I Congresso Nazionale

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1 AIPVet I Congresso Nazionale con la partecipazione della Società Italiana di Patologia Tossicologica e Sperimentale del Gruppo di Patologia Clinica Veterinaria del Gruppo Veterinario di Analisi di Immagine Palazzo Feltrinelli, Gargnano (BS), 30 Aprile-1 Maggio 2004

2 PROCESSAZIONE ISTOLOGICA IN TOTO DI TOPI NEONATI Belluco Sara, Grieco Valeria, Rondena Marco, Scanziani Eugenio Dipartimento di Patologia Animale, Igiene e Sanità Pubblica Veterinaria - Sezione di Anatomia Patologica e Patologia Aviare - Facoltà di Medicina Veterinaria Milano Riassunto Animali neonati sono occasionalmente oggetto di studio. Questo tipo di campione è particolarmente difficile da processare secondo le normali tecniche istologiche di routine. Scopo del lavoro è stato quello di approntare una metodica di processazione istologica su topi neonati.. Sono stati esaminati tre gruppi costituiti da 8 animali ciascuno, soppressi nelle prime 24 ore di vita. Nel gruppo A si è proceduto alla raccolta dei principali organi che sono stati processati secondo le normali tecniche di routine. Il prelievo degli organi è risultato difficile a seguito dell estrema fragilità dei tessuti. Inoltre non è stato possibile orientare i campioni durante l inclusione in paraffina, cosicché sulle sezioni ottenute spesso impossibile la valutazione istologica di molti organi. Sugli animali del gruppo B è stato effettuato un taglio di 0.5 cm in corrispondenza della linea alba. I neonati sono stati fissati, decalcificati in soluzione di EDTA e processati secondo le normali tecniche di routine. Con questa metodica si sono verificati gravi problemi al taglio, probabilmente per una scarsa penetrazione della paraffina nei tessuti. Sugli animali del gruppo C è stato effettuato un taglio di 0.5 cm in corrispondenza della linea alba. Per divaricare l incisione è stata applicata una bendarella di spugna. Ogni soggetto è stato fissato in formalina e sezionato trasversalmente ogni tre millimetri circa, ottenendo 6 parti. Ogni parte è stata posta in soluzione di decalcificazione (EDTA) e successivamente processata separatamente. Di ogni parte sono state effettuate sezioni seriali di 3 micron a 500 micron di distanza, colorate successivamente con EE. Il risultato ottenuto è stato ottimale, in quanto il processo di disidratazione e penetrazione della paraffina nei tessuti non ha mostrato problemi. Le sezioni sono risultate di ottima qualità istologica, permettendo sia uno studio morfologico di tutti gli organi dell animale, sia una valutazione dei rapporti spaziali fra gli organi. E stata esclusa dallo studio la scatola cranica e il SNC, in quanto presenta delle difficoltà maggiori per la processazione. Il trimming di neonati secondo sezioni trasversali di mm ciascuna si è rivelato un ottima metodica sia in corso di valutazioni morfologiche che topografiche dei singoli organi ed è applicabile per qualsiasi studio d organo, escluso il SNC, per il quale sono in corso ulteriori indagini. Parole chiave: Trimming, neonati, topo Summary In toto histological trimming of neonatal mice Neonates are histological evaluated in numerous circumstances, but technical procedures are not easily applicable. Our purpose was to establish a standardized trimming procedure to obtain good morphological slides in neonatesstudies. We tested three groups of 8 mice each, sacrificed in the first 24 hours of life. In the group A mice were necropsied and single organs were trimmed. This method revealed problems in taking organs and in histological evaluation because samples got easily fragmentation. Mice of group B were decalcified and trimmed entirely, but slide-cut was impossible because paraffin didn t embedded the samples. In the group C we cut mice-body in 6 parts, each of them was decalcified and trimmed separately. Slides were of a good morphological quality and, moreover, permitted topographical studies of organs. This method can be used for all kind of organs, except the SNC. Key words: Trimming, neonates, mouse Introduzione Topi neonati sono occasionalmente oggetto di studio, sia in esperimenti di fenotipizzazione di nuovi ceppi transgenici, sia in test di tossicologia, sia in corso di malattie spontanee perinatali. Questo tipo di campione è particolarmente 101

3 difficile da processare a causa delle dimensioni ridotte e dell estrema fragilità dei tessuti. In letteratura è possibile ritrovare una metodica consistente in sezioni longitudinali del soggetto previa fissazione in Bouin (Brighton, 2001), ma nei nostri laboratori la replicazione di questa tecnica ha portato a scarsi risultati dovuti alla perdita delle connessioni anatomiche degli organi. Scopo del lavoro è stato quello di definire una tecnica istopatologica che garantisse una buona fissazione del campione, una semplicità nella metodica e una adeguata qualità morfologica alla valutazione istologica. Materiali e metodi Sono stati esaminati tre gruppi (A-B-C) costituiti da 8 animali ciascuno, soppressi nelle prime 24 ore di vita. Nel gruppo A si è proceduto all esame necroscopico sotto stereomicroscopio degli animali. Sono stati prelevati gli organi principali, fissati in sol 4% di formalina per 72 ore e processati secondo le normali tecniche di routine. Nel gruppo B gli animali sono stati fissati in toto in sol 4% di formalina per 48 ore, previa incisione di 0.5 cm sulla linea alba, mantenuta aperta tramite l ausilio di una spugna imbevuta di formalina. I campioni sono stati successivamente posti in una sol. EDTA al 10% per circa una settimana, quindi disidratati ed inclusi in paraffina in modo da ottenere, al taglio, sezioni trasversali dei soggetti. Nel gruppo C gli animali sono stati fissati secondo il protocollo del gruppo B. Prima della decalcificazione i campioni sono stati sezionati trasversalmente ogni tre millimetri circa, ottenendo 6 parti (Fig. 1), che sono state stati poste in una sol. EDTA al 10% per circa una settimana e successivamente processate separatamente per l'inclusione in paraffina. Di ogni parte sono state effettuate sezioni seriali di 3 micron a 500 micron di distanza, colorate successivamente con EE (Fig ). Per ogni gruppo sono state valutate la praticità della processazione (intesa come semplicità della tecnica e tempi) e la qualità morfologica delle sezioni ottenute. Risultati Gruppo A: si sono riscontrate notevoli difficoltà nell individuazione e nel prelievo degli organi. Molti tessuti si sono frammentati durante questa operazione così che non è stata possibile una corretta orientazione in corso di inclusione in paraffina. Istologicamente le sezioni, seppur di buona qualità, sono state difficilmente valutabili causa la frammentazione degli organi e il loro malposizionamento. Gruppo B: la tecnica di processazione si è rilevata molto semplice ed efficace. In corso di taglio è stato impossibile ottenere una sezione del campione in quanto questo si frammentava contro la lama del microtomo. Gruppo C: la processazione è risultata semplice. Le sezioni sono risultate di ottima qualità con possibilità di una valutazione topografica degli organi (Fig ). Si sono riscontrati problemi con la parte A del campione, consistente nel cranio. Infatti a contatto con la lama del microtomo il campione si polverizzava. A B C D E F Figura 1: A-B: articolazione atlanto-occipitale; B-C: superficie craniale dell articolazione scapolo-omerale; C-D: sup. caudale dell articolazione omero-radioulnare; D-E: metà addome; E-F: articolazione coxofemorale. 102

4 alla penetrazione della paraffina così che al taglio il campione si è frammentato. Figura 2: Gruppo C. Sezione della parte D. Cavità toracica e addominale. Discussione I topi appena nati sono oggetto di studio, sebbene non con la stessa frequenza di animali adulti o di embrioni. La mancanza di dettagli tecnici in letteratura (Brighton, 2001) ha reso a noi difficile la replicazione della metodica accennata. Abbiamo infatti provato a sezionare gli animali longitudinalmente, ma gli organi perdevano le connessioni anatomiche, rendendo difficile la processazione. Abbiamo così condotto un breve studio al fine di individuare una tecnica relativamente semplice che garantisse sezioni di buona qualità istologica. Nel gruppo A abbiamo applicato la tecnica routinaria applicata negli animali adulti, consistente in un esame necroscopico e nel prelievo degli organi in sede autoptica. Gli scarsi risultati ottenuti nel gruppo A sono probabilmente da riferire alle dimensioni e alla fragilità del campione che rendono necessaria una notevole abilità tecnica. Nel gruppo B gli animali sono stati fissati in toto. Probabilmente la cute ha costituito una barriera Figura 3: Gruppo C: Sezione della parte E. Panoramica addominale. Figura 4: Gruppo C. Particolare del tessuto epatico neonatale. I migliori risultati sono stati ottenuti con il protocollo applicato nel gruppo C. La processazione richiede un passaggio aggiuntivo rispetto al protocollo del gruppo B, consistente nel sezionare l animale in 6 parti. Questo ha risolto il 103

5 problema della penetrazione omogenea della paraffina nel campione. La suddivisione dell animale in 6 parti facilita l individuazione degli organi di studio, conoscendone la posizione anatomica. Questo offre il vantaggio, rispetto al metodo B, di sezionare solo la parte di interesse. Le sezioni istologiche sono di ottima qualità e permettono inoltre uno studio topografico. Il taglio lungo la linea alba prima ha favorito la fissazione degli organi interni, evitando o minimizzando l autolisi che in questi campioni è rapida, specialmente a livello del tratto gastroenterico. Abbiamo applicato questa metodica in uno studio di fenotipizzazione di un nuovo ceppo transgenico di topi (dati non mostrati) in cui era sospetta l agenesia renale. La possibilità di effettuare sezioni seriali nella zona di interesse ha permesso di avvalorare l ipotesi, confermando la validità della nostra tecnica. La parte A è attualmente l unica che ha mostrato problemi simili ai campioni del gruppo B in fase di taglio. Probabilmente il cranio coperto da cute costituisce una barriera alla penetrazione della paraffina, rendendo il campione disomogeneo in densità. Nonostante le dimensioni limitate del campione, questo deve probabilmente essere ulteriormente sezionato. In conclusione tecnica messa a punto nel terzo gruppo di animali si è rilevata tecnicamente semplice e istologicamente valida nel garantire sezioni di buona qualità morfologica, ad esclusione del cranio. Bibliografia 1. Brighton C, Justice M, Montgomery CA: Evaluating mutant mice: anatomic pathology. Vet Pathol Jan;38(1):1-19. Review. 104