Processazione rapida e fissazione alternativa tra presente e futuro. M. Cadei

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1 Processazione rapida e fissazione alternativa tra presente e futuro M. Cadei Sezione di Anatomia Patologica Dipartimento Medicina Molecolare e Traslazionale (DMMT) Università degli Studi di Brescia

2 TAVOLA ROTONDA

3 La fissazione dei tessuti Qualità del preparato Requisito irrinunciabile per una corretta diagnosi Condiziona tutte le fasi del percorso che il campione intraprende all interno del laboratorio Fissazione: tappa critica e irreversibile

4 Una storia lunga 117 anni Aleksandr Mikhailovich Butlerov ( ) August Wilhelm von Hofmann ( ) Ferdinand Blum ( )

5 Complessità dell Anatomia Patologica Tecniche Istochimiche Valutazione morfologica Citometria a flusso Tecniche Immunoistochimiche e Immunofluorescenza Citogenetica Microscopia elettronica Biologia Molecolare

6 PubMed 2013

7 Punti critici della processazione

8 20x 40x 20x 40x

9

10 Targeted Therapies Targeted Therapies

11 2004

12 Processazione rapida e Fissazione alternativa ULTRASUONI e MICROONDE

13 MECCANISMO FISICO E CHIMICO Responsabili di una variazione sia della T che delle P Questo processo ripetuto centinaia di migliaia di volte al secondo Facilità di penetrazione e reattività dei reagenti nel tessuto

14 AA 2009/2010

15 FISSAZIONE in Formalina Greenfix e Cymol Processazione Tradizionale (PT) Processazione Microonde (PM)

16 PROCESSAZIONE RAPIDA CON MICROONDE REAGENTI PROG Tk 1 Alcool Tk 2 Alcool Isolpropilico 10 Tk 3 Paraffina 23 Tot 43 1) Riduzione dei tempi di processazione dei campioni bioptici (80%); 2) Procedimento a base alcoolica.

17 EMATOSSILINA-EOSINA PT PM Formalina

18 PROCESSAZIONE MICROONDE (PM) Formalina Greenfix Cymol

19 PROCESSAZIONE MICROONDE (PM) Formalina Greenfix Cymol

20 Tessuto rispettivamente fissato in Formalina trattato tradizionalmente PT (A) e trattato con processazione rapida (B). Tessuto rispettivamente fissato in Greenfix (C) e Cymol (D). Colorazione CK-Pan A B C D

21 ASPETTI METODOLOGICI Le biopsie devono avere uno spessore non superiore ai 2-5 mm; Standardizzazione della procedure (modifica dei tempi e delle temperature di reazione); Uso di un inferiore quantitativo di soluzioni; Differente tintorialità nei fissativi alcolici Differente espressione antigenica e molecolare

22 MAILING-LIST DI AITIC Le esperienze intraprese dai laboratori che hanno risposto alla mail sono quasi esclusivamente di tipo sperimentale (tesi o pubblicazioni) e si basano su casistiche ridotte. Solo raramente qualche laboratorio ha sostituito la formalina con prodotti alternativi.

23 PRODOTTI ALTERNATIVI DI NUOVA GENERAZIONE Green-Fix (Etandiale) FinFix (Gliossale) Cell Block (Gliossale, Etanolo, Acqua e Tampone) PAGA (Polietilenglicole-Alcool Etilico- Glicerolo-Acido Acetico) ZBF (Fissativo a base di Zinco) RCL2 (fissativo a base alcolica-acido Acetico) Cymol (Alcool Etilico, Alcool Metilico, Alcool Isopropilico)

24 Modello sperimentale basato su campioni murini e umani Apparato Urinario Apparato gastrointestinale Apparato epato-biliare EE IC IIC BM FISH CF

25 EE su campioni epatici umani : Formalina 2: Benzalconio Cloruro allo 0,1% in PBS. 3: Benzalconio Cloruro allo 0,05% in PBS. 4: Benzalconio Cloruro allo 0,025% in PBS.

26 FISH e Ploidia : Formalina. 2: Benzalconio Cloruro allo 0,025% in PBS. 3: Cymol.

27 Biologia Molecolare La fissazione in cymol (TD e TE) e quella in Benzalconio Cloruro a basse concentrazioni (TC) danno risultati molto buoni, sia in termini di estrazione di DNA integro e ad alto peso molecolare che di amplificazione tramite PCR. C M F TA TB TC TD TE Dott.ssa Luisa Benerini Laboratorio di Biologia Molecolare PCR del gene della β-globina

28 Verrebbe da chiedersi se un unico fissativo è adatto per tutte le metodiche!!!

29 NUOVI MODELLI E STRATEGIE ORGANIZZATIVE

30 Sperimentazione sulla fissazione dei tessuti

31

32 DISPONIBILITA AL CONFRONTO SCIENTIFICO Aspetti tecnico-metodologici legati all utilizzo di fissativo alternativo (qualità del preparato, possibilità di esecuzione di tecniche integrative della diagnostica); Modifiche ai protocolli impostati nella routine; Costi e sicurezza dei fissativi alternativi; Abitudine visiva del patologo nella formulazione della diagnosi al microscopio ottico; Stabilità del preparato nel tempo, per le conseguenti ricadute medico-legali che un preparato inadeguato potrebbe portare.

33 NOTA BIBLIOGRAFICA RECENTE Rapid Two-Temperature Formalin Fixation David Chafin et al. Plos, Jan 2013, Vol. 8, issue 1 Preservation of immunorecognition by transgerring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol Otali D. et al. Biotech. Histochem 2013, Jan 23 Comparison of Formalin-Free Tissue Fixative Kothmaier H. ed al. Arch. Pathol Lab. Med. 2011, Vol. 135 Evaluation of two commercial and three home-made fixative for the substitution of formalin: a formaldehyde-free laboratory is possible Zanini C. et al. Environmental Health 2012, 11:59

34 Ringraziamento personale al Prof. PG Grigolato, a tutti i colleghi che hanno fornito il loro prezioso contributo a queste ricerche e tutti Voi per l attenzione!!!!

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