MICROSCOPIA E ALLESTIMENTO DEI PREPARATI ISTOLOGICI

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1 Capitolo 2 MICROSCOPIA E ALLESTIMENTO DEI PREPARATI ISTOLOGICI Contenuti 2.1. ALLESTIMENTO DI PREPARATI A FRESCO Osservazione di preparati a fresco Osservazione di tessuti colorati con coloranti vitali 2.2. ALLESTIMENTO DI PREPARATI ISTOLOGICI Fissazione Disidratazione e diafanizzazione Inclusione Taglio Colorazione Metacromasia

2 2.1 ALLESTIMENTO DI PREPARATI A FRESCO Negli organismi pluricellulari le cellule rappresentano l unità costituente fondamentale e solo l organizzazione in gruppi di cellule, con morfologia e funzioni simili, porta alla formazione di tessuti. Le piccole dimensioni delle cellule impongono che per la loro osservazione ci si debba avvalere dell uso del microscopio ottico (a luce) (Fig. 2.1) e microscopio elettronico. I due principali metodi utilizzati per l analisi morfologica sono: 1) l osservazione diretta di cellule e di tessuti viventi; 2) l osservazione di cellule e di tessuti sottoposti a trattamenti finalizzati a stabilizzare e conservare le strutture il più possibile simili a quelle presenti nelle cellule viventi. Figura 2.1 ottico. Microscopio Il primo metodo, che permette di osservare i tessuti a fresco (tessuti non sottoposti a nessun trattamento che ne determini la stabilizzazione) o semplicemente processati con coloranti vitali, è in linea teorica da preferire in quanto non introduce artefatti nel campione. Tuttavia questo metodo presenta alcune limitazioni quali: scarso contrasto, totale trasparenza se non viene effettuata la colorazione, ridotta visualizzazione al microscopio luce dei tessuti per il loro spessore, durata limitata poiché i tessuti o le singole cellule vanno facilmente incontro ad autolisi. Osservazione di preparati a fresco Le cellule sono quasi completamente trasparenti alla luce e di conseguenza l osservazione di preparati a fresco può essere condotta utilizzando particolari microscopi quali stereomicroscopio, microscopio invertito, microscopio a contrasto di fase. In questo modo, un discreto numero di particolari strutturali sono facilmente visibili. In alcuni casi può essere sfruttata l autofluorescenza di alcune strutture biologiche che, se osservate al microscopio a fluorescenza, possono essere facilmente individuate, mentre altre strutture cellulari acquisiscono fluorescenza se trattate con particolari sostanze. I tessuti osservati a fresco, durante l osservazione, devono essere immersi in una idonea soluzione in modo da non alterarne la struttura ed evitare l essiccazione. A questo scopo, generalmente, si ricorre all uso di soluzioni fisiologiche, soluzioni saline isotoniche contenenti ioni quali Mg 2+ e Ca 2+ in concentrazioni opportune. Osservazione di tessuti colorati con coloranti vitali Lo scarso contrasto dovuto alla trasparenza delle cellule può essere risolto utilizzando particolari coloranti, detti vitali, che hanno la proprietà di essere assorbiti dalle cellule viventi senza risultare eccessivamente tossici, e quindi colorarne le strutture rendendole visibili. Questo tipo di colorazione si adatta a quei tipi di cellule, spesso contenenti vacuoli, in cui si concentra il colorante (cellula ad attività granulopessica) o anche per colorazioni in toto di embrioni in sviluppo. 8 CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici

3 È importante tener presente che solo frammenti molto sottili di tessuto ed organo o cellule isolate possono essere mantenute vivi per breve tempo durante l osservazione. I coloranti vitali, iniettati nell animale intero, raggiungono i tessuti tramite la circolazione colorandoli. In questo caso si parla di colorazione vitale o intra vitam. Si parla invece di colorazione sopravitale quando un pezzo di tessuto od organo appena prelevato dall animale viene immerso nella soluzione colorante. I coloranti vitali utilizzati possono essere suddivisi in tre categorie: coloranti neutri: es. rosso neutro, verde janus; coloranti basici: es. blu di metilene, blu di toluidina, azzurro di metilene; coloranti acidi: es. alizarina, trypan blu, blu pirrolo. 2.2 ALLESTIMENTO DI PREPARATI ISTOLOGICI L impiego di coloranti e di tecniche che permettono di migliorare il contrasto riesce però a soddisfare in minima parte le necessità delle analisi morfologiche e citologiche, soprattutto a causa dello spessore delle cellule. In primo luogo, poiché la consistenza dei tessuti freschi impedisce di ottenere sezioni sottili, i protocolli comunemente utilizzati in citologia ed istologia prevedono l allestimento di preparati che risultino permanenti in modo da poterli studiare con l ausilio del microscopio ottico. Il preparato ideale per un analisi morfologica consiste in una sezione (spessore di 5-10 mm) che possiede la stessa struttura ed organizzazione che aveva nell organismo. L approccio sperimentale deve quindi essere esclusivamente di tipo conservativo, e questo obiettivo può essere raggiunto processando il tessuto attraverso una serie di passaggi che servono ad arrestare le funzioni biologiche senza alterare l organizzazione strutturale delle diverse componenti (fissazione), a rimuovere dalla cellula la componente acquosa (disidratazione) che risulta incompatibile con una buona osservazione al microscopio ottico e alla sua sostituzione con il mezzo includente (inclusione). Il campione così processato viene sottoposto al taglio e successivamente colorato. Fissazione La fissazione è un procedimento che permette di bloccare l autolisi cellulare, preservando così nel tempo la morfologia del tessuto o dell organo in studio. Dopo l espianto il frammento di tessuto o di organo viene rapidamente fissato utilizzando metodi chimici o più raramente metodi fisici. La fissazione chimica prevede l impiego di agenti stabilizzanti in grado di instaurare legami trasversali (cross-link) tra le proteine. Per facilitare la penetrazione del fissativo e garantire così una fissazione omogenea, il tessuto viene tagliato in piccoli frammenti dell ordine di alcuni mm 3. Nel caso invece in cui sia necessario fissare l organo tale e quale, si procede con la perfusione dell animale; in questo modo, tramite la circolazione sanguigna, il fissativo arriva a tutte le cellule. I fissativi chimici si suddividono in: fissativi che coagulano le proteine (alcool etilico, acido acetico, acido picrico ); fissativi che non coagulano le proteine (formalina neutra tamponata, fissativo di 2.2 Allestimento di preparati istologici 9

4 Bouin), in grado di formare legami crociati tra catene proteiche adiacenti in modo da bloccarle nella loro posizione. Il congelamento in azoto liquido ( 170 C), un esempio di fissazione fisica, rappresenta un alternativa all impiego di fissativi chimici ed alcoli al fine di stabilizzare il materiale biologico, in funzione della rapidità e della maggior preservazione dell antigenicità del tessuto in esame. Il congelamento permette inoltre di mantenere nei tessuti i depositi di lipidi che vengono altrimenti persi durante il processamento del campione con i solventi organici, tappa che precede l inclusione in paraffina. Disidratazione e diafanizzazione Poiché le cellule sono formate principalmente da acqua, la sua rimozione è necessaria per una buona osservazione del campione al microscopio luce e per poter infiltrare il tessuto con la paraffina, materiale idrofobo. Si procede quindi alla disidratazione del tessuto immergendolo in una soluzione alcolica a concentrazione crescente (miscela di acqua e alcool), a partire da etanolo al 50% fino ad arrivare ad etanolo al 100%. Questo processo deve essere graduale per non provocare il raggrinzimento delle cellule. In seguito il campione viene immerso in xilolo, solvente organico miscibile sia con l etanolo che si è sostituito all acqua, sia con la paraffina. Poiché lo xilolo è un solvente diafanizzante, a fine infiltrazione il tessuto risulterà trasparente. Inclusione Il tessuto così processato è pronto per essere infiltrato con un mezzo di inclusione che, dopo solidificazione, conferirà al tessuto la giusta consistenza per ottenere sezioni sottili. Per la microscopia ottica il mezzo di inclusione utilizzato è la paraffina, una miscela di idrocarburi saturi che diventa fluida se riscaldata (50 C-60 C), mentre solidifica a temperatura ambiente. Il campione viene immerso in paraffina fusa e completata la fase di infiltrazione, viene lasciato solidificare a temperatura ambiente. Il campione a questo punto presenta la consistenza idonea per essere tagliato al microtomo in sezioni che hanno uno spessore compreso tra 5-10 mm (Fig. 2.2). Figura 2.2 Blocchetti di paraffina in cui sono stati inclusi campioni biologici. 10 CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici

5 prelievo del tessuto per inclusione in paraffina fissazione in formalina o altro fissativo disidratazione con serie alcolica a concentrazione crescente (etanolo 50%, 70%, 95% ed assoluto) xilolo xilolo e paraffina paraffina fusa SCHEMA RIASSUNTIVO Figura 2.3 Microtomo a rotazione. Taglio Il microtomo è uno strumento dotato di una lama e di un braccio su cui viene fissato il blocchetto di paraffina contenente il campione che, avanzando verso la lama, permette di ottenere sezioni sottili che vengono trasferite in un recipiente contenente acqua distillata per favorirne la distensione (Fig. 2.3). In seguito le sezioni vengono raccolte e trasferite su un vetrino portaoggetti precedentemente trattato con materiale adesivo. Dopo averle fatte asciugare, per garantirne una buona adesione al vetrino, le sezioni vengono processate per la colorazione. I campioni sottoposti a fissazione fisica (congelamento) vengono invece tagliati al microtomo congelatore, che impiega un sistema di raffreddamento ( 30 C) che permette il congelamento del tessuto, o con il più sofisticato criostato a congelamento rapido, un microtomo posto in una camera in cui viene mantenuta una bassa temperatura ( 50 C), che permette di congelare direttamente il campione nell apparato di taglio. Le sezioni ottenute ad una temperatura compresa tra 10 C e 30 C vengono trasferite su vetrini raffreddati che vengono poi portati a temperatura ambiente per poterli colorare o processare per colorazioni istochimiche o immunoistochimiche. Questi metodi sono particolarmente utilizzati per lo studio dei lipidi o per quei tessuti di cui si vuole preservare l antigenicità. Oltre alle tecniche sopra descritte, il metodo di congelamento-essicamento (freeze drying) consente di preservare il tessuto senza ricorrere all uso di miscele chimiche, in quanto i processi di autolisi vengono annullati dalla completa disidratazione del campione. Il tessuto, dopo il prelievo, viene immediatamente congelato in azoto liquido ( 170 C) per evitare la formazione di grossi cristalli di ghiaccio che potrebbero alterare 2.2 Allestimento di preparati istologici 11

6 la morfologia delle cellule. In seguito viene posto sottovuoto alla temperatura di 40 C in modo tale che il ghiaccio sublimi con conseguente disidratazione del tessuto. A questo punto il campione, estremamente fragile, viene immerso in paraffina fusa per favorirne l infiltrazione. I pezzi così ottenuti saranno sottoposti al taglio utilizzando il microtomo. In alcuni casi, la particolare tipologia del campione biologico permette di allestire preparati citologici senza ricorrere all inclusione e al sezionamento. È il caso di tessuti liquidi come il sangue o derivati da lavaggi bronchiali, liquidi pleurici, peritoneali e pericardici, scrapings di materiale citologico ottenuto per ago-aspirazione da noduli solidi e cisti presenti nella mammella, linfonodi, tiroide, polmone, midollo e da altri organi. In questi casi, la riduzione dello spessore del campione biologico può essere ottenuta strisciando direttamente le cellule sul vetrino portaoggetti (striscio di sangue), oppure l allestimento del preparato può avvenire per apposizione, ossia premendo il vetrino portaoggetto sulla superficie del tessuto fresco (masse tumorali o tessuti bioptici). Questi metodi trovano applicazione nella pratica clinica allo scopo di evidenziare cellule neoplastiche o comunque alterate. La tecnica dei preparati per erosione si applica a campioni di tessuto osseo compatto non decalcificato che, dopo essere stato tagliato in sezioni longitudinali o trasversali dello spessore di 1 mm, vengono assottigliate mediante abrasione con un disco di carta smeriglio rotante a bassa velocità. Con questa metodica si possono ottenere sezioni di osso calcificato dello spessore di 20 mm. Colorazione In ambito istologico e citologico vengono definite coloranti quelle sostanze chimiche che si legano a componenti cellulari/tessutali aumentandone il contrasto. Nella microscopia ottica l effetto di risalto è dato da una caratteristica colorazione di quelle strutture che rivelano affinità con il colorante utilizzato. I preparati per striscio, apposizione, erosione o le sezioni ottenute da materiale congelato non richiedono ulteriori trattamenti e possono essere immediatamente processati per le analisi istologiche o istochimiche. Al contrario, le sezioni ottenute da tessuti inclusi (es. paraffina) richiedono un trattamento per eliminare il mezzo di inclusione che potrebbe interferire con la colorazione. Poiché nella microscopia luce la maggior parte dei coloranti è idrosolubile, è necessario rimuovere la paraffina dal campione immergendo il vetrino nello xilolo. L eliminazione dello xilolo, non miscibile in acqua, si ottiene immergendo le sezioni in etanolo assoluto; successivamente le sezioni vengono gradualmente idratate immergendole in una serie di alcoli a concentrazione decrescente fino ad arrivare all acqua. A questo punto le sezioni vengono immerse nel colorante scelto. Terminata la colorazione, dopo aver lavato le sezioni per allontanare il colorante in eccesso, si procede con il montaggio del vetrino. Questo procedimento consiste nell applicare sopra le sezioni un vetrino coprioggetto, che viene fatto aderire al vetrino portaoggetti tramite una resina sintetica trasparente (Eukitt) non miscibile in acqua. Le caratteristiche della resina richiedono la disidratazione delle sezioni che, ancora una volta viene eseguita immergendo i vetrini nella serie di alcoli a concentrazione crescente fino ad arrivare all etanolo assoluto, a cui fa seguito un passaggio in xilolo in quanto è eccellente solvente della resina utilizzata per il montaggio (Fig. 2.4). 12 CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici

7 Figura 2.4 Rappresentazione schematica del montaggio del campione biologico dopo la colorazione. La goccia di resina interposta tra il campione e il vetrino coprioggetto, rende il preparato stabile e duraturo nel tempo. Le tecniche di citochimica e istochimica, sfruttando le caratteristiche dei coloranti, permettono di trasformare in prodotti colorati i vari componenti di una cellula o di un tessuto, in modo da poterli osservare con il microscopio luce. Infatti l azione differenziale dei coloranti dipende principalmente da tre fattori: affinità chimica tra i componenti cellulari/tessutali e i coloranti, concentrazione di tali componenti e loro permeabilità. I coloranti possono essere suddivisi fondamentalmente in: coloranti acidi (ad es. alizarina, trypan blu, blu pirrolo) colorano i componenti cellulari che presentano cariche positive e per questo vengono detti acidofili; coloranti basici (ad es. blu di toluidina, blu di metilene, ematossilina, azzurro B) colorano i gruppi cellulari che presentano cariche negative e per questo vengono detti basofili; coloranti neutri (ad es. rosso neutro, verde janus); mordenzanti agiscono da intermediari tra il colorante e il tessuto. La maggior parte dei mordenzanti impiegati nelle tecniche istologiche sono ioni metallici (ferro o tungsteno) e/o ossidanti (acido cromico). Di seguito vengono elencate le principali colorazioni che vengono utilizzate in istologia per visualizzare particolari componenti tessutali. EMATOSSILINA EOSINA È una delle tecniche di colorazione più utilizzate sia in campo istologico sia in campo patologico in quanto è applicabile praticamente con tutti i metodi fissativi, eccetto quelli che prevedono l osmio, e permette di analizzare la morfologia del tessuto. È una colorazione progressiva che prevede l uso sequenziale di due soluzioni coloranti, l ematossilina (colorante basico, colora i nuclei in violetto) e l eosina (colorante acido, colora il citoplasma in rosa) (Figg ). 2.2 Allestimento di preparati istologici 13

8 Figura 2.5 Sezione di epitelio pavimentoso pluristratificato non cheratinizzato (molle) colorato con ematossilina-eosina. Sono ben evidenti i nuclei in violetto, colorati dall ematossilina e il citoplasma in rosa, colorato dall eosina. Figura 2.6 Sezione di epitelio pavimentoso pluristratificato cheratinizzato colorato con ematossilina-eosina. Sono ben evidenti i nuclei in violetto, colorati dall ematossilina, e il citoplasma in rosa, colorato dall eosina. Lo strato superficiale, detto corneo, è formato da cheratina densa. Una tecnica di colorazione regressiva prevede l utilizzo di ematossilina ferrica. Questo tipo di colorazione prevede una lenta sovracolorazione seguita da una asportazione del colore in eccesso per differenziare la struttura in esame (Fig. 2.9). È comunemente utilizzata per lo studio delle mitosi data la particolare affinità dell ematossilina per i cromosomi, per evidenziare i centrioli, la striatura trasversale delle cellule muscolari e con alcune avvertenze si possono colorare anche i mitocondri. Figura 2.7 Sezione longitudinale di tessuto muscolare striato scheletrico. La colorazione con ematossilina-eosina mette in evidenza i nuclei (in violetto) e il citoplasma (rosa). Figura 2.8 Sezione di cartilagine ialina colorata con ematossilina-eosina. 14 CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici

9 Figura 2.13 Sezione di arteria colorata con resorcina e fucsina per mettere in evidenza le fibre elastiche. Colorazione di Verhoeff: le fibre vengono colorate con una soluzione alcolica di ematossilina contenente cloruro ferrico, iodio e ioduro di potassio. Segue la differenziazione con cloruro ferrico acquoso (Figg e 2.13). IMPREGNAZIONE ARGENTICA PER LE FIBRE RETICOLARI Dal punto di vista istologico le fibre reticolari si distinguono da quelle collagene sia per la loro struttura esile sia perché non si colorano con i coloranti utilizzati per le fibre collagene (van Gieson, Mallory). Le fibre reticolari sono presenti nei tessuti connettivi o in alcuni organi come la milza dove formano una sottile impalcatura reticolare che sostiene le singole cellule a differenza delle fibre collagene che, aggregandosi, formano una componente stromale grossolana. La proprietà istochimica più importante delle fibre reticolari è la loro intensa argirofilia, ossia affinità di un substrato organico per i sali d argento. In seguito a colorazione, le fibre assumono un colore nero che le rendono facilmente visibili al microscopio luce, mentre gli altri elementi tessutali assumono la colorazione del colorante di contrasto (Figg e 2.15). Figura 2.14 Sezione di linfonodo colorata con impregnazione argentica per mettere in evidenza le fibre reticolari. 2.2 Allestimento di preparati istologici 17

10 (a) Figura 2.15 Sezioni di fegato colorate con impregnazione argentica per mettere in evidenza le fibre reticolari. (b) In questa immagine è stato utilizzato un colorante di contrasto diverso rispetto all immagine (a). (b) COLORAZIONE TRICROMICA Questo tipo di colorazione, basandosi sull utilizzo di tre coloranti, permette di evidenziare nel tessuto in modo selettivo, specifici componenti. Generalmente il nucleo viene evidenziato da ematossilina ferrica, un colorante nucleare. I tessuti connettivo e muscolare vengono colorati in modo differente in quanto la diversa affinità del colorante verso gli elementi tessutali può essere influenzata dal ph della soluzione di colorazione, dalla densità del tessuto e dall uso di coloranti incolori quali l acido fosfomolibdico e l acido fosfotungstico. Questi due composti hanno un ruolo complesso nella colorazione dei tessuti connettivi, ma fondamentalmente si ritiene che blocchino la reazione di una delle molecole coloranti con certi elementi tessutali impedendone la colorazione. Poiché esistono diversi protocolli che si basano su di una colorazione tricromica, qui di seguito vengono riportati i metodi più utilizzati (Tabella 2.1). TABELLA 2.1 METODO NUCLEO COLLAGENE MUSCOLO ERITROCITI Masson blu-nero blu o verde rosso rossi Gomori grigio-blu verde rosso rossi Lissamine rosso blu-nero giallo-rosso rossi Azan rosso blu arancio-rosso rossi 18 CAPITOLO 2 Microscopia e allestimento dei preparati istologici