Evidenza problematiche

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Aurora Crippa
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1 Evidenza problematiche processazione, inclusione e taglio agobiopsie e macrosezioni

3 FISSAZIONE o FORMALDEIDE 4% 6 12 ore o Fissativi alternativi

4 Processazione T min v/p Formalina 37 5 si 1. Alcool 70% si 2. Alcool 95% si 3. Alcool 95% si 4. Alcool ass si 5. Alcool ass si 6. Alcool ass si T min v/p 7. Xilene si 8. Xilene si 9. Xilene si 10.Paraffina si 11.Paraffina si 12.Paraffina si Totale 4 ore

5 Processazione T min v/p 1. Formalina si 2. H 2 O Shaper si 4. Ottix si 5. Ottix si 6. Ottix si 7. Ottix si 8. Paraffina si 9. Paraffina si 10.Paraffina si Metodiche intraday Tot 2 h,10

6 AGOBIOPSIE La Qualità Dimensione della biopsia Forma della biopsia Tecnica di inclusione ed allestimento dei preparati istologici

7 Dimensione della biopsia Le dimensioni del frustolo bioptico dipendono dal tipo di strumento utilizzato: Ago Ø 18 gauge Lunghezza cripta 18 mm

8 Forma della biopsia Mantenere tutti i frustoli bioptici su di un piano orizzontale Evitare l'incurvamento e l aggrovigliamento dei frustoli bioptici Evitare frammentazione e la perdita delle estremità delle biopsie

9 Campioni liberi in formalina

10 blocchetto vetrino

11 Tecnica di pre-inclusione o «tecnica sandwich»

12 L3 L2 L1 Frustolo libero in formalina forma curvilinea Prodotto preparato istologico Frustolo tecnica sandwich forma rettilinea L3 L2 L1

13 Inclusione in paraffina Prodotto della tecnica sandwich Biopsia dopo fissazione Inclusione in paraffina

15 Angolo (gradi) tra lama e tessuto Dott. Giorgio Bettarelli - - Anatomia Tec. Anatomia Patologica Patologica Ancona

16 Tecnica di inclusione ed allestimento dei preparati istologici Frustoli bioptici prelevati da differenti regioni della prostata dovrebbero essere inclusi separatamente Frustoli bioptici prelevati dalla stessa regione della prostata possono essere posti nello stesso blocco Non dovrebbero essere inclusi più di 2 frustoli bioptici per blocco È dimostrato che l inclusione simultanee di 3 o più frustoli bioptici può aumentare la perdita di tessuto sulla sezione istologica ( fino ad una lunghezza media di cm 1,15) Eur Urol 46: , 2004 WHO 2004

17 Sette frustoli inclusi contemporneamente

18 Allestimento preparati istologici Sono necessarie sezioni almeno a 3 livelli differenti del blocco per avere un analisi sufficiente del campione L3 L2 L1

20 Number of slides per core 1. All blocks are sectioned at 3-4 microns and stained with H&E 2. Three slides, each with at least 2 serial sections 3. Slides 1 and 3 are stained 4. Slide 2 (intervening unstained section) is kept for IHC 5. Benefits No need to re-cut new sections and no delay in pathology report Avoid disappearance of the subsequent pathology sections suspicious focus on Intervening slides are critical to establish a conclusive diagnosis in 2.8% of prostate biopsies, hence, sparing a repeat biopsy

21 Il sezionamento Altro fattore che può influire sulla integrità e totalità del tessuto è il piano di taglio: Variazione sul piano laterale lama

22 Il sezionamento Variazione sul piano longitudinale α

23 Il sezionamento Combinazione di varie possibilità lama

24 Allestimento preparato istologico Sezioni seriate dello spessore di 3-5 µm 3-8 Sezioni seriate ottenute per blocco e colorate con ematossilina - eosina Sezioni non colorate conservate per eventuali indagini immunoistochimiche (raccolte su vetri con cariche+)

25 Lunghezza 15 mm; 1mm 0,6 mm A B C α }β α angolo 3 β angolo 10 ASSE ANGOLO AREA Diagnosi 0,6 mm A 0 15,0 mm 2 100,0% B 3 13,3 mm 2 56,2% C 10 4,5 mm 2 27,9%

26 Probabilità di diagnosi Area (mm 2 ) della sezione di taglio , Livello 3 Livelli 9,01 80,8 4,52 40,8 2,29 20,7 1,57 14,1 9,9 1, L'area di sezione varia in relazione all'angolo di sezione tra lama e tessuto Livello 3 Livelli ,7 56,2 26,1 43,5 16,7 27,9 16,5 9,9 Angolo (gradi) Angolo tra (gradi) lama e tra tessuto lama e tessuto 7,2 11,9 5,3 8, Probabilità di identificare la neoplasia di mm 0,6 e angolo di sezione

27 Macro dal

28 MACROINCLUSIONI - MACROSEZIONI L entrata in routine in tempi relativamente recenti di queste metodiche spesso costringe il Tecnico a trovare soluzioni artigianali ai problemi quotidiani in attesa che l industria proponga strumenti validi

29 MACROINCLUSIONI - MACROSEZIONI Le prime difficoltà che il tecnico si trova d affrontare è costituito dalle dimensioni diverse da quelle di routine di: normale mega Cassette 40 x27 mm 73 x 53 xmm. Base mould 41X30X4mm 46X65X14mm Vetri 76X26mm 75X50mm Coprioggetti 40X50mm 65X50mm Archivi

30 MACROINCLUSIONI - MACROSEZIONI IL PRELIEVO: dopo la fissazione e la marcatura della superficie della prostata con inchiostro di china la prostata viene sezionata con l ausilio di un affettarice in fettine di circa 3-4 mm

31 MACROINCLUSIONI - MACROSEZIONI E importante che, al momento del prelievo, nel sistema informativo di reparto vengano registrate le inclusioni macro così da poterle sia quantificare che ritrovare facilmente

32 megacassette

33 MACROINCLUSIONI Protocollo standard di inclusione T min v/p T min v/p 1. Formalina 37 5 si 2. Alcool 70% 37 1 h 00 si 3. Alcool 95% 37 0 h 45 si 4. Alcool 95% 37 1 h 00 si 5. Alcool ass h 10 si 6. Alcool ass h 10 si 7. Alcool ass h 30 si 8. Xilene 37 1 h 10 si 9. Xilene 37 1 h 30 si 10.Xilene 37 1 h 30 si 11.Paraffina 58 1h15 si 12.Paraffina 58 1h30 si 13.Paraffina 58 1h45 si

34 Dopo la processazione i tessuti appaiono Eccessivamente molli Soluzioni vecchie nei processatori Programma errato Molto duri e friabili Tempi degli alcool eccessivamente lunghi Lievemente ondulati Abbastanza normale far aderire bene il tessuto al fondo della base per inclusione

35 La base per includere

36 Si possono trovare o costruire dei tamponi di diverse dimensioni utili per far aderire bene i campioni

37 A volte durante il taglio di tessuti particolarmente duri si può verificare il distacco del campione dalla cassetta. Può essere utile di routine effettuare alcuni fori sul fondo della cassetta prima dell inclusione per aumentare la superficie di adesione della megacassetta. E indispensabile sempre che la megacassetta sia molto calda per far aderire bene la paraffina

38 Per far aderire la prostata al fondo del base-mold si pone sul piano refrigerato e pressando con decisione utilizzando dei tamponi naturalmente caldi fino alla completa adesione

40 TAGLIO Adattare il portablocco del microtomo alle megacassette

41 Altri supporti possono essere ora disponibili per microtomi rotativi

42 E CONSIGLIABILE: TAGLIO Effettuare lo sgrosso delle sezioni al limite indispensabile senza sprecare materiale Usare una porzione di lama nuova per ogni blocco per evitare sezioni vibrate o saltate A volte è consigliabile non raffreddare eccessivamente i blocchi Raccolta sezioni togliendo le pieghe in acqua fredda prima di distenderle in acqua calda

44 La colorazione di routine, l H & E può essere effettuata sia manualmente che con coloratori automatci nel qual caso è indispensabile disporre di cestelli idonei

46 Montaggio con coprioggetto solo manuale

47 Colorazioni speciali Immunoistochimiche:» P63» LP34» CK 5/6» Racemase» Cocktail: es P63-Racemase

48 TAGLIO Nel caso di richieste di colorazioni speciali immunoistochimiche, per poter eseguire le colorazioni nei coloratori automatici e per risparmiare notevoli quantità di anticorpo è consigliabile, su indicazione del patologo, selezionare la parte di macrosezione che interessa segnandola sul vetrino riportare poi la selezione sul blocco incidendo la zona con un bisturi.

49 Sovrapporre il vetro al blocco Incidere il blocco con un bisturi

50 TAGLIO Al momento della raccolta delle sezioni è possibile in acqua fredda separare la zona da colorare dal resto del tessuto e raccogliere le sezioni su normali vetri con adesivo.

51 TAGLIO Macrosezioni al criostato per espianti Difficoltà per: Congelamento Ripianamento superfici Taglio Colorazione

54 ARCHIVIO Necessità di creare due archivi paralleli per lo stesso caso Difficoltà nel trovare archivi

57 E NECESSARIO CALCOLARE L IMPATTO DELLE MACROINCLUSIONI- MACROSEZIONI SUL CARICO DI LAVORO DELLA PROPRIA UNITA OPERATIVA

58 AUMENTI CONSISTENTI DEI TEMPI DI LAVORO SI VERIFICANO NELLE FASI: Processazione Inclusione Taglio Colorazione (?) Archiviazione

59 SE SI RAPPORTA IL CARICO DI LAVORO AL NORMALE BLOCCHETTO DI ROUTINE COLORATO CON H & E POTREBBE ESSERE RAGIONEVOLE UNA MACRO = 5-10 BLOCCHI NORMALI

60 Riccione maggio 2009

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