Metodi dell ecologia microbica

Transcript

1 Metodi dell ecologia microbica -Biodiversità: isolamento identificazione e quantizzazione dei microrganismi nei diversi habitat; -Attività microbica: misura di ciò che i microrganismi fanno nel loro ambiente

2 Analisi delle comunità microbiche -Metodi colturali: isolamento e coltivazione delle diverse componenti di una comunità; -Metodi molecolari: identificazione e quantizzazione delle diverse componenti di una comunità senza coltivarli.

3 Coltura di arricchimento Il terreno (i nutrienti) e l insieme delle condizioni di incubazione sono scelte in modo da essere selettive per l organismo desiderato e controselettive per gli organismi non desiderati. Fornisce informazioni solo sulla presenza di un determinato microrganismo in un campione ambientale ma non sulla sua importanza ecologica né sulla sua abbondanza.

4 Analisi quantitativa di una comunità microbica: colorazione e osservazione al microscopio DAPI (4,6-diamido-2-fenilindolo) fluorocromo che lega gli acidi nucleici e non reagisce con materiale inerte LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Stain - Colorante verde: penetra in tutte le cellule - Colorante rosso: penetra solo nelle cellule morte

5 ANTICORPI FLUORESCENTI Microcolonie di Sulfolobus acidocaldarius GFP (Green Fluorescent Protein) Cellule di Pseudomonas fluorescens

6 FISH

7 LIMITI DEI METODI DI COLTURA VANTAGGI DELLA FISH Richiedono tempo Sono, a volte, troppo selettivi Sottostimano la diversità microbica dei campioni ambientali o clinici Non richiede la coltivazione Elevata sensibilità Sicuro per l operatore

8 COLTIVABILITA Microbiological Reviews, Mar. 1995, p

9 LE MOLECOLE DELLA FISH IL BERSAGLIO : rrna LA SONDA : OLIGONUCLEOTIDI bp

10 RIBOSOMI PROCARIOTICI

11 Perché gli rrna? Presenti in tutti gli organismi viventi Relativamente stabili Elevato numero di copie (diverse migliaia/cellula) Comprendo sequenze altamente conservate e sequenze altamente variabili

12 Sequenze tipizzanti (signature sequenses)

13

14 La sonda: scelta della sequenza Microbiological Reviews, Mar. 1995, p //

15 La sonda: metodi di marcatura = fosfatasi alcalina = fluoresceina tirammide

16 Fluorocromi

17 La procedura della FISH

18 perché? Fissazione.. Mantenere l integrità cellulare e le caratteristiche morfologiche Proteggere gli RNA dalla degradazione da parte delle RNAsi endogene Permeabilizzare le cellule e permettere l ingresso della sonda

19 metodo Fissazione.. Prelievo del campione Soluzione fissativa 4 C Soluzione fissativa: Agenti cross-linking: aldeide o parafolmaldeide 3-4% (Gram-negativi) Agenti che favoriscono la precipitazione: etanolo o metanolo 50% (Gram-positivi)

20 Preparazione del campione.. Trattare la superficie del vetrino con agenti di adesione (gelatina, poly-l-lisina) Trasferire un aliquota del campione sul vetrino Asciugare all aria

21 Preparazione del campione.. Disidratare in etanolo % 80% 100% Asciugare all aria Trattamento enzimatico (es. lisozima, mutanolisina)

22 Ibridazione campione sonda..... Tampone di ibridazone (NaCl; Tris/HCl ph 8.0; formamide; SDS) Incubazione (37-50 ) per 0,5-2 ore L incubazione deve essere eseguita sotto condizioni di strigenza per garantire un appropriato annealing della sonda con la sequenza bersaglio

23 Lavaggi Eseguiti nelle stesse condizioni di stringenza dell ibridazione 16 S Servono ad eliminare la sonda in eccesso 23 S Microbiological Reviews, Mar. 1995, p

24 Visualizzazione Microscopio a epifluorescenza o ad acquisizione laser confocale Macchina fotografica digitale applicata al microscopio Software per l analisi dell immagine

25 Applicazioni Diversità microbica nei campioni ambientali - habitat quatici - suolo - rizosfera Diversità microbica nel trattamento delle acque di scarico - bioreattori - fanghi attivi Batteri simbionti Analisi di comunità microbiche complesse - cavità orale - flora gastro-intestinale - infezioni del tratto respiratoio Identificazione di patogeni nei tessuti o nel materiale biomedico sterile

26 Es.: placca subgengivale (da un paziente con periodontite) Verde: sonda eubatterica (EUB338 FITC ), per la visualizzazione delle diverse morfologie batteriche; Giallo: sonda specifica per i treponemi (spirocheti) di gruppo I (TRE I Cy3 ), la maggior parte dei quali non è coltivabile. Verde: sonda specifica per i treponemi di gruppo I (TRE I FITC ); Giallo: sonda specifica per i treponemi di gruppo II (TRE II Cy3 ).

27 Es.: biofilm subgengivale (organizzazione e distribuzione spaziale di treponemi) Sezione a basso ingrandimento Verde: sonda eubatterica (EUB338 FluoX ); Giallo: sonda specifica per i treponemi di gruppo I (TRE I Cy3 ). Sezione a più alto ingrandimento ingrandimento

28 Es.: biopsia di tessuto animale malato di dermatite digitale Verde: sonda eubatterica (EUB338 FITC ); Giallo: sonda specifica per i treponemi (spirocheti) di gruppo I (TRE I Cy3 ). Microscopio a epifluorescenza Microscopio a epifluorescenza + charged coupled device (CCD) camera Microscopio laser confocale