Dott.ssa Valeria Berton Università di Verona VISUALIZZARE I CAMPIONI BIOLOGICI

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1 Dott.ssa Valeria Berton Università di Verona VISUALIZZARE I CAMPIONI BIOLOGICI

2 Campione biologico Cellule in coltura 1- Rendere il campione manipolabile 2- Bloccare, «fissare» le condizioni del tessuto/delle cellule Tessuto

3 Passaggio critico 1: Preparazione del campione - Cellule Bisogna: 1) Dissociare e contare le cellule 2) Piastrarle su una piastra da 24 pozzetti contenente vetrini in vetro NB: I vetrini necessitano di un substrato, che consenta l adesione delle cellule Gelatina Poli-D-Lisina Poli-L-Lisina Laminina Bisogna fissare le cellule: Paraformaldeide 4% o Etanolo 95%

4 Passaggio critico 1: Preparazione del campione - Tessuto Per i tessuti, ci sono più passaggi 1) Bisogna fissare i tessuti 2) Bisogna tagliare in sezioni l organo che vogliamo analizzare Fissaggio Lo scopo è di «congelare» le cellule e l organizzazione del tessuto come sono in un determinato momento, così che ogni molecola in quella cellula o in quel tessuto mantenga le sue caratteristiche durante l analisi Tessuti ed organi: Paraformaldeide 4% + Saccarosio 4% Fissa il tessuto Crioconservante

5 Passaggio critico 2: Sezionamento (solo per i tessuti) Per colorare un tessuto, occorre sezionarlo in fettine molto sottili (di solito circa um) - Criostato : camera fredda a -20 C - Microtomo : a Temp ambiente o refrigerato

6 Passaggio critico 2: Sezionamento (solo per i tessuti) Sezionamente del midollo spinale 2 cm regione dorsale regione ventrale sezioni longitudinali 25 μm Rat n Esp X colorazioni

7 Colorazioni Le cellule (in coltura o all interno del tessuto) sono praticamente prive di colore e trasparenti Necessario «colorare» le cellule e le macromolecole per poterle visualizzare e studiare Possono essere: Specifiche o aspecifiche Della cellula intera o di una molecola in particolare Di cellule in coltura o di tessuti

8 Colorazioni istologiche Istologia = studio dell anatomia microscopica di cellule e tessuti animali o vegetali Tessuto = cellule + matrice extracellulare (+ fluidi extracellulari) Cellula = diversi organelli e macromolecole Componenti acidi attraggono sostanze basiche Componenti basici attraggono sostanze acide Il DNA attrae? Le proteine hanno spesso gruppi NH 2 +

9 Colorazioni istologiche Coloranti acidi Sono basofili (attratti dalle basi) Colorano strutture acidofile Coloranti basici Sono acidofili (attratti dagli acidi) Colorano strutture basofile Colorante acido Colorante basico Basico - Acido +

10 Colorazioni istologiche: acido+base Ematossilina-Eosina (EE) Ematossilina colora di blu o nero l eterocromatina e il citoplasma di cellule ricche di ribonucleoproteine Eosina colora di rosa/arancione il citoplasma, i muscoli, il tessuto connettivo

11 Colorazioni istologiche specifiche per componenti Argento Alcune componenti hanno alta affinità per i sali d argento, che vengono trasformati in argento (metallo) Coloranti Sudan neurodegeneration_det ection_with_gallyas_silver_staining_technique_in_the_brain Si dissolvono nei trigliceridi, colorando i lipidi di nero

12 Colorazioni istologiche specifiche per componenti Cresyl violet Colora la sostanza di Nissl nel citoplasma dei neuroni Luxol Fast Blue Contiene rame, si lega alle lipoproteine contenute nella mielina wikipedia

13 Colorazioni (Luxol, Cresyl Violet, H&E) 1. Scongelare i campioni (se tessuto) 2. Disidratazione (Luxol) o idratazione (Cresyl Violet), a seconda del colorante utilizzato 3. Colorazione (Luxol, Cresyl Violet, EE) 4. Passaggi di disidratazione 5. Passaggio finale in Xilene 6. Montare i vetrini con Entellan

14 Esempio: il midollo spinale

15 Esempi: colorazioni su tessuto EE Ematossilina: colorante nucleare Eosina: colorante citoplasmatico Meningi Materia bianca Materia grigia

16 Esempi: colorazioni su tessuto Luxol Fast Blue Colorante specifico per la mielina Cresyl Violet Colorante specifico per i neuroni Meningi Materia bianca Materia grigia cals/chg113%20semester%201/9.%20nerve.html

17 Esempi: colorazioni su tessuto Luxol Fast Blue Colorante specifico per la mielina Cresyl Violet Colorante specifico per i neuroni Rat n Esp X

18 Immunolocalizzazione Immunolocalizzazione: Tecnica che impiega anticorpi specifici per localizzare macromolecole all interno di campioni biologici (cellule, tessuti...) Identificano una particolare macromolecola all interno di un tessuto/di una cellula Macromolecole: recettori, proteine, marcatori nucleari Antigeni Ogni antigene viene riconosciuto da anticorpi specifici (ABs)

19 Anticorpi e Antigeni Antigeni A Antigeni B Antigeni Provengono dall esterno Molecola che vengono riconosciute dal sistema immunitario Anticorpo A Anticorpo B Anticorpi Generati dall organismo Riconoscono delle sequenze casuali: - alcune corrisponderanno a porzioni di batteri, virus etc. - altre corrisponderanno a sequenze non esistenti - altre corrispondono a porzioni di molecole presenti nell organismo

20 Anticorpi Antigeni A Gli anticorpi legano l antigene specifico Reazione immunitaria da parte dell organismo Anticorpo A Attento processo di selezione distrugge gli anticorpi che riconoscono componenti dell organismo stesso

21 Anticorpi Antigeni A Una data proteina, se presente in organismi di diverse specie, avrà una sequenza e una struttura simile nelle diverse specie es. nestina nell umano sarà simile alla nestina nel ratto, simile alla nestina nel topo etc. Simile, ma non uguale! Anticorpo A Gli anticorpi di un topo non reagiscono alla nestina murina, ma riconoscono come estranea e legano la nestina di ratto, perchè avrà delle porzioni leggermente diverse

22 Anticorpi nella ricerca: immunolocalizzazione Nelle meningi del ratto ci sono cellule staminali neurali? anticorpo anti-nestina anticorpo anti-nestina anticorpo anti-nestina Cellule staminali neurali = nestina Anticorpo (AB) che si lega alla nestina del ratto = AB PRIMARIO Meningi nestina nestina nestina L anticorpo si lega alla nestina...ma non si vede Un terzo elemento che mi consenta di vedere al microscopio l AB che ha legato la nestina Un altro anticorpo che ha già legato a sè: Fluoroforo Cromoforo Questo secondo anticorpo si chiama AB SECONDARIO

23 Immunolocalizzazione Tessuto anticorpo anti-a Antigene A anticorpo anti-a Antigene A Antigene B Antigene B anticorpo anti-a Antigene A L anticorpo anti-a è detto PRIMARIO, si lega direttamente all antigene Meccanismo alla base di diverse tecniche di immunolocalizzazione: Immunofluorescenza Immunoistochimica

24 Immunofluorescenza (IF) Tessuto Fluoroforo AB secondario anti-primario AB primario anti-a Antigene A L anticorpo antiprimario è chiamato SECONDARIO, si lega all anticorpo primario In immunofluorescenza, l AB secondario è coniugato ad un fluoroforo La presenza del fluoroforo consente di identificare INDIRETTAMENTE l antigene di interesse NB: Esistono anche anticorpi primari già coniugati ad un fluoroforo

25 Immunofluorescenza (IF): fluoroforo Fluoroforo: composto chimico che se eccitato alla corretta lunghezza d onda, è in gradi di emettere luce Laser: raggio di luce che trasmette energia al fluoroforo Gli elettroni del fluoroforo vengono eccitati Interrompo l eccitazione del laser Gli elettroni ritornano allo stato non eccitato Perdono l energia accumulata Emettono luce

26 Esempi: IF su cellule Cellule staminali neurali Nestin Neuroni MAP2 Nuclei TOPRO-3 Precursori degli oligodendrociti NG2 Oligodendrociti immaturi O4 Nuclei TOPRO-3

27 Esempi: IF su tessuto Midollo spinale di ratto dopo lesione Cellule staminali neurali Nestin Astrociti GFAP Nuclei TOPRO-3 Cellule della meninge del midollo spinale di ratto dopo lesione Cellule staminali neurali Nestin Neuroni immaturi DCX Nuclei TOPRO-3

28 Immunoistochimica (IHC) Ossidazione del substrato DAB HRP AB secondario anti-primario In immunoistochimica, l anticorpo secondario è coniugato con l enzima HRP Tessuto AB primario anti-a Antigene A La reazione con la molecola DAB permette l ossidazione e la colorazione scura del substrato HRP: horseradish peroxidase (perossidasi del rafano). Enzima in grado di ossidare dei substrati DAB: 3,3'-Diaminobenzidina. Quando viene ossidata dall HRP diventa marrone

29 Esempi: IHC su tessuto Neuroni motori Mielina (MBP)

30 Immunolocalizzazione Fluoroforo HRP AB secondario anti-primario AB primario anti-a Antigene A Campione

31 Protocollo standard immunofluorescenza 1. Scongelare i campioni 2. Lavare con PBS per eliminare OCT 3. Bloccare tutti gli antigeni 4. Incubazione con AB PRIMARIO 5. Eliminare AB primario non legato 6. Incubazione con AB SECONDARIO 7. Eliminare AB secondario non legato 8. Colorare il nucleo 9. Montare i vetrini con DABCO Solo se conservati a 20 C Se sono stati sezionati a basse temperature Blocking solution con BSA, FBS Si legherà solo all antigene specifico, gli altri antigeni sono legati dai componenti della blocking solution (< AFFINITA ) Si legherà solo all AB primario Aiuta a mantenere la fluorescenza stabile nel tempo

32 Protocollo standard immunoistochimica 1. Scongelare i campioni 2. Lavare con PBS per eliminare OCT 3. Applicare EtOH-H 2 O 2 per disattivare perossidasi endogena 4. Bloccare tutti gli antigeni con blocking solution 5. Incubazione con AB PRIMARIO 6. Eliminare AB primario non legato 7. Incubazione con AB SECONDARIO coniugato a HRP 8. Eliminare AB secondario non legato 32

33 Protocollo standard immunoistochimica 9. Reazione DAB con substrato HRP 10. Bloccare reazione della con H 2 O 11. Passaggi di disidratazione 12. Passaggio finale in Xilene 13. Montare i vetrini con Entellan IMPORTANTE: lasciare asciugare le fettine 50% EtOH 70% EtOH 2x 95% EtOH 100% EtOH 33

34 Microscopi La microscopia è la scienza che studia i piccoli oggetti con specifici strumenti: i Microscopi

35 Microscopi A seconda della posizione degli obiettivi, i microscopi possono essere divisi in due categorie: - Diretti: la sorgente luminosa e il condensatore sono in basso, lo stage punta verso l alto, gli obiettivi sono sopra lo stage e puntano verso il basso - Invertiti: la sorgente luminosa e il condensatore sono in alto, lo stage punta in basso, gli onbiettivi sono sotto lo stage e puntano verso l alto

36 Microscopi Ci sono diversi tipi di microscopi: - Luce trasmessa: luce visibile e con un sistema di lenti che ingrandisce l immagine di piccoli campioni - Fluorescenza:utilizza la fluorescenza per visualizzare e generare immagini del campione - Confocale: utilizza dei laser invece della fluorescenza, acquisisce le immagini su un singolo piano Altri - Stereomicroscopio: per microchirurgie e dissezione dei tessuti - A trasmissione di elettroni: utilizza elettroni invece della luce 36

37 Microscopio a luce trasmessa Diretto Invertito

38 Microscopio a luce trasmessa Lente condensatrice Lampada alogena Obiettivo Oculari Campione

39 Microscopio a luce trasmessa Conta cellule Colorazioni istologiche Korosi et al., Behav Brain Res 2011 IHC

40 Microscopio a fluorescenza Diretto Invertito

41 Microscopio a fluorescenza GFP RFP TOPRO-3 41

42 Microscopio a fluorescenza Filtro di eccitazione Specchio dicroico Oculari Lampada a fluorescenza, con lunghezza d onda specifica Obiettivo Filtro di emissione Eccitazione Campione Emissione Campione

43 Microscopio a fluorescenza Conta cellule con coloranti fluorescenti IF

44 Microscopio confocale

45 Microscopio confocale Filtro di eccitazione Specchio dicroico Pinhole di rilevazione Oculari Laser Pinhole di illuminazione Filtro di emissione Obiettivo Campione

46 Microscopio confocale

47 Microscopio confocale IF su cellule, antigeni intracellulari IF su tessuti Riley, K.C., Woodarda, J.P., Hwanga, G.M., Punyasenac, S.W.: Progress towards establishing collection standards for semi-automated pollen classification in forensic geohistorical location applications. Rev. Palaeobot. Palynol. 221, (2015). Ricostruzioni 3D

48 Microscopia Time-lapse Microscopia Time-lapse consente l acquisizione di immagini di cellule vive Il microscopio cattura un immagine ad intervalli di tempo stabiliti (dall operatore), per un dato periodo di tempo (a scelta). Permette di vedere i movimenti delle cellule in coltura o all interno di un tessuto Es. 1 immagine/min, tempo totale: 2 ore 120 immagini