SEZIONAMENTO. Tecniche di Anatomia Patologica Dott. Giorgio Bettarelli

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1 SEZIONAMENTO Indipendentemente dalla fissazione e dal mezzo di inclusione utilizzati è necessario, per ottenere una diagnosi istologica, sezionare i tessuti. Il sezionamento avverrà secondo diverse modalità a seconda che i tessuti siano: congelati Inclusi in paraffina inclusi in resine

2 SEZIONAMENTO Tutte le inclusioni prima del sezionamento devono essere sottoposte alla fase di sgrosso. Lo scopo è quello portare in superficie tutte le strutture che devono essere analizzate.

3 SGROSSO

4 SEZIONAMENTO Tutti i metodi hanno come scopo di fornire sezioni di tessuto adatte all osservazione microscopica. Le caratteristiche fondamentali delle sezioni sono: 1. spessore 2. distensione 3. adesione

5 1. SPESSORE Lo spessore dovrebbe essere diverso a seconda del tipo di tessuto e/o di ricerca che si deve effettuare e dipende essenzialmente dalle dimensioni cellulari e dalla loro disposizione nei tessuti.

6 1. SPESSORE Le dimensioni cellulari variano notevolmente in natura a volte visibili ad occhio nudo (uovo) Ma nel corpo umano vanno dai 4μ di diametro alle decine o centinaia di micron delle cellule nervose

7 1. SPESSORE Poiché l osservazione microscopica avviene in trasparenza, è necessario avere una sezione con un solo strato di cellule che consenta una visione microscopica il più possibile nitida. Uno spessore di 4 8 μ è generalmente indicato nella maggior parte dei casi

8 SPESSORE 4 μ 5 μ Sezione 4μ 12 μ Cellule sovrapposte e visione confusa

9 SPESSORE 5 μ 10 μ 5 μ 5 μ

10 SPESSORE Esempi: Linfonodi B.O.M. sezioni sottili Tessuto cerebrale Sezioni spesse μ

11 2. DISTENSIONE Le sezioni, per poter consentire una visione ottimale al microscopio ottico devono essere prive di pieghe che possono impedire, sovrapponendo le diverse strutture, l accurata indagine da parte del patologo. Le tecniche variano seconda del metodo di inclusione e di taglio utilizzato.

12 2. DISTENSIONE Per le inclusioni in paraffina 1. Con il pennello sul polpasterllo 2. Quando si adagiano in acqua fredda 3. Con pennello e vetrino in acqua fredda 4. Dal vetrino all acqua calda con il pennello Attenzione nel punto 4 il pennello deve essere freddo e non si deve indugiare nello stesso settore della sezione

13 2. DISTENSIONE Una piega rimasta quando la sezione è in acqua calda non è più distensibile Con il pennello è facile bucare le sezioni quando sono in acqua calda

14 3. ADESIONE Per un efficace sviluppo delle tecniche di colorazione è quasi sempre indispensabile che le sezioni vengano adagiate su di un supporto trasparente e robusto in grado di sostenerle nelle varie fasi delle colorazioni istologiche. Deve essere quindi garantita un ottima adesione al supporto dal quale non si dovranno distaccare. Questo supporto è generalmente il: vetrino porta oggetto

15 3. ADESIONE Il vetrino porta oggetto Deve essere: 1. privo di polvere 2. ben sgrassato 3. a superfici perfettamente complanari 4. possibilmente con bordi molati 5. con una banda per scrivere 6. dimensioni standard.. 7. fuori misura per macrosezioni

16 3. ADESIONE Su vetri ben puliti è sufficiente l adesione che si ottiene quando si raccolgono le sezioni ben distese dall acqua aiutandosi con un pennellino. Con il drenaggio totale dell acqua che si trova tra il vetro e la sezione, ottenuto mediante scolatura ed asciugatura,si ottiene un effetto ventosa che impedisce generalmente successivi distacchi.

17 3. ADESIONE Se si prevede di dover effettuare sulle sezioni dei trattamenti particolarmente energici è possibile utilizzare dei vetri trattati con vari adesivi: Gelatina Albumina glicerinata Silano Vetri con cariche +

18 3. ADESIONE Silano Vetri perfettamente puliti Acetone 300cc. + 9 cc. silano - un passaggio di 40 2 lavaggi in acetone 20 cad. 3 lavaggi in H 2 O distillata 30 cad. lasciare asciugare coperti

19 3. ADESIONE Attenzione Utilizzando vetri con adesivo il riposizionamento delle sezioni durante la raccolta può essere difficoltoso con la possibilità di danneggiare o distruggere le fettine. Massima precisione quindi nella raccolta.

20 SEZIONAMENTO MICROTOMI A SLITTA ROTATIVI A RULLI

21 MICROTOMI

22 MICROTOMI I microtomi Microtomo a rulli con lama mobile

23 MICROTOMI Rotativo Automatico

24 SEZIONAMENTO

25 MICROTOMI Ultramicrotomo

26 SEZIONAMENTO In tutti i microtomi è possibile effettuare diverse regolazioni: inclinazione orizzontale LAMA inclinazione verticale BLOCCO inclinazione su più piani SPESSORE DELLE SEZIONI In alcuni microtomi è presente un meccanismo di RETRAZIONE

27 SEZIONAMENTO Altra variabile del taglio è la velocità con cui blocco e lama si incontrano e con cui viene effettuata la sezione. Dipende essenzialmente dal tecnico, dalla sua esperienza e sensibilità e varia secondo il tessuto, il tipo e la qualità dell inclusione.

28 LE LAME A B C

29 SEZIONAMENTO LE LAME L angolo di taglio

30 LE LAME L angolo di taglio λ β α λ λ α β = 2λ

31 L angolo di taglio

32

33 Il portablocco È opportuno mettere in bolla Montato su una sfera sblocco regolazione

34 LE LAME La lama al momento del taglio imprime una pressione sul campione il corretto anglo di taglio consente di stressare poco il preparato. Una corretta inclinazione e velocità consentono la formazione di una sezione a spessore regolare senza pieghe che può essere raccolta agevolmente.

35 SEZIONAMENTO LE LAME

36 SEZIONAMENTO LE LAME

37 SEZIONAMENTO LE LAME

38 SEZIONAMENTO ATTENZIONE PERICOLO NELL UTILIZZO DI TAGLIENTI TOGLIERE SEMPRE LA LAMA DOPO IL TAGLIO

39 REGOLA NELL AVVICINARSI CON LA MANO ALLA LAMA FARLO SEMPRE DALLA PARTE POSTERIORE VERSO IL FILO

40 REGOLA TUTTE LE AZIONI SULLA LAMA DEVONO ESSRE FATTE CON IL CARRELLO IN POSIZIONE NON PERICOLOSA! CIOE DIETRO O SOTTO LA LAMA

41 REGOLA QUANDO SI TRASFERISCE LA LAMA DAL PORTALAME AL MICROTOMO O VICEVERSA IMPUGNARE SALDAMENTE CON LA MANO LA LAMA SEMPRE DAL DORSO FERMANDOLA CON IL POLLICE ED IL MEDIO MENTRE L INDICE LA FERMA SUL DORSO

42 REGOLA PRIMA DI MONTARE LA LAMA LUBRIFICARE LE GUIDE CON L APPOSITO LUBRIFICANTE

43 REGOLA IL BLOCCHETTO PRIMA DEL TAGLIO VA RAFFREDDATO - 5/-15 C Da un blocco a temperatura ambiente è difficile ottenere sezioni sottili

44 SEZIONAMENTO

45 Artefatti da sezionamento erroneo Angolo di taglio sbagliato Lama o blocchetto mal fissati (effetto tende alla veneziana ) Percorso di taglio irregolare (sezioni con salto) Lame poco affilate (tessuto strappato) Bolcchetto caldo (sezioni spesse)

46 Artefatti da raccolta erronea Errore di raccolta (su vetrino con numero diverso) Eccesso di pieghe Buchi sulla sezione (da pennello) Raccolta di frammenti di tessuto anomalo pesciolini

47 Richieste particolari per il taglio Seriare: se non diversamente specificato nella richiesta eseguire più sezioni raccogliendo le fette a vari livelli contrassegnandoli sul vetro porta oggetto con numeri progressivi 1,2,3., lo scopo è quello di fornire una visione più completa del preparato e/o di evidenziare strutture descritte non presenti nella sezione di routine.

48 Richieste particolari per il taglio Sezioni per colorazioni istochimiche: se non diversamente specificato nella richiesta eseguire più sezioni raccogliendo il numero di fette necessarie contrassegnandole sul vetro porta oggetto con il nome della colorazione. Lo scopo è quello di fornire al patologo ulteriori informazioni utili alla diagnosi. Salvo diverse indicazioni non è necessario seguire un ordine di raccolta.

49 Richieste particolari per il taglio Sezioni per colorazioni immunoistochimiche: come precedente ma tutte le sezioni vanno raccolte con vetri porta oggetto con adesivo (silano, cariche +) Salvo diverse indicazioni non è necessario seguire un ordine di raccolta.

50 Richieste particolari per il taglio EBV (Epstein Barr Virus) come precedente. Istruzione particolare: pulire bene il portalame sostituire la lama mettersi i guanti Ciò è necessario per impedire che l antigene virale che dovrebbe essere presente nella sezione possa essere inquinato da fonti esterne (DNA-RNA operatore).

51 Richieste particolari per il taglio LINFONODO SENTINELLA (vecchio protocollo) Mammella: Sezioni a finire. Due sezioni ogni livello EE e CK. AE1 AE3 i primi 15 livelli ogni 50 μ dopo ogni 100 μ. Lo scopo è quello di verificare che nel linfonodo, a tutti i livelli, non siano presenti metastasi del tumore.

52 LINFONODO SENTINELLA Nuovo protocollo Mammella: CARCINOMA MAMMARIO NON METASTATICO. PROTOCOLLO DI STUDIO ANATOMOPATOLOGICO DEL LINFONODO SENTINELLA - ESAME MACROSCOPICO e CAMPIONAMENTO Il linfonodo è accuratamente pulito dal tessuto adiposo perilinfonodale, facendo attenzione a non lacerare la capsula linfonodale. Si descrive il linfonodo con la specifica delle tre dimensioni. Si procede al campionamento tagliando il linfonodo, perpendicolare all asse maggiore, in sezioni parallele dello spessore di mm 2 e posizionandole nelle biocassette (massimo 4 sezioni per biocassetta) fra due spugnette, tutte secondo lo stesso verso ed in sequenza a partire dal lato corto della biocassetta contrassegnato dal numero istologico (vedi schemi seguenti). Ogni biocassetta contenente sezioni di linfonodo sentinella deve essere contrassegnata sia da un coperchio di colore differente, sia da un foglietto interno su cui è scritto: sent 1, sent 2 e così via a seconda se si tratti di una biocassetta del linfonodo sentinella 1, del linfonodo sentinella 2 e così via.

53 INCLUSIONE Le sezioni di linfonodo debbono essere mantenute nello stesso verso e nella medesima sequenza in cui si trovano nelle biocassette da inclusione. TAGLIO AL MICROTOMO: Da ogni blocchetto in paraffina, dopo una minima sgrossatura ( rimane uguale alla procedura precedente), sono tagliate 2 sezioni consecutive (la prima per EE e la seconda da montare su vetri caricati per eventuale IIC con AE1/AE3) ogni 200 µ fino ad esaurimento del tessuto. Si appone una sola sezione per vetrino istologico. DIAGNOSI AL MICROSCOPIO OTTICO La diagnosi è effettuata sulle sezioni istologiche colorate con EE. In caso di dubbi diagnostici o di istotipo lobulare è consigliabile richiedere la colorazione con AE1/AE3. Tale colorazione IIC è, inoltre, consigliata, su sezioni selezionate, allo scopo di una più accurata misurazione dell eventuale micrometastasi o di una diagnosi differenziale fra ITC e micrometastasi.

54 Il referto istologico deve includere: il numero totale di linfonodi sentinella ricevuti; il numero di linfonodi coinvolti da malattia metastatica; la dimensione massima dell eventuale micrometastasi repertata; non è necessario specificare le dimensioni di eventuali ITC o delle macrometastasi. Se più foci micrometastatici sono stati identificati in un linfonodo questo dato va segnalato ma è misurato il focus più grande; la presenza di focolai di infiltrazione neoplastica del tessuto adiposo perilinfonodale; segnalazione di eventuali lacerazioni capsulari e/o perdita di sostanza da bisturi elettrico. Nel referto istologico deve comparire la dicitura: linfonodo sentinella processato in accordo con le raccomandazioni GIPAM/SIAPEC-IAP 2013.

55 Tale procedura è effettuata in pazienti con 1 o 2 linfonodi sentinella. Qualora al paziente fossero asportati da 3 a 5 linfonodi sentinella (denominati dal chirurgo da 1 a 3 o 4 o 5 sulla base della quantità di radioattività emessa e misurata) si procede come di seguito: i primi due sono processati come sopra i restanti sono esaminati microscopicamente in maniera parziale tagliando 2 sezioni consecutive ogni 200 µ (1 EE e 1 IIC) per un totale di tre livelli (il campionamento rimane invariato). Qualora al paziente fossero asportati 6 o più linfonodi (sentinella e altri linfonodi) si procede come di seguito: i primi due linfonodi sentinella sono processati come sopra i restanti linfonodi sono campionati dividendoli a metà, se di dimensioni superiori a 5 mm, ogni linfonodo si include in 1 biocassetta si taglia 1 sola sezione per ogni blocchetto in paraffina così ottenuto.

56 Richieste particolari per il taglio LINFONODO SENTINELLA Per melanoma : Seriato + 3 sezione S100 e 5 HMB45 I protocolli possono essere diversi

57 SEZIONAMENTO Vibratomo Microtomo a vibrazione per sezionare tessuti freschi. Produce sezioni da 10 a 400 mm Per successivi trattamenti immunoistochimici o auto radiografia

58 SEZIONAMENTO

59 SEZIONAMENTO Criostato Rotativo Lavora a T inferiori allo 0

60 CRIOSTATO Importante per ottenere delle buone sezioni è includere bene: 1. Distribuire uniformemente il collante sulla base metallica (non fredda) 2. Adagiare il prelievo ben orientato effettuato dal patologo 3. Inserire la base metallica nelle sedi di congelamento 4. Attendere che il collante inizi a congelare (diventa bianco) 5. Porre delicatamente sopra il campione il tampone freddo (mantenendolo verticale) 6. Quando il tampone si distacca facilmente, il prelievo è pronto per il taglio

61 Dal pannello del criostato sono possibili varie impostazioni alcune automatiche altre manuali Effettuare la retrazione del campione dietro la lama Mettere il blocco a livello della lama con la manovella Portare il blocco quasi a contatto della lama

62 CRIOSTATO Taglio al criostato 7. Dopo una prima fase di sgrosso pulire la lama con il pennello 8. Impostare lo spessore di taglio ed effettuare una sezione. 9. Distendere durante il taglio la sezione sulla lama con il pennello o specchietto 10.Raccogliere le sezioni ben distese appoggiando il porta oggetto a T ambiente sulla sezione, la differenza di T farà aderire stabilmente le sezioni 11.Lasciare asciugare all aria o su superficie calda

63 Azionare il blocco della ro quando si posiziona il

64 CRIOSTATO ATTENZIONE USARE SEMPRE I GUANTI RISCHIO BIOLOGICO RISCHIO TAGLIENTI LE SEZIONI DEVONO ESSERE MANIPOLATE ESCLUSIVAMENTE CON PENNELI E STRUMENTI ALLA STESSA T DEL CRIOSTATO -20 C/-30 C

65 ALTRI METODI PREPARATI PER STRISCIO: si utilizza per effettuare indagini citologiche o indagini istochimiche su cellule in sospensione provenienti da sangue o altri tessuti di consistenza adatta ad essere spalmata su un vetrino portaoggetto.

66 ALTRI METODI PREPARATI PER STRISCIO: I metodi possono essere diversi e utilizzano due vetri portaoggetto che scorrono tra loro spalmando il materiale da strisciare

67 ALTRI METODI Striscio

68 ALTRI METODI PREPARATI PER CENTRIFUGAZIONE: quando le cellule da esaminare sono disperse in abbondante liquido si utilizza la citocentrifiga che consente di concentrare su una piccola porzione di un vetrino portaoggetto una grande quantità di cellule.

69 ALTRI METODI PREPARATI PER APPOSIZIONE: si ottengono premendo leggermente a fresco la superficie di sezione contro un vetrino portaoggetto, le cellule dalla superficie del campione passano sul vetro

70 ALTRI METODI PREPARATI PER SCREEPING: con la lama di un bisturi si raschia la superficie del campione e il materiale viene poi strisciato su un vetro portaoggetti.

71 ALTRI METODI TUTTI I VETRI OTTENUTI DEVONO ESSERE FISSATI AL PIU PRESTO CON IL FISSATIVO IDONEO ALLE INDAGINI DA EFFETTUARE Alcool etilico 95 Alcool metilico Spray fissativi

72 Descrizione prodotto: Non contiene propellenti dannosi per l'ozono. Indicato per fissare il materiale cellulare strisciato sul vetrino portaoggetto. Fissa rapidamente le cellule, rende stabile la colorazione secondo Papanicolaou, garantisce nel tempo la conservazione del prelievo. Composizione: -isopropanolo -polietilenglicole

73 ARTEFATTI ISTOLOGICI Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma all introduzione di materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, processazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini. E fondamentale saper riconoscere gli artefatti per evitare che vengano interpretati e diagnosticati in maniera errata causando un danno al paziente.

74 Artefatti causati prima del prelievo Polvere di talco Materiale di sutura Effetto da termocauterio Effetto da agenti chimici Particelle di carbone Garza Essicamento

75 Artefatti causati nell intervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico Effetti da schiacciamento Essiccazione Congelamento Chinatura Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere

76 Artefatti durante la fissazione Autolisi durante la fissazione. Fissazione inadeguata o incompleta Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker (coartazione) Deposito di cristalli di Sublimato mercurico Effetti di estrazione da fissazione in formalina Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina

77 Artefatti legati a procedure di inclusione Inadeguata fissazione Inadeguata disidratazione Presenza di residui di liquidi chiarificanti Inadeguata infiltrazione di paraffina Uso di paraffina troppo calda

78 Artefatti legati alle procedure d inclusione Inclusione di frammenti multipli di diversa durezza Orientamento errato dei frammenti Prolungata esposizione a paraffina sciolta a temperatura elevata Campioni lasciati troppo a lungo su superfici ad alta temperatura Pinze troppo calde

79 Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini Contaminazione dei vetri da muffe o pollini (mancata pulizia) Raccolta di frammenti di altri blocchetti Pieghe nelle sezioni Bolle d aria sotto le sezioni Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni Uso di quantità eccessive di adesivo

80 ARTEFATTI IN CITOLOGIA Errori nella raccolta delle cellule Cellule sovrapposte Cellule troppo rade Eccessiva quantità di sangue Mancato uso di adesivo Effetto da citocentrifuga Contaminazione batterica (nelle urine) Stiramento delle cellule per compressione

81 ARTEFATTI IN CITOLOGIA Errori nella fissazione delle cellule Effetti di essiccamento prima della fissazione (nella col. di Papanicolau) Effetti di essiccamento troppo lento (nella col. di Giemsa)