ISTOCHIMICA. Tecniche speciali

Transcript

1 ISTOCHIMICA Tecniche speciali

2 Classificazione dei pigmenti: 1) Pigmenti ESOGENI (Es: Fibre di amianto) 2) Pigmenti ENDOGENI a) EMATOGENI - Emoglobina (normalmente presente) - Emosiderina (grandi aggregati presenti solo in condizioni patologiche (Blu di Prussia) - Pigmenti biliari (Es: biliverdina) (Colorazione di Hall per la bile) b) NON EMATOGENI - Melanina (Metodo di Fontana-Masson) - Pigmenti lipidici > Lipofuscina (pigmento dell invecchiamento; granuli insolubili di colore marrone. Oil Red O, Sudan Nero, PAS) > Ceroidi (accumuli di lipidi nel fegato; Oil Red O e Sudan Nero) 3) Depositi endogeni a) Urati (Reazione argentaffine Methenamine Silver) 4) MINERALI a) Calcio b) Ferro c) Rame

3 COLORAZIONI PER AMMINE Le cellule che producono ormoni peptidici, amine bioattive o precursori (es: adrenalina) possono essere evidenziate da una serie di colorazioni specifiche. Tradizionalmente si classificano queste cellule in base alla proprietà di ridurre il nitrato d argento ad argento metallico (visibile come precipitati scuri): 1) Cellule CROMAFFINI 2) Cellule ARGENTAFFINI 3) Cellule ARGIROFILE (è necessaria una pre-riduzione) Questa distinzione artificiale dipende dal tipo di fissativo usato: soluzione di bicromato per le cromaffini (di solito associate alla midollare del surrene), formalina per le argentaffini.

4 ARGENTAFFINITÀ L'argentaffinità è la proprietà di un substrato organico di fissare sali d'argento e di provvedere nel contempo a ridurre quesi ultimi ad argento metallico. Questa proprietà implica la presenza nel tessuto di gruppi riducenti (e quindi non si usano agenti riducenti esterni). Impregnazione argentica secondo Gomori per lo studio della membrana basale dei glomeruli renali Tecnica di Schmorl Colorazione di Fontana-Masson

5 Gomori metenamina silver: Metodo impiegato per la visualizzazione di elementi argentaffini e mucopolisaccaridici (membrane basali, miceti, batteri, ecc.) su sezioni di tessuto ma è usato anche per gli urati. E il metodo di elezione per lo studio della membrana basale nella biopsia renale. Si basa sul principio che l acido periodico agendo su gruppi glicolici e glicoaminici presenti nella catena mucopolisaccaridica li ossida a gruppi aldeidici con conseguente rottura della catena. Il cloruro di argento, facente parte del complesso argento-metenamina è quindi ridotto ad argento metallico da questi nuovi gruppi aldeidici derivati dai polisaccaridi diventando così visibile. Spesso si colora con verde di metile per i nuclei. Risultati: Membrane basali, glicogeno, miceti e batteri nero Nuclei verde

6

7

8

9 Fontana-Masson per la melanina: Metodo di elezione per la visualizzazione del pigmento melanotico su sezioni di tessuto istologico. La reazione argentaffine è basata sull'intrinseca capacità di alcune componenti tessutali di agire quali sostanze riducenti sull'argento di una soluzione ammoniacale facendolo precipitare come argento metallico si tratta quindi di una impregnazione argentica (colorazione con fast red per i nuclei). Risultati: Melanina nero Nuclei rosso

10

11

12 ARGIROFILIA Col termine argentofilia (o argirofilia) si suole indicare l'affinità di un determinato substrato organico a legare sali d'argento. Se, a seguito di tale legame, il preparato viene trattato a mezzo di una sostanza riducente, dal sale si libera argento metallico di colore nero che consente l'individuazione della sostanza da evidenziare. Procedura di Grimelius; Metodo di Churukian-Schenk

13 Metodo di GRIMELIUS per l argirofilia Metodo per la dimostrazione di granuli argirofili (usato spesso per classificare i tumori neurosecretori). Come detto alcune componenti tissutali hanno l abilità di legare gli ioni argento in soluzione ma non di ridurlo ad argento metallico e per questo riducente viene usato esterno idrochinone). un (per agente es. un Per questa tecnica si usa sempre il nitrato d argento (e acido acetico).

14 Metodo di Churukian-Schenk per l argirofilia Altro metodo per la dimostrazione di granuli argirofili.

15 Metodo di PERLS per lo ione ferrico (Fe3+) Colorazione con il BLU DI PRUSSIA: Questa tecnica serve per rivelare il ferro che si localizza nelle cellule sotto forma di granuli di emosiderina. La reazione di Perls si basa sulla liberazione degli ioni Fe associati alle proteine mediante l azione dell acido cloridrico; questi ioni una volta liberati reagiscono con il ferrocianuro di potassio formando un precipitato blu detto ferrocianuro ferrico o blu di Prussia. I nuclei si possono colorare con l ematossilina (emallume di Mayer). associare con il Van Gieson. Risultati: Precipitati dove si trova il ferro blu Si può

16

17

18

19 Colorazione con il BLU DI TURNBULL per lo ione ferroso (Fe2+) Questa tecnica (che può essere considerata una variante del metodo di Perls) serve per rivelare lo ione ferroso nei tessuti. Le sezioni sono trattate con una soluzione acida di ferrocianuro potassico che reagendo con gli ioni ferrosi porta alla formazione di pigmenti blu insolubili (Blu di Turnbull). Il blu di Turnbull è identico al Blu di Prussia se non per gli ioni Fe. I nuclei si possono colorare con il Nuclear Fast Red. Risultati: Precipitati dove si trova il ferro blu

20

21 Blu di Prussia Blu di Turnbull Reagenti: Reagenti: Ferrocianuro di potassio 2% (in acqua) Soluzione di HCl 0.06N (in acqua) Soluzione al 2% di HCl (in acqua) Soluzione di ferrocianuro di potassio in HCl 0.06N Soluzione di Nuclear Fast Red Soluzione di acido acetico 1% in acqua Procedura: Soluzione di Nuclear Fast Red 1. Deparaffinizzare e reidratare la sezione 2. Immergere le sezioni in una soluzione 1:1 (Feroocianuro di potassio e HCl) per 20 min a 60 C 3. Lavare in acqua corrente. 4. Colorazione di contrasto con Nuclear Fast red per 5 min. 5. Lavare. Procedura: 1. Deparaffinizzare e reidratare la sezione 2. Immergere le sezioni nella soluzione di ferrocianuro di potassio per 60 min a temperatura ambuiente. 3. Lavare in acido acetico 1%. 4. Colorazione di contrasto con Nuclear Fast red per 5 min. 5. Lavare

22 ASBESTOSI Patologia polmonare da inalazione di fibre di amianto, sostanze composte da diversi silicati (crisotile, tremolite, crocidolite, actinolite) che contengono oltre al silicio, anche ferro, calcio e magnesio. Si manifesta come una fibrosi alveolare e pleurica diffusa, che provoca dispnea progressiva, tosse con presenza nell'espettorato di "corpi asbestosici", complessi ferruginosi colorabili con il blu di Prussia o il blu di Turnbull. Una volta instaurata la fibrosi, l'asbestosi può continuare ad evolvere fino alla insufficienza cardiorespiratoria anche se il paziente non è più esposto. Frequente è l'associazione con il carcinoma polmonare ed il mesotelioma pleurico.

23

24 Metodo di SCHMORL Questa tecnica (simile al blu di Turnbull) può essere utilizzata sia per l identificazione dello ione ferroso, ma anche per la melanina e altre sostanze argentaffini (dimostra la presenza di sostanze riducenti nei tessuti)

25 Metodo della Rodanina per il RAME È un metodo usato per determinare il rame nei tessuti, specialmente nel fegato nella malattia di Wilson. La malattia di Wilson è una malattia ereditaria, autosomica recessiva caratterizzata da un eccesso di rame accumulatosi in diversi tessuti dell'organismo, in particolare nel fegato, nel sistema nervoso centrale e nella cornea dell'occhio. Tale accumulo è provocato da una ridotta escrezione biliare del rame. La tecnica si basa sulla capacità della 5-p-dimetilbenzilidene-rodanina di legarsi sia al rame libero che al rame associato alle proteine.

26

27 Metodo dell acido rubeanico per il RAME È un altro metodo usato per determinare il rame nei tessuti. L acido rubeanico reagisce con il rame e forma dei precipitati nero-verdasti (rubeanato di rame).

28 Metodo di Dahl all Alizarin red S (calcio): Il rosso di alizarina è un colorante antrachinonico in grado di formare complessi con il calcio. Risultati: Depositi di calcio arancio-rosso

29

30 Metodo di von Kossa (calcio): La colorazione di von Kossa è usata per quantificare la mineralizzazione nelle colture cellulare e nelle sezioni di tessuti (cioè la presenza di Sali di calcio). Il metodo si basa sulla fissazione da parte dei sali di calcio dell'argento metallico ottenuto per riduzione dal nitrato mediante esposizione alla luce solare o ultravioletta. Il metodo di von Kossa trova, pertanto, utile applicazione nello studio dell'osso non decalcificato. Di solito si fa anche una colorazione successiva con fast red per visualizzare i nuclei. Risultati: Depositi di calcio nero Nuclei rosso

31

32

33 Tecniche immunoistochimiche Gli anticorpi (immunoglobuline) specifici sono diretti verso uno o più parti dell antigene (i determinanti antigenici), ciascuno dei quali sarà riconosciuto da un singolo anticorpo. Le tecniche immunoistochimiche sfruttano la capacità degli anticorpi di legarsi all antigene specifico. - anticorpo coniugato con l enzima perossidasi - incubazione con la sezione, dove si legherà all antigene - incubazione con un substrato dell enzima (diamminobenzidina) - la perossidasi trasforma la diamminobenzidina in un prodotto colorato nel punto esatto ove si era legato l anticorpo, rivelando così la localizzazione dell antigene. prodotto colorato METODO DIRETTO prodotto colorato P DAB P DAB METODO INDIRETTO

34 Localizzazione immunoistochimica di cellule Localizzazione immunoistochimica di cellule epiteliali e macrofagi bronchiali della lamina propria