MIGLIORAMENTI NELLA CITOLOGIA DEI VERSAMENTI. Quale strategia adottare?

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1 19 Corso Nazionale per Tecnici di Laboratorio Biomedico Riccione, maggio 2012 MIGLIORAMENTI NELLA CITOLOGIA DEI VERSAMENTI Quale strategia adottare? Laboratorio di Diagnostica Istopatologica AOU Careggi - Firenze Angela Cappadona, Alfredofranco Barbetti

2 Un po di numeri Campioni citologici eseguiti nel 2011: Tipologia campioni Numero campioni Urine + FISH 2907 (8721) Endometriali 784 Pap Test e HPV 2 livello Agoaspirati 1863 Versamenti Altro Urine Endometriali Pap Test (+HPV Test) Agoaspirati Versamenti Altro

3 Strumentazione in dotazione al laboratorio THINPREP 5000 (HOLOGIC) SISTEMA AD ASPIRAZIONE PREP MATE E PREPSTAIN (BD) SISTEMA A GRADIENTE CYTOSPIN3 (SHANDON) CYTOSPIN

4 Caratteristiche della citologia in fase liquida 1. FISSATIVO 2. LAVAGGIO DEL CAMPIONE 3. RACCOLTA DELLE CELLULE

5 Caratteristiche della citologia in fase liquida FISSATIVO 2. LAVAGGIO DEL CAMPIONE 3. RACCOLTA DELLE CELLULE

6 Fissativi nel Sistema ad aspirazione Fissativo di trasporto Soluzione CYTOLYT (20-50% metanolo in acqua, tamponata) Fissativo nelle fiale Soluzione PRESERVCYT ( 30-60% metanolo in acqua, tamponata)

7 Fissativi nel Sistema a gradiente Fissativo di trasporto Soluzione CYTORICH RED (23,3% isopropanolo; 10% metanolo; 6,7% glicole etilenico; 0,4% formalina concentrata) Fissativo nella fiala Soluzione SUREPATH Preservative fluid (21,7% etanolo; 1,2% metanolo; 1,1% isopropanolo; 0,03% formaldeide)

8 Caratteristiche della citologia in fase liquida FISSATIVO 2. LAVAGGIO DEL CAMPIONE 3. RACCOLTA DELLE CELLULE

9 Lavaggio nel Sistema ad aspirazione Arricchimento per centrifugazione Eventuali lavaggi con : Mucolitico fissativo addizionato con ACETILCISTEINA (0,2%) Emolitico fissativo con aggiunta di ACIDO ACETICO (10%) Risospensione nella fiala

10 Lavaggio nel Sistema a gradiente Arricchimento per centrifugazione Risospensione nella fiala Separazione su gradiente di densità per centrifugazione Rimozione dei fattori oscuranti (sangue, muco, detriti ed eccesso di cellule infiammatorie)

11 L idrossietil amido è un colloide artificiale non ionico dell amido, prodotto addizionando gruppi idrossietiletere all amilopectina. Le ramificazioni si osservano ogni molecole di glucosio polimerizzato e ciò rende la molecola solubile. Le diverse tipologie di polimero, con peso molecolare tipico di circa kda, sono usualmente miscele più o meno eterogenee comunemente descritte in base alla concentrazione percentuale (grammi per 100 ml di soluzione isotonica). Sono state descritti numerosi metodi di purificazione di popolazioni o sottopopolazioni cellulari arricchibili mediante centrifugazione su gradienti di densità basati su soluzioni polisaccaridiche ad alto peso molecolare.

12 Centrifugazione in gradiente di densità Centrifugazione isopicnica: viene sfruttata la densità idrostatica delle particelle e non la loro forma o dimensione; si utilizza un gradiente di densità continuo; è una centrifugazione all equilibrio, che consiste nel portare ogni componente della miscela ad un livello del gradiente corrispondente alla propria densità; la separazione risulta indipendente dal tempo di centrifugazione.

13 Centrifugazione in gradiente di densità: passaggi campione gradiente Pellet cellulare Prima della centrifugazione Dopo la centrifugazione Dopo aspirazione surnatante

14 Caratteristiche della citologia in fase liquida FISSATIVO 2. LAVAGGIO DEL CAMPIONE 3. RACCOLTA DELLE CELLULE

15 Raccolta delle cellule nel Sistema ad aspirazione Allestimento vetrini con sistema automatico Colorazione in coloratore automatico a parte

16 Filtro di policarbonato al microscopio elettronico

17 Liquido ascitico EE 4X Drenaggio linfocele EE 10X

18 Raccolta delle cellule nel Sistema a gradiente Deposizione delle cellule per DECANTAZIONE L apparecchio esegue anche la colorazione dei vetrini

19 Descrizione del lavoro Tipologia di campioni: Liquidi ascitici, peritoneali, pleurici, pericardici, pelvici, broncolavaggi, ecc. agoaspirati ovarici, mammari, cistici, linfonodali, ecc. liquidi vari (BAL, escreati, brushing, ecc.). Metodologia: suddivisione del campione in due aliquote per l allestimento dei vetrini con i due metodi. Quando possibile, è stato allestito anche il citoincluso.

20 Liquido ascitico EE 10X Risultati: colorazione di base col Sistema ad aspirazione Broncolavaggio EE 10X Liquido ascitico EE 20X

21 Liquido ascitico PAP 20X Risultati: colorazione di base col Sistema a gradiente Liquido ascitico PAP 10X Drenaggio linfocele PAP 10X

22 Risultati: immunocitochimica col Sistema ad aspirazione Broncolavaggio TTF-1 10X Broncolavaggio CK 5/6 10X Broncolavaggio CK 7 10X

23 Risultati: immunocitochimica col Sistema a gradiente Liquido ascitico CK 7 10X Broncolavaggio TTF-1 10X Broncolavaggio CK 7 10X

24 Comparazione dei metodi: CASO 1 - Colorazione di base Broncolavaggio Sistema a gradiente PAP 10X Sistema ad aspirazione EE 10X

25 Comparazione dei metodi: CASO 1 - Immunocitochimica Sistema ad aspirazione TTF-1 10X Broncolavaggio Sistema a gradiente TTF-1 10X

26 Comparazione dei metodi: CASO 2 - Colorazione di base Liquido ascitico Sistema a gradiente PAP 40X Sistema ad aspirazione EE 20X Citoincluso EE 20X

27 Comparazione dei metodi: CASO 2 - Immunocitochimica Sistema ad aspirazione CK 7 20X Sistema a gradiente CK 7 40X Liquido ascitico Citoincluso CK 7 20X

28 Conclusioni - 1 Pro e contro dei metodi Caratteristiche Sistema ad aspirazione Sistema a gradiente Automazione Ottima Buona Colorazione In coloratore esterno Integrata (Papanicolau) Allestiti multipli Solo in modalità singola Fino a 4 Software Ottimo Sufficiente Parametri di lavorazione Predefiniti Impostabili Accessibilità Ottima Ottima Sicurezza Ottima (sistema chiuso) Buona (protezione consigliata)

29 Conclusioni 2 Risultati: caratteristiche a confronto Caratteristiche Sistema ad aspirazione Sistema a gradiente Cellularità Conservazione cellulare Buona Ottima Distribuzione delle cellule Disomogenea Uniforme Raggruppamenti diagnostici Fondo (fattore oscurante) Talvolta presente Raramente presente Eritrociti Marcatamente ridotti Marcatamente ridotti Linfociti/PMN Ridotti Ridotti Detriti proteine Ridotti Marcatamente ridotti Aspetto cellulare Schiacciamento Tridimensionalità Immunocitochimica Variabilità dei risultati Ottima

30 La citologia dei versamenti ottenuta con Sistema a gradiente, nell esperienza del nostro laboratorio, dà risultati significativamente migliori del Sistema ad aspirazione e può essere risolutiva soprattutto nei campioni scarsamente cellulati e in quelli con abbondanza di materiale oscurante.

31 Ringraziamenti Prof. Gian Luigi Taddei, per averci seguiti e consigliati con costanza ed entusiasmo; Dr.ssa Gianna Baroni, per i preziosi suggerimenti nell allestimento dell immunocitochimica