Diagnosi delle infezioni fungine

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1 UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA Diagnosi delle infezioni fungine

2 A) ESAME OBIETTIVO Le micosi vengono classificate in: Superficiali, quando interessano gli strati acellulari di pelle e annessi Cutanee o dermatofitiche, quando interessano lo strato cellulare, la cheratina e, a volte, il derma Sottocutanee Profonde L'esame obiettivo può essere accompagnato dalla osservazione delle lesioni alla luce di Wood e/o dall'esame istologico. B) RICERCA DELL'AGENTE ETIOLOGICO - Esame microscopico - Isolamento culturale C) INDAGINI SIEROLOGICHE (non sempre utili)

3 PRELIEVO E RACCOLTA DEL CAMPIONE PER INFEZIONI SUPERFICIALI: 1) Da cute glabra: si deterge con acqua distillata o con alcool e si scarifica la lesione ai margini con un bisturi o il bordo di un vetrino. 2) Da vescico-pustole: si rompe la vescica e si mette il tetto in coltura, quindi con l'ansa o tampone si preleva il contenuto della vescica. 3) Da capelli o peli: si prelevano dal centro della lesione, scegliendo quelli con alterazioni visibili (ad es. tronchi). 4) Da unghie: si tagliano pezzettini di unghia dal sito infetto o si scarifica con un bisturi sterile (preferibilmente dalla superficie ventrale, se l'unghia è scollata, o dai bordi). 5) Dalle mucose: si introduce e si striscia il tampone nella regione interessata e si stempera in soluzione fisiologica.

4 Da cute glabra: PRELIEVO E RACCOLTA DEL CAMPIONE Da unghie: Dalle mucose:

5 PER INFEZIONI SOTTOCUTANEE: Si scarifica il tessuto interessato o si aspira l'essudato o si utilizza un tampone PER INFEZIONI PROFONDE: Il campione biologico, a seconda dell'infezione, può essere costituito da: sangue liquor espettorato urine biopsia essudato

6 ESAME MICROSCOPICO A FRESCO E' molto significativo, permette la visualizzazione e, in alcuni casi, l'identificazione dei funghi, in base alle caratteristiche morfologiche. a) Se il materiale non è opaco, si osserva direttamente b) Se il materiale è opaco (squame, unghie, pus) si effettua prima la chiarificazione con KOH (idrato di potassio) al 10% DOPO COLORAZIONE 1) Chiarificazione 2) Fissazione in etanolo al 95% per 20' o in metanolo per 2-3' 3) Colorazione: -semplice (blu di metilene, blu cotton, inchiostro di china, arancio di acridina) -differenziale (Ematossilina-eosina)

7 ESAME COLTURALE I miceti sono microorganismi aerobi, eterotrofi (necessitano di carbonio organico per il loro metabolismo) SABOURAUD (Brodo o Agar): contiene peptone e destrosio. E' selettivo verso i batteri per il ph acido (5.6). Può essere addizionato di: a) olio di oliva (per Pityrosporum) b) cloramfenicolo (per inibire i batteri) c) cicloeximide (per inibire le muffe, ma anche Cryptococcus è sensibile) CORNMEAL AGAR (farina di granoturco) Per l'induzione di ife, conidi, clamidospore Temperatura: Temperatura ambiente (Dermatofiti), o C o 37 C Tempo di coltivazione: da 1-2 a 20 giorni. Si osserva l'aspetto macroscopico delle colonie e si allestiscono vetrini per l'esame microscopio. LIEVITI Funghi filamentosi

8 Identificazione dei LIEVITI e dei FUNGHI FILAMENTOSI

9 LIEVITI - Test del tubo germinativo (Germ-tube) La coltivazione in terreno liquido + 10 % di siero a 37 C per 2 h induce la produzione di tubi germinativi nella specie Candida albicans 2 h Candida albicans 2 h Candida spp. (non C. albicans)

10 IDENTIFICAZIONE FUNGHI LIEVITIFORMI + altre prove biochimiche o metaboliche (test dell'ureasi, fenolossidasi, test di riduzione dei nitrati, utilizzo dei carboidrati, etc.)

11 Schema diagnostico per i lieviti Campione biologico

12 Identificazione di Cryptococcus nel liquor Inchiostro di china LATEX-CRYPTO ANTIGEN SYSTEM

13 FUNGHI FILAMENTOSI Osservazione microscopica per osservare i corpi fruttiferi, ife e conidi (prelevati toccando il micelio aereo con del nastro adesivo che va attaccato su un vetrino dove c è una goccia di Blu Cotton) Esame microscopico

14 PARASSITAMENTO DEL PELO (Dermatofiti) 1) ALL'INTERNO = ENDOTRIX (Trichophyton) Il pelo si spezza nel punto da cui esce dall'ostio follicolare Al microscopio ottico si ha un'immagine "a sacchetto di noci 2) ALL'ESTERNO = ECTOTRIX (Microsporum) I miceti costituiscono una sorta di manicotto che rende il pelo in qualche modo più resistente, per cui si spezza a qualche mm dall'ostio follicolare. Al microscopio si ha un immagine "a grissino intinto nel miele

15 LUCE DI WOOD Prodotta da raggi UVA (l = 365 nm), mette in evidenza sostanze fluorescenti presenti nel materiale biologico. La fluorescenza può essere per i dermatofiti: verde brillante = M. audouinii verde = M. canis (non sempre fluorescente) verde giallastra = T. shonleinii grigio-azzurrognola = T. tonsurans per i lieviti: grigio-giallastra = P. ovale Fluorescenza del capello alla luce di Wood Falsi positivi possono essere dovuti a cheratina, fibre tessili, acido salicilico, vaselina. N.B. fluorescenza rosa salmone può essere data da Corynebacterium minutissimum, agente etiologico dell'eritrasma

16 Identificazione di Pneumocystis jirovecii Campione biologico: lavaggio broncoalveolare Metodo: Immunofluorescenza diretta

17 COLORAZIONI ISTOLOGICHE Gomori-Grocott = impregnazione argentica per cui le cellule fungine assumono colorazione scura rispetto al tessuto, giallo o verde scuro. PAS (Acido periodico di Shiff) = colorazione selettiva per i polisaccaridi. Le cellule fungine appaiono rosso magenta, e i nuclei delle cellule dell'ospite blu su fondo chiaro.