Dermatoslide N. di cat vetrini ULTERIORI INFORMAZIONI Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona. BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: , Fax: Reception_Germany@europe.bd.com BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès Le Pont de Claix/France Tel: Fax: BD, BD logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection Becton, Dickinson and Company DA