TECNICHE IN ISTOLOGIA. come si ottiene, a partire da tessuti biologici, un immagine come questa?

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1 tessuto epiteliale al microscopio ottico TECNICHE IN ISTOLOGIA come si ottiene, a partire da tessuti biologici, un immagine come questa?

2 La preparazione di materiale istologico Problema 1 la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto pertanto: il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

3 TAGLIO AL MICROTOMO TESSUTO INCLUSO IN PARAFFINA TECNICHE IN ISTOLOGIA LAMA SEZIONI

4 La preparazione di materiale istologico Problema 2 quasi tutti i tessuti biologici sono molli e, quindi, non si possono tagliare, perciò prima del taglio, il tessuto deve essere indurito Fissazione con aldeidi e successiva Inclusione Alternativa: congelamento

5 La preparazione di materiale istologico Problema 3 i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto e non si vedrebbe nulla neanche al microscopio prima dell osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

6 sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica 1. fissazione di un campione di tessuto 2. congelamento o inclusione del pezzo 3. taglio al microtomo 4. montaggio su vetrino 5. bagni in soluzioni di coloranti 6. disidratazione e coverslipping

7 FISSAZIONE SCOPO Lo scopo della fissazione è quello di preservare la struttura delle cellule dalle alterazioni conseguenti la morte cellulare COME SI OTTIENE Trattamento chimico dei tessuti che porta alla precipitazione delle proteine, tramite la formazione di legami chimici una rapida interruzione dei processi vitali della cellula inattivazione di enzimi litici

8 INCLUSIONE SCOPO Fornire consistenza e resistenza al tessuto in modo che possa essere tagliato in fette sottili (3-10 micron) COME SI OTTIENE Si ottiene tramite l inclusione in PARAFFINA (per MO) che si ottiene tramite la penetrazione della paraffina in tutti gli spazi intercellulari e anche nelle cellule

9 INCLUSIONE PROCEDURA - I frammenti sono posti in soluzioni acquose a concentrazioni di alcool crescenti, in modo da disidratare il tessuto - passaggio in un solvente della paraffina: XILOLO o BENZOLO - passaggio in paraffina liquida

10 Eliminare l acqua e sostituirla con un solvente per la paraffina. 50 % etanolo 70 % etanolo Tessuto fresco Fissazione in formalina al 10% TECNICHE IN ISTOLOGIA 95 % etanolo 100 % etanolo benzene/ xilene Miscibile con etanolo; scioglie la paraffina label Paraffina fusa

11 INCLUSIONE IN PARAFFINA La paraffina è liquida a C. Solidifica a temperatura ambiente TECNICHE IN ISTOLOGIA

12 TAGLIO Preparazione di fettine sottili di tessuto (3-10 micron) tramite il MICROTOMO METODI PARTICOLARI DI FISSAZIONE-TAGLIO Il tessuto viene congelato e tagliato con il criostato alla temperatura desiderata CRIOSTATO: microtomo posto in un frigorifero

13 TAGLIO AL MICROTOMO TECNICHE IN ISTOLOGIA TESSUTO INCLUSO IN PARAFFINA LAMA SEZIONI

14 RECUPERO DELLE SEZIONI TECNICHE IN ISTOLOGIA

15 SEZIONI NON COLORATE VETRINO PORTAOGGETTO TECNICHE IN ISTOLOGIA

16 lo striscio di sangue Lo striscio consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e non richiede il taglio del tessuto. TECNICHE IN ISTOLOGIA

17 ORIENTAMENTO DEL TAGLIO

18 RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI SEZIONI CORDONE SOLIDO TUBULO LAMINA

19 COLORAZIONE SCOPO - aumentare il contrasto dei diversi costituenti del tessuto per: favorirne la osservazione - identificare costituenti chimici specifici dei tessuti (istochimica) COME SI OTTIENE Dopo il taglio le sezioni sono raccolte su un vetrino portaoggetto Estrazione della paraffina con solventi della paraffina (xilolo o benzolo) Idratazione delle sezioni tramite passaggio in soluzioni contenenti concentrazioni sempre più basse di alcool ( alcool acqua) Trattamento delle sezioni con coloranti (sciolti in soluzioni acquose)

20 COLORANTI i COLORANTI si comportano come molecole acide o basiche una base rilascia OH - ; un acido rilascia H 3 O + i coloranti formano legami ionici con le molecole del tessuto coloranti basici (+) legano molecole basofile (-) coloranti acidi (-) legano molecole acidofile(+)

21 COLORANTI coloranti basici (+) includono ematossilina, blu di toluidina e blu di metilene colorano glicosamminoglicani (GAG), RNA, DNA (-) includono eosina, ecc. coloranti acidi (-) colorano proteine citoplasmatiche (+)

22 Miscele coloranti

23 COLORAZIONI ISTOLOGICHE Ematossilina-eosina (H & E) è una delle colorazioni più comuni Ematossilina è un colorante basico (+) e colora le sostanze acide (ad es. acidi nucl.) Basofilia dei nuclei (acidi) Eosina è un colorante acido (-) e colora le sostanze basiche (ad es.le proteine nel citoplasma Acidofilia del citoplasma TECNICHE IN ISTOLOGIA TECNICHE IN ISTOLOGIA

24 Nucleo al TECNICHE IN ISTOLOGIA MO Nucleo TECNICHE IN ISTOLOGIA al ME

25 Verde di metile (DNA) pironina (RNA) TECNICHE IN ISTOLOGIA Colorazione differenziale a ph 4,8. Al di sotto prevale la colorazione rossa dovuta alla pironina, al di sopra prevale la colorazione verde azzurra del verde metile. I due coloranti non sono di per sè selettivi per il DNA o RNA; di fatto la selettività è ottenibile attraverso la definizione del ph di reazione.

26 COLORAZIONE AZAN-MALLORY Citoplasma (rosa) TECNICHE IN ISTOLOGIA Nuclei (rosso) Fibre collagene (blu)

27 Silver stain TECNICHE IN ISTOLOGIA TECNICHE IN ISTOLOGIA

28 METACROMASIA Alcuni coloranti legando alcuni composti chimici forniscono loro una colorazione diversa da quella del colorante stesso. ES.: BLU DI TOLUIDINA colora in rosso i proteoglicani acidi della cartilagine TECNICHE IN ISTOLOGIA

29 Istologia funzionale L istologia moderna non si limita all osservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. Esistono numerose tecniche che consentono di rispondere a quesiti sulla composizione specifica di un tessuto correlata alle sue funzioni Colture cellulari Coloranti vitali Istochimica Immunoistochimica Immunofluorescenza

30 Istochimica L identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti Mentre nella biochimica tradizionale il materiale biologico viene studiato tipicamente in provetta, la citochimica e l istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su sezioni di tessuto, consentendo di identificare i costituenti in situ.

31 Con colorazioni istochimiche possiamo evidenziare: LIPIDI Sudan Nero, Sudan III (coloranti solubili nei grassi) CARBOIDRATI Reazione Acido-Periodico di Schiff (PAS): colora in rosso magenta: amido, glicogeno, mucina (glicoproteina presente nel secreto mucoso del tratto respiratorio e gastro-intestinale) DNA Reazione di Feulgen che colora di rosso in modo selettivo il DNA (e non l RNA)

32 ISTOCHIMICA Cellule del tratto digerente secernenti muco (H&E; PAS-H) TECNICHE IN ISTOLOGIA TECNICHE IN ISTOLOGIA

33 ISTOCHIMICA: IDENTIFICAZIONE DI ENZIMI Si sfrutta l attività enzimatica di proteine dei tessuti Si fornisce il substrato specifico per un enzima enzima SUBSTRATO PRODOTTO (colorato) ESEMPIO: METODO GOMORI-TAKAMATSU per la FOSFATASI Glicerofosfato + Ca 2+ Fosfato di calcio Si possono evidenziare ENZIMI IDROLITICI: fosfatasi, ATPasi, lipasi OSSIDASI: perossidasi DEIDROGENASI: lattico deidrogenasi

34 ISTOCHIMICA-IDENTIFICAZIONE DI ENZIMI: PEROSSIDASI neuroni TECNICHE IN ISTOLOGIA

35 immunocitochimica TECNICHE IN ISTOLOGIA

36 Microtubuli nella cellula in interfase TECNICHE IN ISTOLOGIA Immunofluorescenza con anticorpi anti-tubulina

37 immunocitochimica TECNICHE IN ISTOLOGIA

38 Il microscopio ottico TECNICHE IN ISTOLOGIA

39 Il microscopio ottico

40 MICROSCOPIO OTTICO Il MO determina: un aumento del potere di risoluzione il potere risolutivo di uno strumento determina la distanza minima alla quale due punti vicini possono essere distinti Per l occhio umano R = 0,1 mm un ingrandimento dell immagine

41 è più importante: l ingrandimento o il potere di risoluzione?

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43 Questo è quello che succede quando si ingrandisce indefinitamente un immagine. PERDITA DELLA risoluzione di un immagine

44 il potere risolutivo di uno strumento (e non l ingrandimento) determina il massimo livello di dettaglio che si può ottenere nell immagine

45 Questione di dimensioni Vedremo che l osservazione di diversi livelli di organizzazione della materia vivente richiede l uso l di diversi strumenti Occhio umano Microscopio ottico Potere risolutivo nm Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico a trasmissione 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 0,1 nm cell. epiteliali globuli rossi batteri mitocondri virus proteine aminoacidi atomi

46 B filamento (catodo) anodo condensatore preparato obiettivo il microscopio elettronico a trasmissione proiettore schermo fluorescente

47 MICROSCOPIO ELETTRONICO Gli elettroni sono emessi da un filamento al tungsteno per effetto termoionico (calore) ed accelerati da un campo elettrico Il fascio di elettroni si propaga nel vuoto e viene focalizzato sul campione tramite una lente (bobine magnetiche) filamento (catodo) anodo condensatore La traiettoria degli elettroni subisce delle modifiche quando incontra il campione l immagine dipende dalle differenze nella dispersione degli elettroni nelle diverse parti del preparato L immagine è raccolta su uno schermo fluorescente BIANCO E NERO B preparato obiettivo proiettore schermo fluorescente

48 Microscopio ottico ed elettronico a confronto

49 POTERE RISOLUTIVO Potere risolutivo = 0,61 λ NA* In microscopia elettronica il potere risolutivo può essere enormemente aumentato perché è utilizzato un raggio di elettroni al quale può essere associata una lunghezza d onda molto piccola (λ)=0,005 Per il microscopio elettronico λ = 0,005 nm R = 0,002 nm (teorico) il reale limite di risoluzione è 0,1-0,2 nm *NA=apertura numerica ed NA=nsena, con n=indice di rifrazione del mezzo e sena il seno del semiangolo di apertura

50 Luce visibile= nm Risoluzione Potere risolutivo = 0,61 l NA l = 500 nm R = 0,2 mm = 200 nm Per il microscopio ottico Per il microscopio elettronico l = 0,005 nm R = 0,002 nm (teorico) il reale limite di risoluzione è 0,1-0,2 nm

51 DIFFERENZE TRA MO e TEM

52 DIFFERENZE TRA MO e TEM MICROSCOPIO ottico MICROSCOPIO elettronico L Immagine è osservata direttamente dall occhio Ingrandimento fino a 1.500X Potere risolutivo = 0,2 mm Preparazione del campione richiede se congelato solo 20 min L immagine si forma su uno schermo fluorescente Ingrandimento fino a X Potere risolutivo = 1 nm (0,001 mm.) Preparazione del campione richiede almeno 1 giorno

53 Microscopia elettronica Preparazione del tessuto Fissazione in glutaraldeide Postfissazione in tetrossido di osmio Disidratazione con alcol Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche dure (epon, araldite) Taglio all ultramicrotomo Sezioni di nm Aumento del contrasto Coloranti elettronici: metalli pesanti come acetato di uranile o citrato di piombo

54 Esempio di microscopia elettronica a trasmissione Le immagini di microscopia elettronica sono in bianco e nero. Le parti scure si dicono elettrondense. L altissimo potere risolutivo del ME consente di distinguere numerose componenti subcellulari. TECNICHE IN ISTOLOGIA linfocito

55 ERITROCITI AL MO E ME Plasmalemma di globulo rosso TECNICHE IN ISTOLOGIA

56 Microscopio elettronico a scansione Risoluzione piu bassa rispetto alla ME a trasmissione Consente di valutare il rilievo degli oggetti Usata per lo studio delle superfici cellulari

57 Macrofago in microscopia elettronica a scansione TECNICHE IN ISTOLOGIA

58 globuli rossi Microscopio a scansione: superficie dei globuli rossi TECNICHE IN ISTOLOGIA