Riassunto La fermentazione degli impasti acidi è una tecnologia utilizzata nella produzione di numerosi prodotti da forno come pane, dolci e cracker,

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1 Riassunto La fermentazione degli impasti acidi è una tecnologia utilizzata nella produzione di numerosi prodotti da forno come pane, dolci e cracker, e la sua applicazione è in continuo aumento. In Italia gli impasti acidi sono utilizzati per la produzione di oltre 200 tipi di pani tradizionali, che si differenziano per il tipo di farina, ingredienti, tecnologia e processi di fermentazione. Il Cornetto è un pane tradizionale prodotto nelle piccole panetterie di Matera (Basilicata) che recentemente ha ottenuto la denominazione IGP da parte della Comunità Europea (decreto 9/6/2007, Gazzetta Ufficiale dell Unione Europea n. 239, 11/10/2004). Secondo lo standard IGP, questo pane è prodotto con farine di grano duro, NaCl (2% w/w), acqua e madre acida come agente lievitante. La fermentazione, effettuata a temperatura ambiente (20-30 C) fino ad un ph di circa 4,0, è caratterizzata da continui rinfreschi per mantenere le colture microbiche in uno stato metabolico attivo. L aggiunta degli impasti acidi durante il processo di panificazione migliora la qualità e il sapore dei prodotti da forno. Durante la fermentazione, infatti, le attività metaboliche che si verificano sono responsabili dei cambiamenti delle caratteristiche della farina, nonché dell aroma, del gusto, del valore nutrizionale e della conservazione del pane. I batteri lattici, insieme ai lieviti, sono i microrganismi che dominano gli impasti acidi e le proprietà organolettiche e nutrizionali del pane dipendono da loro metabolismo e dalla loro attività di cooperazione. Pertanto, lo studio della composizione microbica è importante per determinare le potenziale dei microrganismi negli impasti acidi (capitolo I). Il progetto di ricerca è stato suddiviso in due parti: identificazione e caratterizzazione dei batteri lattici (parte 1) e risposta allo stress dei batteri lattici (parte 2). La Parte 1 è stata focalizzata sulla caratterizzazione tecnologica dei batteri lattici (capitolo II). I ceppi, isolati da impasti acidi per la produzione del pane Cornetto di Matera, sono stati identificati mediante SDS-PAGE delle proteine intracellulari totali. Il 55% degli isolati apparteneva alla specie Lactobacillus plantarum, il 15% e il 13% alle specie Leuconostoc mesenteroides e Lb. curvatus, rispettivamente. Cinque ceppi di Lb. paraplantarum, due di Weissella cibaria e uno di Lb. pentosus sono stati 123

2 ugualmente isolati tra la microflora lattica. I ceppi sono stati testati per la loro capacità acidificante, attività antimicrobica e produzione di esopolisaccaridi (EPS). Diversi ceppi di Lb. plantarum e Leuc. mesenteroides presentavano un elevata capacità acidificante dopo 6 e 24 ore di incubazione. L attività antimicrobica è stata testata nei confronti dei seguenti ceppi: Lb. paracasei, Lb. plantarum, Micrococcus flavus, Listeria innocua e Bacillus cereus. Le specie avevano diversi profili di inibizione e in alcuni casi l attività antimicrobica era ceppo-specifica. Lb. plantarum aveva il più ampio spettro di inibizione, mentre gli isolati di W. cibaria e Leuc. mesenteroides non mostravano alcuna attività antimicrobica. Nessun ceppo aveva attività antimicrobica nei confronti di Bacillus cereus. L attività inibitoria di cinque ceppi era probabilmente dovuta alla produzione di batteriocine. La produzione di EPS è stata testata su MRS solido contenente il 2% (w/w) di glucosio o maltosio e il 5% (w/w) di saccarosio, e successivamente confermata in MRS liquido addizionato degli stessi zuccheri. tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides e W. cibaria producevano destrano dal saccarosio. Alcuni ceppi di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum producevano EPS da diversi zuccheri in substrato solido. La produzione in substrato liquido era differente a seconda della specie. Diversi ceppi di Lb. plantarum hanno mostrato la più alta produzione di EPS nei substrati contenenti glucosio e maltosio come fonte di carbonio, altri avevano una buona produzione in tutti i terreni. In questo lavoro sono state testate anche le attività enzimatiche dei ceppi di batteri lattici (capitolo III). Le attività ureasica, peptidasica, fitasica, fosfatasica e β-glucosidasica sono state determinate in substrati sintetici utilizzando metodi spettrofotometrici. L attività proteolitica è stata misurata in impasti acidi modello, utilizzando impasti neutri e acidificati come controllo. Tutti i ceppi hanno mostrato una bassa attività ureasica, glutamil aminopeptidasica e iminopeptidasica, mentre significative differenze sono state osservate all interno delle specie per le altre attività enzimatiche. I ceppi di Leuconostoc mesenteroides e Lactobacillus curvatus hanno dimostrato un elevata attività aminopeptidasica, X-prolil dipeptidil aminopeptidasica, β-glucosidasica, fitasica, mentre le attività enzimatiche dei ceppi di Lb. plantarum, Lb. pentosus e Weissella cibaria erano dipendenti dal ceppo. 124

3 Il capitolo IV riporta lo studio dell attività proteolitica che si verifica durante la la fermentazione degli impasti acidi. La proteolisi è stata valutata in impasti acidi modello ottenuti con farina di grano duro inoculati con sei diversi ceppi di batteri lattici, in associazione o meno con un lievito commerciale. La conta cellulare, il ph e la concentrazione di aminoacidi liberi sono stati misurati a diversi tempi di incubazione ed un estrazione sequenziale è stata effettuata per separare le diverse frazioni proteiche. La frazione proteica (albumine e globulina) solubile in soluzione salina è stata analizzata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (RP- HPLC) e SDS-PAGE, mentre le frazioni solubili in propanolo (gliadine) e insolubili (glutenine) sono state analizzate solamente con SDS-PAGE. Metodi statistici multivariati sono stati utilizzati per l analisi dei risultati. La presenza del lievito e dei batteri lattici ha influenzato in modo complesso i profili RP-HPLC e SDS-PAGE delle proteine solubili. Gli unici cambiamenti a carico delle proteine del glutine correlati alla presenza dei batteri lattici hanno riguardato la comparsa di nuovi frammenti proteici (20 e 27 kda) dalle gliadine e la degradazione delle subunità di glutenina ad alto peso molecolare. La Parte 2 di questo lavoro è stata focalizzata sulla risposta allo stress dei ceppi di batteri lattici. Le cellule sono state raccolte in fase stazionaria, lavate due volte in soluzione salina sterile (0,85% w/v di NaCl) e risospese in diversi substrati per ottenere le seguenti condizioni di stress: a) MRS liquido, ph 2,0 (aggiustato con HCl, stress acido); b) MRS liquido contenente NaCl 1 mol/l (stress osmotico); c) soluzione di H 2 O 2 allo 0,3% v/v (stress ossidativo). I trattamenti sono stati applicati per 30 minuti a 30 C. Dopo l incubazione, la vitalità cellulare basata sull integrità della membrana è stata valutata utilizzando il Live/Dead (L/D) BacLight TM Bacteria Viability kit, mentre l attività metabolica è stata determinata valutando la riduzione del colorante redox 2-(iodiofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-feniltetrazolio cloruro (INT) in rosso formazano insolubile (capitolo V). Un confronto tra la conta diretta al microscopio e la conta in piastra è stato effettuato per diversi ceppi. Tutti i ceppi di Lb. curvatus erano intolleranti allo stress, mentre quelli appartenenti alle specie W. cibaria e Leuc. mesenteroides hanno dimostrato ridotta tolleranza allo stress acido. I più alti livelli di tolleranza agli stress sono stati osservati per i ceppi di Lactobacillus plantarum e Lactobacillus paraplantarum. Una buona correlazione tra la conta diretta 125

4 al microscopio e la conta in piastra è stata trovata in seguito all esposizione agli stress acido e osmotico, ma la stima delle cellule vive effettuata con la colorazione Live/Dead era superiore a quella ottenuta mediante conta in piastra dopo l esposizione allo stress ossidativo. Pertanto, per determinare la vitalità cellulare, l attività metabolica e coltivabilità sono indicatori più affidabili rispetto all integrità della membrana. Le cinetiche di crescita di Weissella cibaria DBPZ1006 in funzione del ph e dell attività dell acqua (a w ) sono state valutate durante fermentazioni batch (capitolo VI). I parametri di crescita (fase lag, velocità specifica di crescita, fase asintotica) sono stati stimati confrontando l equazione modificata di Gompertz (Zwietering et al., 1990) e il modello dinamico di Baranyi e Roberts (1994). L effetto combinato del ph e dell a w sulla cinetica di crescita è stato determinato utilizzando un modello cardinale. W. cibaria è stata in grado di crescere a diversi valori di ph e aw. La massima velocità specifica di crescita è stata osservata a ph 6,5. Tuttavia, il microrganismo presenta un elevata µ max anche a ph compresi tra 5,5 e 7,5 e i valori pari a 4,5, 5,0 e 8,0 sono stati tollerati. La crescita di W. cibaria era fortemente, ma non completamente, inibita a ph 4,0. La velocità di crescita in funzione dell a w diminuiva all aumentare della concentrazione di sale, ma il ceppo di W. cibaria è stato in grado di crescere anche al valore minimo (0,942) testato in questo studio. Il lavoro ha dimostrato che il ceppo W. cibaria DBPZ1006 è stato in grado di adattarsi ad elevate concentrazione di sale e bassi valori di ph, suggerendo il suo potenziale uso come coltura starter nell industria della panificazione. I risultati del progetto di ricerca ha dimostrato che alcuni ceppi di Lb. plantarum, Lb. curvatus e Leuc. mesenteroides, inoltre, potrebbero essere selezionato per la produzione di colture starter miste per migliorare il sapore, la consistenza e il valore nutrizionale del pane e di altri prodotti da forno ottenuti mediante fermentato acida. 126

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6 128 Finito di stampare nel mese di dicembre 2009 per conto del Consiglio Regionale della Basilicata