ISTRUZIONI PER L USO TERRENI DIPSLIDE PRONTI PER L USO DA Rev.: giugno BD BBL Mycoslide

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1 ISTRUZIONI PER L USO TERRENI DIPSLIDE PRONTI PER L USO DA Rev.: giugno 2003 BD BBL Mycoslide USO PREVISTO BBL Mycoslide è un dipslide a tre terreni per l individuazione di miceti, inclusi i lieviti, da campioni di urina, espettorato, lavaggio faringeo, feci e da svariati altri campioni su tampone. PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA Metodo microbiologico. I funghi filamentosi e i lieviti sono spesso patogeni e causano numerose infezioni locali e sistemiche di vario tipo in soggetti immunocompetenti e immunocompromessi. 1 Uno dei più comuni patogeni fungini è Candida albicans. C. albicans e il patogeno recentemente descritto C. dubliniensis, sono spesso la causa di infezioni localizzate e sistemiche in pazienti immunocompromessi. Le infezioni locali interessano principalmente le vie respiratorie, il tratto urogenitale e il tratto intestinale. La determinazione quantitativa dei lieviti isolati da questi siti corporei è importante in quanto la flora normale può includerne un basso numero, che aumenta tuttavia considerevolmente durante le infezioni. 1-5 BBL Mycoslide è un supporto di agar a tre terreni, ricoperto con due terreni per funghi e un terreno per l individuazione dei batteri presenti nel campione. L intero supporto di agar viene immerso in campioni liquidi e inoculato strisciando i campioni raccolti sui tamponi. Dopo l incubazione, è possibile eseguire il conteggio degli isolati e utilizzarli per altre analisi di differenziazione e identificazione e per il test della sensibilità. Il terreno 1 è un agar al malto per l individuazione di tutti i tipi di funghi, incluse le muffe e i lieviti. L estratto di malto contiene tutte le sostanze nutritive necessarie per supportare la crescita di funghi. Il basso ph del terreno induce un inibizione o parziale dei batteri contaminanti, mentre è ben tollerato dai funghi. Questo terreno viene usato per la determinazione quantitativa dei patogeni fungini. Il terreno 2 è un agar al malto arricchito con cicloesimide, un inibitore delle muffe saprofitiche e di alcuni lieviti. La maggior parte dei funghi patogeni, fra cui Candida albicans, non viene inibita su questo terreno. La cicloesimide inibisce tuttavia Cryptococcus neoformans e alcune specie di Candida (non C. albicans) che possono anche intervenire come agenti infettanti. Il terreno 3 è agar CLED (Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient), un terreno di coltura differenziale per l isolamento e il conteggio dei batteri nell'urina. Il terreno può essere utilizzato per l'isolamento di batteri da altri campioni, purché non siano microrganismi troppo esigenti. Su BBL Mycoslide, questo terreno viene usato principalmente per determinare la flora batterica associata. BBL Mycoslide trova impiego per l individuazione, l isolamento e il conteggio di funghi provenienti da svariati siti corporei e tipi di campione e può essere utilizzato anche come terreno di trasporto dallo studio medico ai laboratori di analisi. REAGENTI Formule* per litro di acqua purificata BBL Mycoslide Medium 1:Terreno 1 - Malt Agaragar al malto Terreno 2 - agar al malto con cicloesimide Terreno 3 - agar CLED Estratto di malto 30,0 g Estratto di malto 30,0 g Peptone di gelatina 4,0 g Agar 15,0 Agar 15,0 Peptone di caseina 4,0 ph 4,1 ± 0,2 Cicloesimide 1,0 Estratto di carne bovina 3,0 ph 4,1 ± 0,2 Lattosio 10,0 L-cistina 0,128 Blu bromotimolo 0,02 Agar 15,0 ph 7,3 ± 0,3 *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance. DA

2 PRECAUZIONI. Solo per uso professionale. Non usare i dipslide se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore, essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento. Durante l intera procedura, adottare tecniche sterili e rispettare le precauzioni di sicurezza contro i rischi biologici. Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO. Quando si utilizza BBL Mycoslide come terreno di trasporto da uno studio medico ad un laboratorio di analisi, rispettare le norme locali vigenti per il la spedizione di campioni infetti. CONSERVAZIONE E VITA UTILE Alla consegna, conservare BBL Mycoslide al buio a C nella confezione originale fino a immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento, surriscaldamento, essiccazione e fluttuazioni di temperatura. I vetrini possono essere inoculati sino alla data di scadenza (vedere l'etichetta sulla confezione) e incubati per i tempi di incubazione raccomandati. I vetrini non aperti prelevati da confezioni aperte possono essere usati fino alla data di scadenza se conservati in luogo pulito a C. Una volta aperti, i vetrini devono essere utilizzati immediatamente. CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL UTENTE Preparare una sospensione dei ceppi seguenti, equivalente lo standard McFarland 0,5. Per ciascun microrganismo, preparare una provetta (abbastanza larga da consentire l introduzione di un supporto di agar BBL Mycoslide) con ml di soluzione fisiologica sterile e dispensare sul ceppo 1 ml della sospensione sopra indicata. Aprire una confezione di BBL Mycoslide, rimuovere il supporto agar, immergerlo brevemente nella sospensione del ceppo da testare e procedere come descritto nella sezione Procedura del test per i campioni liquidi. Incubare a 35 ± 2 C per 2 5 giorni. Esaminare le superfici dell agar alla ricerca di segni crescita, come descritto nella sezione Risultati e interpretazione. Ceppi Terreno 1 agar al malto Terreno 2 agar al malto con cicloesimide Terreno 3 agar CLED Candida albicans Crescita Crescita Crescita ATCC Aspergillus niger Crescita Inibizione da parziale a Crescita ATCC E. coli Inibizione da parziale a Inibizione da parziale a Crescita ATCC Pseudomonas aeruginosa Inibizione da parziale a Inibizione da parziale a Crescita ATCC Enterococcus faecalis Inibizione da parziale a Inibizione da parziale a Crescita ATCC Staphylococcus aureus Inibizione da parziale a Inibizione da parziale a Crescita ATCC Non inoculate Color ambra chiaro Color ambra chiaro Colore gialloverdastro PROCEDURA Materiali forniti BBL Mycoslide. Microbiologicamente controllati. Materiali non forniti Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio occorrenti. Tipi di campioni BBL Mycoslide è adatto per l isolamento e il conteggio di funghi da campioni di urina (ottenuta dal flusso intermedio della minzione o mediante catetere, oppure tramite puntura vescicale DA

3 sovrapubica), espettorato, lavaggio faringeo, feci e da svariati altri campioni (es., tamponi vaginali). Non usare per l individuazione di infezioni batteriche. Prelievo e trattamento dei campioni Osservare le tecniche asettiche per il prelievo dei campioni. Seguire le procedure di prelievo standard. 1,6 L urina deve essere fresca o prelevata da non oltre 2 h. In alternativa i campioni di urina possono essere conservati in frigorifero (non oltre 24 h) per evitare la crescita eccessiva di agenti infettivi o di contaminanti prima dell'inoculazione. Espettorato - Aggiungere una parte di espettorato fresco, emesso con la tosse, ad una parte di soluzione di tripsina allo 0,25% e agitare con palline di vetro sterili per 45 min a 37 C. In alternativa, è possibile omogeneizzare l espettorato in un omogeneizzatore tipo Stomacher. Se è disponibile solo una piccola quantità di espettorato, è possibile utilizzarla senza pretrattamento. Lavaggi faringei - Centrifugare il liquido per 10 min a 2000 x g. eliminare la fase liquida, raccogliere il sedimento in 5 ml di soluzione di tripsina (0,25%) o di soluzione fisiologica sterile e agitare con palline di vetro sterili per 15 min a 37 C. Campioni di feci, freschi o refrigerati per non oltre 48 h. Omogeneizzare 1g di feci in 100 ml di soluzione di tripsina allo 0,25% o in soluzione fisiologica sterile con palline di vetro sterili per 15 min a 37 C. Tamponi - Prelevare il campione (es., dalla gola o dalla vagina) con un tampone e applicarlo direttamente senza pretrattamento, come decritto di seguito. Se l'inoculazione non viene effettuata subito dopo il prelievo, trasportare il tampone in un terreno di trasporto appropriato. 1,6 Procedura del test 1. Esaminare visivamente le superfici agar tenendo chiusa la provetta BBL Mycoslide. Eliminare i vetrini che evidenziano restringimento del terreno o contaminazione. 2. Etichettare la provetta con il nome del paziente, il numero del campione e la data di inoculazione. 3. Svitare il coperchio e rimuovere il vetrino dalla provetta di plastica, senza toccare le superfici agar. Inoculazione con campioni liquidi (es., urina o lavaggi faringei) 1. Immergere brevemente tre volte il vetrino nei campioni liquidi (es., urina o espettorato pretrattato, lavaggi faringei, ecc.) in modo che gli strati agar risultino mente inoculati con il liquido. Non lasciare il vetrino nel liquido per oltre 10 sec, in quanto questo potrebbe lavare via gli ingredienti dal terreno e/o ridurre l adesione del gel al supporto di plastica. 2. Se è disponibile solo un campione di volume ridotto, raccoglierlo con una pipetta o siringa sterile e sciacquare mente i tre terreni. 3. Lasciare sgocciolare il materiale in eccesso tenendo la punta del vetrino contro il bordo interno della provetta. 4. Usare un fazzolettino di carta per eliminare le ultime gocce dalla punta del vetrino. Rimettere con attenzione il vetrino nella provetta di plastica e chiuderla mente. 5. Incubare il vetrino a 30 ± 2 C per 48 h o inviarlo ad un laboratorio specializzato dopo l inoculazione. Per la crescita dei funghi filamentosi, come quelli responsabili delle infezioni delle basse vie respiratorie, potrebbe essere necessaria un'incubazione più prolungata. Inoculazione con campioni su tamponi Strisciare con attenzione il tampone sui tre terreni di coltura sul vetrino. Risultati e interpretazione Dopo l incubazione, rimuovere con attenzione il vetrino dalla provetta per interpretare i risultati. Durante l intera procedura di osservazione, si raccomanda di adottare tecniche asettiche e di indossare guanti chirurgici. Non toccare le superfici agar! Terreno 1 (agar malto) Questo terreno permette di rilevare il conteggio complessivo di tutti i funghi. I funghi filamentosi producono generalmente colonie con superficie ruvida (aerial mycelium). Le colonie sono spesso pigmentate (nero, grigio, blu-verde, giallastro e altri colori). Le specie di lieviti producono colonie di colore bianco - crema, lucide o opache, che generalmente hanno una superficie liscia DA

4 e somigliano a colonie batteriche. Per l'identificazione definitiva dei patogeni è necessario effettuare ulteriori test. 1 Per la determinazione quantitativa, confrontare la crescita effettiva sul vetrino con le figure di riferimento fornite nella sezione Guida per l interpretazione alla fine di questo documento. In caso di crescita rilevante e colonie molto numerose ( 10 5 ), è possibile che le superfici risultino mente coperte da un piano di crescita confluente. Per la rilevanza clinica dei conteggi di patogeni relativi ai campioni prelevati da vari siti corporei, consultare la tabella e la bibliografia. 1-5 Tipo di campione Numero di colonie di lieviti Normale 1) Incerto 2) Clinicamente significativo Urina della minzione (flusso intermedio) o del catetere: 10 3 /ml /ml >10 5 /ml Urina prelevata mediante puntura Qualsiasi comparsa di funghi è clinicamente significativa vescicale sovrapubica Espettorato 10 3 /ml /ml >10 5 /ml Lavaggi faringei >10 4 Feci 10 3 /g /g >10 5 /g 3) Campioni vaginali Qualsiasi comparsa di funghi è clinicamente significativa 1) I conteggi bassi possono essere significativi nei pazienti pretrattati o affetti da infezioni croniche. 2) Se possibile, ripetere la valutazione. 3) Occorre valutare con attenzione l'eventuale trattamento dei pazienti con conteggi elevati di lieviti nelle feci, in quanto questi si riscontrano spesso in pazienti pretrattati con antibiotici. Una volta terminata la terapia antibiotica, il conteggio dei lieviti generalmente si riduce fino a tornare normale. Nei pazienti immunocompromessi invece, anche i conteggi bassi possono essere indice di infezione. 1,3 Terreno 2 (agar malto con cicloesimide) Questo terreno assicura la soppressione dei funghi filamentosi cicloesamide-sensibili (es., muffe come Aspergillus). Questo additivo inibisce anche alcuni lieviti. La resistenza al cicloesimide è una caratteristica importante per la differenziazione dei funghi. Microrganismi 1) Rilevanza clinica e frequenza Cicloesimide-resistenti Candida albicans Importante patogeno; frequente C. dubliniensis Spesso riscontrato nei pazienti con HIV C. guilliermondiic. guilliermondii Raro, basso conteggio C. kefyr (=C. pseudotropicalis)c. kefyr (=C. pseudotropicalis) Raro, basso conteggio Altre specie Rare Cicloesimide-sensibili Candida tropicalis Raro, basso conteggio C. krusei Relativamente frequente, noto patogeno C. parapsilosis Raro, noto patogeno Candida (Torulopsis) glabrata Relativamente frequente, noto patogeno Cryptococcus neoformans Raro, importante patogeno Aspergillus, Penicillium e altri funghi Aspergillus può causare infezioni delle basse vie respiratorie o di altro tipo. Questi funghi sono anche reperibili come contaminanti. 1) Notare che la crescita o l'inibizione su questo terreno non è limitata alle specie elencate nella tabella qui sopra. I microrganismi elencati sono reperibili alquanto frequentemente nei campioni clinici. Per ulteriori informazioni, consultare la bibliografia. 1,7 Il terreno 3 (agar CLED) viene usato per la determinazione quantitativa dei conteggi batterici presenti nel campione. I conteggi batterici possono essere importanti per la valutazione del rapporto tra crescita batterica e fungina, ad esempio nelle feci. DA

5 Notare che per re l identificazione dei patogeni isolati su questo dipslide sono necessari altri test, come procedure biochimiche e/o microscopiche. 1 Questi metodi sono disponibili, per la maggior parte, solo nei laboratori diagnostici e generalmente non possono essere effettuati in uno studio medico. Di conseguenza, tutti i dipslide con risultati incerti o chiaramente positivi devono essere inviati ad un laboratorio di analisi attrezzato per test micologici. Dopo l uso e prima dell eliminazione, tutte le provette usate e altri materiali contaminati devono essere sterilizzati in autoclave o bruciati in un inceneritore. Per ulteriori informazioni, vedere ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO. PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA BBL Mycoslide trova impiego per l individuazione, l isolamento e il conteggio di funghi, inclusi i lieviti, da campioni di urina, espettorato, lavaggio faringeo e feci o da altri campioni. I terreni contenuti su questo dipslide sono quelli convenzionali comunemente usati per l isolamento dei 1, 8-10 rispettivi gruppi fungini e batterici. A volte, la crescita batterica sui terreni di coltura per funghi (terreno 1 e 2) di questo dipslide non viene soppressa mente. Nei casi incerti, occorre eseguire una colorazione Gram o con blu di metilene su campioni di colonie sospette. La maggior parte delle specie batteriche meno esigenti cresce sul terreno 3 (agar CLED). Tuttavia, questo terreno non supporta la crescita di microrganismi come le specie patogene di Neisseria, Haemophilus spp. e altre. Gli streptococchi beta-emolitici non crescono bene su questo terreno. Quindi, se si sospetta un infezione batterica causata da tali microrganismi, occorre includere nel terreno agar sangue o agar cioccolato. Su BBL Mycoslide, l agar CLED viene usato principalmente per determinare la flora batterica associata. Per una diagnosi specifica di infezioni batteriche, si raccomanda di usare altri sistemi e terreni. Per la diagnosi di infezioni batteriche da campioni di urina, usare i sistemi BBL Urotube. I campioni per l individuazione di infezioni batteriche da altri siti corporei devono essere trattati su terreni di coltura su piastra, come appropriato per il campione specifico. Sui terreni di questo dipslide possono crescere numerose specie, non solo quelle elencate nella sezione Risultati e interpretazione. L identificazione appropriata di molti microrganismi è possibile solo presso i laboratori di analisi. Di conseguenza, i vetrini devono essere inviati a tali laboratori dopo l inoculazione o dopo l inoculazione e l incubazione. L uso di BBL Mycoslide è indicato per l'isolamento primario e il conteggio. Per altri test, specialmente nel caso di colture miste sui terreni di questo sistema, occorre eseguire subcolture su terreni appropriati su piastra per ottenere le colture pure necessarie per la identificazione e per i test di sensibilità. 1 I dipslide non devono essere utilizzati per eseguire i test di sensibilità su dischi. REFERENCES 1. Fromtling, R.A. (section editor) Mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 2. Halle, E., et al Genitalinfektionen Teil I und II. In: Mauch, H., Lüttiken, R., and S. Gatermann (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol. 10 and 11. Urban & Fischer, Munich, Germany. 3. Kist, M., et al Infektionen des Darmes. In: Mauch, H., Lüttiken, R., and S. Gatermann (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol. 9. Urban & Fischer, Munich, Germany. 4. Podbielski, A., et al Infektionen des Mundes und der oberen Atemwege. In: Mauch, H. and R. Lüttiken (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol.13. Urban & Fischer, Munich, Germany. 5. Mauch, H., et al Infektionen der tiefen Atemwege Teil II. In: Mauch, H., Lüttiken, R., and S. Gatermann (eds.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, vol. 8. Urban & Fischer, Munich, Germany. 6. Sutton, D.A Specimen collection, transport, and processing: mycology. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. DA

6 7. Hazen, K.C New and emerging yeast pathogens. Clin. Microbiol. Rev. 8: MacFaddin, J. D Media for isolation-cultivation-identification- maintenance of medical bacteria, vol. 1, p Williams & Wilkins, Baltimore, MD. 9. Larone, D.H. 1995: Medically important fungi - a guide to identification. 3rd edition. ASM Press, Washington. 10. Atlas, R.M Handbook of Microbiological media. CRC Press, Boca Raton, FL. CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ BBL Mycoslide N. di cat vetrini ULTERIORI INFORMAZIONI Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona. BD Diagnostic Systems Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: , Fax: Reception_Germany@europe.bd.com BD Diagnostic Systems Europe Becton Dickinson France SA 11 rue Aristide Bergès Le Pont de Claix/France Tel: Fax: BD, BD logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company. Urotube and Mycoslide are trademarks of Becton Dickinson GmbH. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection Becton, Dickinson and Company DA

7 GUIDA PER L INTERPRETAZIONE (Terreno 1, agar malto) Per la determinazione quantitativa di conteggi cellulari (per i conteggi clinicamente importanti, vedere la sezione Risultati e interpretazione. DA