Sommario. in Italia. IL RUOLO DELL mrna E6/E7 COME MARKER DELLA PROGRESSIONE DELLE LESIONI DA HPV M.T. Bruno, G. Musumeci, N.

Transcript

1 COLPOSCOPIA PIA 1 COLPOSCOPIA PIA Sommario Organo Ufficiale della Società Italiana di Colposcopia p e Patologia Cervico Vaginale ANNO XXIII - N. 3 DICEMBRE 2010 Comitato di Redazione Coordinatore Scientifico Vecchione Aldo (Roma) Comitato Scientifico Carinelli Silvestro (Milano) Chiossi Giuseppe (Modena) Fidelbo Melchiorre (Catania) Gallia ura (Asti) Giunta Antonio (Partinico, PA) Montanari Gioia (Torino) Ricci Maria Grazia (Siena) Tortolani Francesca (Modena) Visci Paolo (Pescara) Coordinamento Editoriale Perino Antonio (Palermo) Peroni Mario (Ascoli Piceno) Piccoli Roberto (Napoli) Direttore Responsabile Fausto Boselli Redazione Casinalbo (Mo) Via Brescia, 5 Tel Fax Autorizzazione del Tribunale di Ascoli Piceno Iscr. al Reg. Stampa n. 196 del Stampa/Pubblicità Tipolitografia F.G. snc Strada Provinciale 14, 230 Savignano sul Panaro (Mo) Tel Fax Proprietario Società Italiana di Colposcopia e Patologia Cervico Vaginale Via dei Soldati, Roma Finito di stampare nel mese di Marzo 2011 ANALISI TEMPORALE DELLA DISTRIBUZIONE DEI TIPI DI HPV NELLE LESIONI SQUAMOSE INTRAEPITELIALI IN UNA COORTE DI PAZIENTI ITALIANE Gardella B., Dal Bello B., Iacobone A.D., Panzeri L., Paladini L., Chiesa A., Silini E.M., Spinillo A. 3 CORRISPONDENZA TRA GRADING COLPOSCOPICO E BIOPSIA MIRATA DELLA PORTIO IN DONNE CON PAP TEST ANORMALE M.M. Ianieri, S. Errichi, G. Camastra, M. Liberati 10 CARCINOMA SQUAMOSO PRIMITIVO DELLA VAGINA SU CISTOCELE DA PROLASSO VAGINALE POST-ISTERECTOMIA. Capursi T., Carriero C., Mancini T., Lezzi V., Cormio G. 11 IL RUOLO DELL mrna E6/E7 COME MARKER DELLA PROGRESSIONE DELLE LESIONI DA HPV M.T. Bruno, G. Musumeci, N. Cassaro 13 CORRELAZIONE TRA LE ATIPIE DELLE CELLULE GHIANDOLARI CERVICALI (AGC) AL PAP TEST E DIAGNOSI ISTOLOGICA VALUTAZIONE DI UN PROTOCOLLO DI APPROFONDIMENTO DIAGNOSTICO P. Garutti, C. Bedoni, C. Zavatta, A. Graziano, A. Patella 16 CELLULE SQUAMOSE ATIPICHE (ASC-US) ASSOCIATE A LOCALIZZAZIONE ASINTOMATICA DI PEMPHIGUS A LIVELLO CERVICO-VAGINALE: DESCRIZIONE DI DUE CASI Lezzi V., Mancini T., Carriero C., Capursi T., Putignano G. 20 PREVENZIONE SECONDARIA IL TERRITORIO: COME SI ORGANIZZA IL SECONDO LIVELLO Piccoli R., De Rosa N., Bertrando A., Cavallaro A., Ricciardi D., Stella N. 24 RUBRICHE Accreditamento professionale in colposcopia e fisiopatologia del tratto tto genitale inferiore a cura della CV 31 Notiziario della Società 32

2 2 Società Italiana di Colposcopia e Patologia Cervico Vaginale affiliata alla International Federation for Cervical Pathology and Colposcopy (IFCPC) Consiglio Direttivo Presidente Aldo Vecchione Vice Presidenti Antonio Frega Giancarlo Mojana Roberto Piccoli Segretario Generale Tesoriere Fausto Boselli Segretario Aggiunto Stefano De Martis Consiglieri Maggiorino Barbero Paolo Cattani Andrea Ciavattini Carlo Penna Paolo Scirpa Francesco Sopracordevole Revisori dei Conti Fabrizio Fabiano Alberto Biamonti Emanuela Sampugnaro Revisori dei Conti supplenti Maria Antonietta Bova Marco Palomba Comitato Scientifico Permanente Coordinatore Antonio Perino Referente per gli screening Gioia Rita Montanari Referenti Studio HPV Il vaccino diagnostica Massimo Moscarini Franco M. Buonaguro Deborah French Referenti protocolli terapeutici Alberto Agarossi Maria Grazia Fallani Brunella Guerra Forum per le attività didattiche e la formazione Bruno Ghiringhello Daria Minucci Roberto Zarcone Referente per lo studio della Patologia vulvare Mario Preti Forum per le linee guida Andrea Amadori Elisabetta Carico Paolo Cristoforoni Gian Piero Fantin Carlo Antonio Liverani Giovanni Miniello

3 3 Analisi temporale della distribuzione dei tipi di HPV nelle lesioni squamose intraepiteliali in una coorte di pazienti italiane Gardella B.*, Dal Bello B.**, Iacobone A.D.*, Panzeri L.*, Paladini L.*, Chiesa A.*, Silini E.M.***, Spinillo A.* *Clinica di Ostetricia e Ginecologia, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia **Dipartimento di Anatomia Patologica, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia ***Dipartimento di Anatomia Patologica, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma, Parma Colposcopia Anno XXIII N. 3 pagg. 3-9 Introduzione Più di 100 tipi di Papillomavirus umano sono coinvolti nell eziopatogenesi delle lesioni squamose intraepiteliali in diversi siti, e di questi almeno 30 sono stati trovati nelle lesioni della cervice uterina (1). Il tipo ed il numero di HPV associati con il carcinoma cervicale a cellule squamose e con le lesioni precancerose sono variamente distribuiti in base alle caratteristiche della popolazione in studio, incluse l area geografica, la gravità delle lesioni e la stratificazione per età (2,3). Le ragioni per spiegare le differenze geografiche nella distribuzione dei tipi di HPV sono sostanzialmente sconosciute ed eventuali pattern specifici di distribuzione regionale sono ancora poco definiti (4). Invece, i cambiamenti nella distribuzione dei genotipi virali in base al grado di severità delle lesioni cervicali sono al momento giustificati dalla variabile capacità dei differenti tipi di HPV di indurre la persistenza dell infezione e l evoluzione neoplastica della stessa nell epitelio della zona di trasformazione (5). Variazioni tra i diversi gruppi d età sono principalmente correlate all immunità acquisita, ai cambiamenti fisiologici della cervice uterina che si verificano nell arco della vita di una donna, ed al loro impatto sul tropismo tissutale e sulla persistenza dei diversi genotipi di Papillomavirus (6,7). Viceversa, è generalmente atteso che la circolazione e la distribuzione dei tipi di HPV in una popolazione sia stabile nel tempo, sebbene ci sia una sostanziale mancanza di dati storici per sostenere questa ipotesi. Se si assume che i genotipi di HPV siano diversi per severità di lesione e gruppo di età, in funzione delle loro carat- Comunicazione libera presentata al XXV Congresso Nazionale della, Verona, 5-7 Dicembre 2010 teristiche biologiche, piuttosto che in conseguenza di andamenti temporali della circolazione del virus, ciò implica che vi siano dei risvolti importanti per la stima dell oncogenicità virale. Infatti, il concetto di un differente effetto carcinogenetico tra i diversi genotipi virali è alla base della vaccinazione selettiva per il Papillomavirus umano (8) e dell applicazione clinica consistente nella HPV genotipizzazione, impiegata per predire il potenziale di progressione della neoplasia intraepiteliale cervicale (CIN) (9). Abbiamo impiegato il test di genotipizzazione dell HPV chiamato SPF 10 -INNO LiPA (10), un tipo di PCR ad ampio spettro, basata sull amplificazione di un frammento di 65 bp della regione L1 del genoma virale, al fine di valutare l eventuale presenza di un andamento temporale della distribuzione dei genotipi di Human Papilloma Virus nella nostra area geografica, negli ultimi 20 anni. Per tale scopo, donne, originarie del Nord Italia, che avevano ricevuto una diagnosi istologica di CIN in due periodi storici precedenti, e , sono state confrontate con pazienti degli anni Lo studio è stato approvato dal Comitato di Revisione Istituzionale della Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia. Materiali e metodi Pazienti Sono stati presi in considerazione dagli archivi del Dipartimento di Anatomia Patologica dell Università di Pavia i preparati istologici originali di 67 casi con una diagnosi primitiva di CIN del periodo 1 ( ) e 92 casi del periodo 2 ( ). Per 33 casi del periodo 2 era disponibile anche il DNA congelato del washing cervicale raccolto al momento della biopsia. I casi dei periodi 1 e 2 sono stati rispettivamente ap-

4 4 paiati per età, con uno scarto di ± 2 anni, e grado di CIN, distinguendo i CIN1 dai CIN 2, con 159 biopsie cervicali, fissate in formalina ed incluse in paraffina, di donne HPV-positive diagnosticate negli anni (periodo 3). In tutte le 159 donne del periodo 3, la genotipizzazione dell HPV è stata eseguita anche su cellule esfoliate ottenute spatolando la cervice uterina nella stessa data in cui è stata eseguita la biopsia. L origine non italiana e l infezione da HIV sono stati i criteri di esclusione. Determinazione dell HPV-DNA e tipizzazione virale Le sequenze del genoma virale tipo-specifiche sono state rilevate mediante sonda lineare, con il test per la genotipizzazione di HPV INNO-LiPA (11,12). Questo tipo di analisi permette il rilevamento simultaneo e separato di 15 genotipi di HPV ad alto rischio (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, e 70) e 10 genotipi a basso rischio (6, 11, 34, 40, 42-44, 53, 54, e 74). Quantificazione dell HPV-DNA Per verificare una eventuale degradazione di HPV-DNA nelle biopsie storiche, 173 biopsie di tutti e tre i periodi sono state analizzate per la quantificazione delle sequenze di HPV-DNA. Le sequenze di HPV-DNA sono state valutate con PCR quantitativa real-time (Rotor Thermal Cycler Mx300). Risultati Sono state esaminate con l INNO-LiPA 318 biopsie cervicali fissate in formalina ed incluse in paraffina di donne con una diagnosi primitiva di CIN: 67 del periodo 1 ( ), 92 del periodo 2 ( ) e 159 del periodo 3 Tabella 1. Caratteristiche cliniche principali delle donne con neoplasia intraepiteliale cervicale (CIN) nei tre periodi in studio, (1), (2) e (3). Variabile Età 39,34 (DS) a (9,26) Istologia Numero di genotipi di HPV Classe di rischio oncogeno a Deviazione standard. b ANOVA. c Pearson chi-quadro. CIN1 CIN A basso rischio Singola ad alto rischio Multipla ad alto rischio Multipla a basso/alto rischio Periodo (numero di soggetti) 1 (67) 2 (92) 3 (159) 18 (26,9%) 49 (73,1%) 28 (41,8%) 28 (41,8%) 9 (13,4%) 2 (2,9%) 6 (9,0%) 24 (35,8%) 29 (43,3%) 8 (11,9%) 35,39 (9,37) 25 (27,2%) 67 (72,8%) 36 (39,1%) 37 (40,2%) 16 (17,4%) 3 (3,3%) 6 (6,5%) 30 (32,6%) 32 (34,8%) 24 (26,1%) 37,04 (9,82) 43 (27,0%) 116 (73,0%) 18 (11,3%) 34 (21,4%) 71 (44,7%) 36 (22,6%) 2 (1,2%) 17 (10,7%) 82 (51,6%) 58 (36,5%) P 0,038 b 0,868 c <0,0001 c <0,0001 c

5 5 ( ), per un totale di 737 singole infezioni da HPV (Tabella 1). Abbiamo eseguito la tipizzazione virale sia sulla biopsia cervicale con pinza sia sulla corrispondente conizzazione in 15 donne dei periodi storici 1 e 2, ed è stata confermata nella quasi totalità dei singoli genotipi virali individuati (36 su 38-94,7%). In 33 donne del periodo 2, campioni congelati di DNA degli washing cervico-vaginali raccolti al momento dell esecuzione della biopsia erano disponibili, ed hanno permesso di confermare la tipizzazione per 73 su 74 (98,6%) delle singole infezioni rilevate. concordanza per il numero di genotipi di HPV tra la biopsia cervicale ed il washing nelle 159 donne del periodo 3 è stata del 76,7%. Su un totale di 477 infezioni singole, 37 (7,8%) sono state rilevate solo nella biopsia e 10 (2,1%) solo nel washing. Complessivamente, il numero di infezioni da multipli genotipi di HPV (p<0,0001) e da genotipi ad alto rischio (p for trend 0,034) è risultata più alta nel periodo 3 rispetto ai periodi 1 e 2 (p<0,0001) (Tabella 1). Tabella 2. Confronto della distribuzione dei genotipi di HPV e dei gruppi oncogeni nei tre periodi in studio, (1), (2) e (3). Genotipi di HPV Periodo 2 vs 1 Periodo 3 vs 1 OR (95% CI) b P a OR (95% CI) b P 6 1,14 (0,29-4,52) 0,852 2,50 (0,83-7,48) 0, ,76 (0,15-3,93) 0,741 1,22 (0,33-4,58) 0, ,35(0,12-0,99) 0,048 0,37 (0,15-0,87) 0, ,57(0,19-1,77) 0,333 0,95 (0,42-2,15) 0, ,12 (0,48-2,61) 0,801 1,53 (0,80-2,94) 0, ,75 (0,77-78,4) 0,083 1,07 (0,30-3,77) 0, ND ND 52 ND ND 53 ND ND 56 ND ND 58 ND ND 42 ND ND 33 0,72 (0,11-4,55) 0,724 0,91 (0,23-3,59) 0, ,25 (0,01-5,39) 0,376 1,68 (0,17-16,5) 0, ,51 (0,25-24,9) 0,433 1,47 (0,24-8,84) 0, ,95 (0,60-14,5) 0,183 1,20 (0,36-3,96) 0, ND ND 43 ND ND 44 5,87 (0,19-178) 0,310 2,20 (0,17-28,4) 0, ND ND 68 ND ND 70 ND ND 6/11 1,30 (0,41-4,14) 0,659 2,49 (0,96-6,42) 0,059 16/18 0,37 (0,13-1,05) 0,061 0,33 (0,14-0,78) 0,012 6/11/16/18 0,31 (0,11-0,87) 0,026 0,44 (0,20-0,97) 0,041 Basso rischio 1,70 (0,65-4,43) 0,279 2,11 (0,99-4,49) 0,053 Alto rischio ND ND ND, non determinabile. a Pearson chi-quadro. b Come ottenuto mediante regressione logistica condizionale, includendo le condizioni per età e periodo.

6 6 Le infezioni da HPV-51, -52, e -53 non sono state osservate nei campioni istologici di CIN dei periodi 1 e 2, mentre risultano presenti nel periodo 3 con una frequenza del 5,7-30,8%. Inoltre, è stata osservata una prevalenza significativamente inferiore di infezioni da HPV-6, -56, -58, e -66. probabilità di singole infezioni nel passato rispetto a quelle del periodo recente è stata calcolata con un analisi caso-controllo, appaiando per età e grado di severità della neoplasia intraepiteliale cervicale (CIN). Dato che, dopo il confronto, l età media delle pazienti dei tre periodi era leggermente sbilanciata, l età è stata inserita come elemento confondente nella regressione logistica condizionale (Tabella 2). L odds ratio per l infezione da HPV-16 è stato approssimativamente stimato di un terzo nei periodi 2 e 3 rispetto al periodo 1 (p 0,048 e 0,024 rispettivamente; p for trend 0,06). frequenza dell infezione da HPV-16 ha avuto un declino a partire dal periodo 2, sebbene il numero di genotipi coinvolti fosse paragonabile e ci sia stato un generale incremento di infezioni causate dai genotipi ad alto rischio (Tabella 1). Le infezioni da HPV- 16/-18 sono state tre volte meno frequenti nei periodi 2 e 3 rispetto al periodo 1 (p for trend 0,018), mentre è stato osservato un corrispettivo aumento di infezioni da HPV-6/-11 (p for trend 0,009). Complessivamente, le infezioni determinate dai genotipi virali 6, 11, 16, e 18 sono risultate tre volte meno frequenti nei periodi 2 e 3, se paragonati al periodo 1 (p 0,026 e 0,041, rispettivamente) (Tabella 2). Il test di tipizzazione ad ampio spettro INNO-LiPA non ha uguale specificità e sensibilità per ogni sequenza virale (13); questo può influenzare il quadro dei genotipi coinvolti nelle infezioni, a causa della competizione delle sequenze virali tipo-specifiche per i primers della PCR. Per escludere questa eventualità, due set di primers tipo-specifici sono stati progettati per amplificare le brevi sequenze dell Open Reading Frame L1 di HPV- 51 e -52. Questi due genotipi di HPV erano assenti nei periodi 1 e 2, mentre rappresentano rispettivamente il 27,0% ed il 30,8% dei genotipi virali del periodo campioni istologici positivi per HPV-51, di cui 3 con infezione singola ed 8 con infezioni multiple, e 16 campioni istologici positivi per HPV-52, di cui 4 con infezione singola e 12 con infezioni multiple, sono stati sottoposti ad amplificazione con due set di primers tipo-specifici. In tutti i casi, la presenza delle sequenze specifiche è stata confermata, mentre i due genotipi non sono stati rilevati in nessuno dei 45 controlli istologici fissati in formalina ed inclusi in paraffina negativi per HPV-51 né dei 58 positivi per HPV-52. degradazione del DNA può avvenire con la conservazione a lungo termine dei campioni istologici fissati in formalina ed inclusi in paraffina, e questo può influen- zare la rappresentanza dei genotipi di HPV presenti a basso titolo (14). Per escludere questo possibile bias, simili quantitativi di DNA estratto da 49 biopsie fissate in formalina ed incluse in paraffina del periodo 1, 50 del periodo 2 e 74 del periodo 3 sono stati quantificati con PCR real-time usando i primers SPF -10. Non sono state osservate differenze significative nei titoli bassi tra i vari periodi (log 10 5,282 nel periodo 1, 5,223 nel periodo 2, 5,414 nel periodo 3; p 0,0865). I titoli bassi delle sequenze di DNA amplificabili sono risultati simili, considerando il grado di severità di CIN (p 0,9759) ed il numero di genotipi di HPV coinvolti (p 0,4419). Conclusioni Un cambiamento nella distribuzione dei genotipi di HPV tra le donne con una diagnosi istologica di neoplasia intraepiteliale cervicale (CIN) è stato osservato nella nostra area geografica nel periodo I genotipi di HPV che erano rari o non determinabili anni fa, specificamente i genotipi virali 51, 52, 53, 56, e 58, possono essere, invece, osservati al giorno d oggi in più di un terzo dei casi di CIN. Sembra che i principali cambiamenti si siano realizzati negli ultimi 10 anni, mentre la distribuzione dei genotipi di Papillomavirus era simile nei periodi e Nel tempo è stato osservato, inoltre, un aumento dell incidenza di infezioni da genotipi multipli e da genotipi ad alto rischio. I quattro genotipi virali, contro cui sono diretti gli attuali vaccini multivalenti disponibili, ossia HPV-6, -11, -16, e -18, risultano essere da due a tre volte meno frequenti oggigiorno rispetto alle due decadi precedenti considerate. Il materiale isto-patologico disponibile negli archivi rappresenta una valida fonte per valutare la varietà microbica tra aree geografiche ed in diversi periodi temporali, ed ha avuto un ruolo importante nella definizione del ruolo eziologico dell Human Papilloma Virus nel carcinoma della cervice uterina (15). Tuttavia, pochi studi hanno utilizzato questo approccio per investigare i cambiamenti secolari nella distribuzione dei genotipi di HPV. Studi precedenti, comunque, non hanno fornito risultati consistenti, dal momento che hanno analizzato coorti piccole e selezionate di aree geografiche isolate (16,17). Per di più, questi studi hanno utilizzato per l analisi temporale test molecolari non validati, senza controllare l eventuale presenza di fattori confondenti. Inoltre, ammettendo il recupero di materiale istopatologico dei periodi precedenti, lo studio di campioni tissutali fissati in formalina ed inclusi in paraffina permette di selezionare l epitelio affetto da malattia, diversamente dal campionamento citologico, che può invece riflettere anche la presenza di aree cervicali non selezionate o di infezioni vaginali (18).

7 7 Il test molecolare INNO-LiPA usato per il nostro studio è un test altamente validato, ed è in grado di identificare simultaneamente fino a 54 genotipi di HPV indipendenti (10). Ha dimostrato rilevanza clinica ed è stato ampiamente utilizzato in analisi cliniche ed epidemiologiche (19,20,21). L INNO-LiPA impiega il più piccolo amplicone di tutti i sistemi di genotipizzazione dell HPV-DNA attualmente disponibili (22); per questo motivo si pensa che sia più sensibile nell amplificazione dell HPV-DNA da campioni istologici fissati in formalina ed inclusi in paraffina, dato che il rendimento della metodica di PCR è inversamente proporzionale alla lunghezza dell amplicone (23). Paragonando il rendimento con quello di altri test molecolari, sono state confermate l accuratezza, la riproducibilità e l alta sensibilità dell INNO-LiPA nella tipizzazione di infezioni da singoli o multipli genotipi di HPV (24,25,26). L utilizzo dell INNO-LiPA nella genotipizzazione dell HPV da campioni istologici fissati in formalina ed inclusi in paraffina era stata validato in precedenti studi (27). Già in passato, presso il nostro Dipartimento di Anatomia Patologica, era stata confrontata la genotipizzazione dell HPV in 165 campioni appaiati di spatolati cervicali e biopsie mirate, dimostrando una concordanza di risultati nel 95,4% dei casi. Le biopsie ci permettono di avere migliori risultati, probabilmente per un campionamento più efficace della lesione e dell endocervice (12). Tutto ciò è stato confermato anche dal nostro studio. Le sequenze di HPV-DNA amplificabili con i primers SPF -10 dei campioni istologici fissati in formalina ed inclusi in paraffina dei tre diversi periodi sono state anche sottoposte a quantificazione con PCR real-time per escludere che la conservazione a lungo termine o differenti procedure di fissazione ed inclusione possano aver causato una caduta dei titoli virali al di sotto della soglia di sensibilità del test (14). Infine, è stata confermata l alta riproducibilità della genotipizzazione dell HPV nelle biopsie fissate in formalina ed incluse in paraffina dei periodi e , ripetendo il test sulle biopsie a cono e sul DNA congelato dei washing cervico-vaginali. PCR ad ampio spettro può essere influenzata dalla competizione fra le sequenze virali tipo-specifiche a livello del primer, determinando così una sottovalutazione delle infezioni multiple, in particolare quando i genotipi minori sono presenti a concentrazioni relative basse (13). Studi precedenti hanno dimostrato che l INNO-LiPA può avere una sensibilità analitica più bassa rispetto alla PCR tipo-specifica, sebbene non siano mai stati riportati bias significativi nell amplificazione e nella determinazione degli specifici genotipi di HPV differentemente rappresentati nel presente studio (24,25,26,28). tipizzazione con i primers SPF -10 dell INNO-LiPA dei due genotipi con le più grandi dif- ferenze in termini di prevalenza nel tempo, ossia HPV- 51 e HPV-52, è stata fedelmente riprodotta con la PCR tipo-specifica in 130 campioni istologici esaminati; questo ci ha permesso di escludere bias in sensibilità e specificità del test di tipizzazione virale utilizzato. Uno studio recente compiuto in Messico ha usato un approccio sperimentale simile a quello del nostro studio per dimostrare che la prevalenza dell HPV-16 nel carcinoma cervicale a cellule squamose ha subito un declino nell arco temporale compreso tra il 1980 ed il 1999 (29), osservazione che è del tutto in accordo con le nostre conclusioni. Il carcinoma cervicale a cellule squamose è un outcome più valido della neoplasia intraepiteliale cervicale quando si ricercano prove per dimostrare la presenza di tendenze secolari nella circolazione dei genotipi oncogeni dell Human Papilloma Virus. Comunque, in una popolazione screenata per le lesioni cervicali pre-neoplastiche può esserci, come risultato dello screening, l eliminazione di alcuni genotipi virali riscontrati in seguito nei carcinomi squamosi della cervice uterina sviluppati nella stessa popolazione; questo risultato è meno probabile se si considerano le prime diagnosi di CIN come nella nostra analisi temporale. Le differenze tra i gruppi sono state ulteriormente controllate appaiando i gruppi secondo le tre variabili principali, di cui è nota l influenza sulla distribuzione dei genotipi virali, ossia il Paese d origine, l età ed il grado di severità di CIN. Nondimeno, deve essere riconosciuto che il disegno retrospettivo dello studio ha delle limitazioni che possono aver influenzato la distribuzione dei genotipi di HPV nei diversi gruppi. In primo luogo, la prevalenza, la conoscenza clinica e le procedure di screening delle lesioni precancerose erano diverse in passato. In secondo luogo, non è nota la distribuzione dei genotipi di HPV nelle popolazioni di riferimento dei periodi in studio. Infine, non possono essere esclusi ulteriori confondenti dovuti a fattori comportamentali e socio-economici non descritti. Assumendo che le nostre osservazioni riflettano un cambiamento autentico nella circolazioni dei vari genotipi di Papillomavirus, questo potrebbe essere spiegato da due ipotesi non mutualmente escludentesi: 1) nuovi genotipi virali sono stati introdotti da altre aree geografiche; 2) genotipi virali endemici sono andati incontro a ridistribuzione a causa di mutazioni del pattern di esposizione. prevalenza delle infezioni da HPV e la distribuzione dei genotipi virali variano enormemente nelle diverse aree geografiche (3). Sia meta-analisi (30,31) che studi internazionali multicentrici (32,33) indicano che l HPV-16 e l HPV-18 sono i più coinvolti nella genesi di neoplasia intraepiteliale cervicale e di carcinoma squamoso cervicale in tutto il mondo, mentre gli altri

8 8 genotipi più frequenti, quali HPV-31, -33, -45, -52, -58, e -35, presentano significative differenze regionali. Così, l HPV-35 è più frequente in Africa, l HPV-52 ed il -58 in Asia, e l HPV-31 in Europa. Studi trasversali indicano che queste variazioni regionali sono consistenti anche suddividendo la popolazione per età, sebbene gli odds ratio siano più alti per le classi più giovani (31). In conseguenza dei flussi migratori e dell aumentata mobilità delle popolazioni negli ultimi anni, un nuovo gruppo di virus potrebbe essere stato introdotto nella nostra area geografica (34,35). In ogni caso, bisogna anche riconoscere che la maggior parte degli studi, condotti sulla prevalenza dei genotipi di HPV in popolazioni specifiche, non presentano, dopo aver considerato il grado di severità della lesione, un rilevante effetto coorte sulla distribuzione dei genotipi virali (4). È possibile che l alto livello di fattori confondenti correlati all età, che comprendono l attività sessuale, i cambiamenti fisiologici a livello della zona di trasformazione, l immunità acquisita, i mutevoli tassi di persistenza dell infezione, e la variabile compliance ai programmi di screening, determini la necessità di un numero molto grande di campioni istologici, al fine di individuare differenze nella distribuzione del virus tra i gruppi di età. Questi ragionamenti non escludono che possa esserci stato un cambiamento nella distribuzione di un gruppo endemico di genotipi di HPV in seguito a variazioni di variabili sociali e comportamentali. Un precedente rilevante è rappresentato dalla variazione delle distribuzione dei genotipi del virus dell epatite C, in associazione alla diffusione dell abuso di droghe endovena (36). Infatti, il maggior numero di infezioni da genotipi multipli e da genotipi ad alto rischio potrebbe indicare un aumento o un cambiamento del pattern di esposizione. Alcuni dati epidemiologici confermano un aumento della prevalenza di sieropositività e di infezioni da HPV ad alto rischio negli ultimi anni (37,38,39). Lo stato immunitario è infatti un altra variabile potenzialmente in grado di influenzare il numero e la distribuzione dei genotipi di HPV nella popolazione. Alcuni genotipi potrebbero essere più predisposti alla riattivazione o alla re-infezione in seguito all infezione da HIV o a difetti immunitari secondari a infezioni, malnutrizione, età di acquisizione, o promiscuità. In particolare, altri genotipi ad alto rischio diversi dall HPV-16 sono riscontrati più frequentemente nelle donne HIV-positive, e sono frequentemente associati ad anomali riscontri citologici (40). Negli Stati Uniti, i genotipi più frequenti nelle donne sieropositive sono l HPV-56 e l HPV-53 nelle lesioni di basso grado, e l HPV-52 e l HPV-58 nelle lesioni di alto grado, differentemente dalle donne sieronegative (41). In conclusione, i nostri risultati suggeriscono che possano esserci tendenze secolari nella distribuzione dei genotipi di Human Papilloma Virus, che riflettano l introduzione di nuovi genotipi virali e/o il cambiamento del pattern di esposizione. Questo ha importanti implicazioni per le politiche di prevenzione e la determinazione del rischio nelle donne infettate da HPV, ed inoltre giustifica la necessità di nuove indagini. Soprattutto, i nostri risultati necessiterebbero di essere confermati in coorti indipendenti e considerando campioni di popolazione generale di più grandi dimensioni e per un più lungo intervallo di tempo. Bibliografia 1. Human Papillomaviruses. International Agency for Research on Cancer, Lyon, France Trottier H, Franco EL. The epidemiology of genital human papillomavirus infection. Vaccine 2006;24(Suppl 1):S1 S Bosch FX, Burchell AN, Schiffman M, Giuliano AR, de Sanjose S, Bruni L, et al. Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specific implications in cervical neoplasia. Vaccine 2008;26 (Suppl 10):K1 K Clifford G, Franceschi S, Diaz M, Munoz N, Villa LL. Chapter 3: HPV type-distribution in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine 2006;24(Suppl 3):S26 S Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med 2003;348: Clifford GM, Gallus S, Herrero R, Munoz N, Snijders PJ, Vaccarella S et al. Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV prevalence surveys: a pooled analysis. ncet 2005;366: Castle PE, Jeronimo J, Schiffman M, Herrero R, Rodriguez AC, Bratti MC, et al. Age-related changes of the cervix influence human papil- lomavirus type distribution. Cancer Res 2006;66: Roden R, Wu TC. How will HPV vaccines affect cervical cancer? Nat Rev Cancer 2006;6: Khan MJ, Castle PE, Lorincz AT, Wacholder S, Sherman M, Scott DR, et al. The elevated 10-year risk of cervi- cal precancer and cancer in women with human papil- lomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice. J Natl Cancer Inst 2005;97: Kleter B, van Doorn LJ, Schrauwen L, Molijn A, Sastrowijoto S and ter Schegget J, et al. Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human Papil- lomavirus. J Clin Microbiol 1999;37: Tavassoli FA, Devilee P, editors. Pathology and Genetics

9 9 of Tumours of the Breast and Female Genital Organs. IARC Press, Lyon, France Dal Bello B, Spinillo A, Alberizzi P, Cesari S, Gardella B, Silini EM. A validation study of the use of the SPF-10 LiPA HPV typing assay in formalinfixed paraffin-embedded cervical biopsies. J Clin Microbiol 2009;47: van Doorn LJ, Molijn A, Kleter B, Quint W, Colau B. Highly effective detection of human papillomavirus 16 and 18 DNA by a testing algorithm combining broadspectrum and type-specific PCR. J Clin Microbiol 2006;44: Karlsen F, Kalantari M, Chitemerere M, Johansson B, Hagmar B. Modifications of human and viral deoxyribonucleic acid by formal- dehyde fixation. b Invest 1994;71: Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999;189: Sebbelov AM, Davidson M, Kruger Kjaer S, Jensen H, Gregoire L, Hawkins I, et al. Comparison of human papillomavirus genotypes in archival cervical cancer specimens from Alaska natives, Greenland natives and Danish Caucasians. Microbes Infect 2000;2: Bertelsen BI, Kugarajh K, Skar R, erum OD. HPV subtypes in cervical cancer biopsies between 1930 and 2004: detection using general primer pair PCR and sequencing. Virchows Arch 2006;449: Gravitt PE, van Doorn LJ, Quint W, Schiffman M, Hildesheim A, Glass AG, et al. Human papil- lomavirus (HPV) genotyping using paired exfoliated cervicovaginal cells and paraffin-embedded tissues to highlight difficulties in attributing HPV types to specific lesions. J Clin Microbiol 2007;45: Safaeian M, Herrero R, Hildesheim A, Quint W, Freer E, Van Doorn LJ, et al. Comparison of the SPF10-LiPA system to the Hybrid Capture 2 Assay for detection of carci- nogenic human papillomavi-i rus genotypes among 5,683 young women in Guanacaste, Costa Rica. J Clin Microbiol 2007;45: Castle PE, Gravitt PE, Solomon D, Wheeler CM, Schiffman M. Comparison of linear array and line blot assay for detection of human papillomavirus and diagnosis of cervical precancer and cancer in the atypical squamous cell of undetermined significance and low-grade squamous intraepithelial lesion triage study. J Clin Microbiol 2008;46: Perrons C, Jelley R, Kleter B, Quint W, Brink N. Detection of persistent high risk human papillomavirus infections with hybrid capture II and SPF10/LiPA. J Clin Virol 2005;32: Kleter B, van Doorn LJ, ter Schegget J, Schrauwen L, van Krimpen K, Burger M, et al. Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papil- lomaviruses. Am J Pathol 1998;153: Baay MF, Quint WG, Koudstaal J, Hollema H, Duk JM, Burger MP, et al. Comprehensive study of several general and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas. J Clin Microbiol 1996;34: van Hamont D, van Ham MA, Bakkers JM, Massuger LF, Melchers WJ. Evaluation of the SPF10-INNO LiPA human papillomavirus (HPV) genotyping test and the Roche linear array HPV genotyping test. J Clin Microbiol 2006;44: van Doorn LJ, Quint W, Kleter B, Molijn A, Colau B, Martin MT, et al. Genotyping of human papillomavirus in liquid cytology cervical specimens by the PGMY line blot assay and the SPF(10) line probe assay. J Clin Microbiol 2002;40: Klug SJ, Molijn A, Schopp B, Holz B, Iftner A, Quint W, et al. Comparison of the performance of different HPV genotyping methods for detecting genital HPV types. J Med Virol 2008;80: Quint WG, Scholte G, van Doorn LJ, Kleter B, Smits PH, Lindeman J. Comparative analysis of human papillomavirus infections in cervical scrapes and biopsy specimens by general SPF(10) PCR and HPV genotyping. J Pathol 2001;194: Castle PE, Porras C, Quint WG, Rodriguez AC, Schiffman M, Gravitt PE, et al. Comparison of two PCRbased human papillomavirus genotyping methods. J Clin Microbiol 2008;46: Wheeler CM, Hunt WC, Joste NE, Key CR, Quint WG, Castle PE. Human papillomavirus genotype distributions: implications for vaccination and cancer screening in the United States. J Natl Cancer Inst 2009;101: Clifford GM, Smith JS, Plummer M, Munoz N, Franceschi S. Human papil- lomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta-analysis. Br J Cancer 2003;88: Clifford GM, Rana RK, Franceschi S, Smith JS, Gough G, Pimenta JM. Human papillomavirus genotype distribution in low-grade cervical lesions: comparison by geographic region and with cervical cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14: Munoz N, Bosch FX, Castellsague X, Diaz M, de Sanjose S, Hammouda D, et al. Against which human papillomavirus types shall we vaccinate and screen? The international perspective. Int J Cancer 2004;111: Smith JS, Lindsay L, Hoots B, Keys J, Franceschi S, Winer R, et al. Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions: a meta-analysis update. Int J Cancer 2007;121: Gonzalez C, Ortiz M, Canals J, Munoz L, Jarrin I, de la Hera MG, et al. Higher prevalence of human papillomavirus infection in migrant women from tin America in Spain. Sex Transm Infect 2006;82: Tornesello ML, Duraturo ML, Buonaguro L, Vallefuoco G, Piccoli R, Palmieri S, et al. Prevalence of human papillomavirus genotypes and their variants in high risk West Africa women immigrants in South Italy. Infect Agent Cancer 2007;2: Silini E, Bono F, Cividini A, Cerino A, Maccabruni A, Tinelli C, et al. Molecular epidemiology of hepatitis C virus infection among intravenous drug users. J Hepatol 1995;22: ukkanen P, Koskela P, Pukkala E, Dillner J, ara E, Knekt P, et al. Time trends in incidence and prevalence of human papillomavirus type 6, 11 and 16 infections in Finland. J Gen Virol 2003;84: Peto J, Gilham C, Deacon J, Taylor C, Evans C, Binns W, et al. Cervical HPV infections and neoplasia in a large population-based prospective study: the Manchester cohort. Br J Cancer 2004;91: Dillner J. Trends over time in the incidence of cervical neoplasia in comparison to trends over time in human papillomavirus infection. J Clin Virol 2000;19: Clifford GM, Goncalves MA, Franceschi S. Human papillomavirus types among women infected with HIV: a meta-analysis. AIDS 2006;20: Luque AE, Jabeen M, Messing S, ne CA, Demeter LM, Rose RC, et al. Prevalence of human papillomavirus genotypes and related abnormalities of cervical cytological results among HIV-1-infected women in Rochester, New York. J Infect Dis 2006;194:

10 10 Corrispondenza tra grading g colposcopico p e biopsia mirata della portio in donne con Pap test anormale M.M. Ianieri, S. Errichi, G. Camastra, M. Liberati Clinica Ostetrica e Ginecologica, Università degli Studi G. d Annunzio, Chieti-Pescara Colposcopia Anno XXIII N. 3 pagg. 10 Introduzione L algoritmo diagnostico per la prevenzione e la diagnosi precoce del cervicocarcinoma, si basa sull interpretazione di citologia, colposcopia ed eventuale biopsia mirata. In questo percorso l esame colposcopico riveste un ruolo cardine perché permette di valutare le aree della portio maggiormente sospette per lesioni e di sottoporle a prelievo bioptico. Per fare ciò, coerentemente con la Classificazione Colposcopica Internazionale (IFCPC) del 2002, riassumiamo i quadri colposcopici anormali in G1, rappresentativo di modificazioni minori (displasia lieve-cin 1) e G2 indicativo di modificazioni maggiori (CIN 2-CIN 3). Obiettivo dello studio L obiettivo dello studio è stato quello di valutare la corrispondenza dell impressione colposcopica, utilizzando la terminologia della IFCPC 2002, con la diagnosi istologica su biopsia della cervice uterina. Materiali e metodi Il nostro studio retrospettivo è stato condotto su 142 donne giunte presso l Ambulatorio di Patologia Cervico Vaginale della nostra Clinica di Ginecologia ed Ostetricia, in seguito ad un pap test anormale. Tutte le pazienti sono state sottoposte ad indagine colposcopica e ad una o più biopsie mirate. Le colposcopie sono poi state refertate con l ausilio del programma informatico Quality ed utilizzando la nomenclatura della IFCPC Abbiamo poi provveduto a confrontare i grading colposcopici G1 e G2 con i risultati dell esame istologico su biopsia della cervice uterina. Comunicazione libera presentata al XXV Congresso Nazionale della, Verona, 5-7 Dicembre 2010 Tabella 1. - Risultati Diagnosi istologica BIOPSIA MIRATA Risultati percentuale di corrispondenza tra grading colposcopico G1 e lesioni istologiche di basso grado (CIN 1) è stata del 66,9% (87/130); mentre nel 13,1% (17/130) e nel 20% (26/130) dei casi, l impressione colposcopia ha, rispettivamente, sovrastimato e sottostimato la lesione diagnosticata alla biopsia. percentuale di corrispondenza tra grading colposcopico G2 e lesioni di alto grado (CIN 2-CIN 3) è stata del 58,3% (7/12); di contro l impressione colposcopica ha sovrastimato la lesione istologica nel 33,3% (4/11) dei casi ed in una sola donna la biopsia ha diagnosticato un carcinoma invasivo (Tabella 1). Conclusioni Grading colposcopico G1 N (%) Grading colposcopico G2 N (%) Totale Negativo 17 (13,1) / 17 CIN 1 87 (66,9) 4 (33,3) 91 CIN 2 9 (6,9) 3 (25) 12 CIN 3 17 (13,1) 4 (33,3) 21 Carcinoma invasivo / 1 (8,3) 1 Totale corrispondenza tra grading colposcopico G1 e lesioni CIN 1 è stata alta, ma in una non trascurabile percentuale di casi (20%), le biopsie hanno diagnosticato lesioni di grado maggiore rispetto a quello che le immagini colposcopiche lasciavano sottendere. Dunque questa nostra casistica dimostra come la biopsia sia uno strumento imprescindibile anche quando il giudizio colposcopico risulta essere non significativo o G1, sia per colposcopisti esperti, che in formazione.

11 11 Carcinoma squamoso primitivo della vagina su cistocele da prolasso vaginale post-isterectomia. Capursi T., Carriero C., Mancini T., Lezzi V., Cormio G. Dipartimento di Ginecologia-Ostetricia e Neonatologia,. Università degli Studi di Bari Aldo Moro Colposcopia Anno XXIII N. 3 pagg Introduzione Il carcinoma vaginale primitivo è una delle forme neoplastiche più rare. maggioranza dei casi di lesioni maligne vaginali è di tipo metastatico (cervice, vulva, endometrio, ovaio, rene, tiroide, mammella ). Il caso presentato è veramente inusuale: un carcinoma squamoso primitivo sviluppato sulla parete vaginale anteriore prolassata (cistocele) in una paziente isterectomizzata per patologia benigna molti anni prima, con un aspetto che può confondersi a prima vista con una formazione neoplastica di origine vulvare (vedi Figura). Caso clinico Paziente di 82 anni, inviata al Centro di Colposcopia con diagnosi di voluminosa neoplasia vulvo-vaginale. paziente era stata isterectomizzata 30 anni prima per fibromatosi uterina, successivamente aveva lamentato prolasso della volta vaginale e cistocele. Più recentemente riferiva l evenienza di qualche sanguinamento genitale. massa esofitica è a partenza dalla parete vaginale anteriore prolassata (cistocele). citologia sulla lesione ha rilevato elementi francamente neoplastici di tipo squamoso e la biopsia ha riportato la diagnosi istologica di carcinoma squamoso cheratinizzante. A causa dell età e di una cardiopatia importante il rischio anestesiologico e operatorio era elevato, mentre il probabile coinvolgimento della parete vescicale (pur con cistoscopia negativa) indicava un approccio operatorio radicale. Con il consenso della paziente è stata eseguita una tumorectomia ampia, con biopsie intraoperatorie della Comunicazione libera presentata al XXV Congresso Nazionale della, Verona, 5-7 Dicembre 2010 parete vescicale (risultate positive), ed è stata programmata una radioterapia postoperatoria. A distanza di due anni dall intervento la paziente è deceduta per cause legate alla grave cardiopatia, accompagnata da recidiva della neoplasia a livello vescicale. Discussione In questo caso la diagnosi differenziale con un carcinoma vulvare o vulvo-vaginale ha richiesto l intervento di un occhio esperto (colposcopia). Il reperto di una massa tumorale così grande su un cistocele è un evento molto raro, così come in genere l evenienza di un carcinoma vaginale primitivo. Il carcinoma primitivo della vagina si aggira attorno all 1-2% di tutti i tumori genitali femminili, colpisce in genere in età avanzata (60-70 anni) e nella grande maggioranza dei casi è a cellule squamose (1). Molti sono i possibili fattori di rischio ipotizzati: storia di displasia cervicale o vulvare, pregresse neoplasie ginecologiche e non ginecologiche, isterectomia precoce, trauma vaginale dovuto a pessari o prolasso, presenza

12 12 di HPV ad alto rischio o altre malattie sessualmente trasmesse, fumo, stato socio-economico basso, stato coniugale instabile, pregressa irradiazione pelvica (2-5). Un pregresso intervento di isterectomia, per lesioni maligne, pre-maligne o anche benigne, è stato enfatizzato come fattore di rischio per lo sviluppo di un carcinoma vaginale. Le pazienti sottoposte ad isterectomia hanno un rischio tre volte più alto di avere un carcinoma vaginale primitivo sul terzo superiore della vagina o sulla volta, rispetto alle pazienti non isterectomizzate (1). In realtà, si potrebbero identificare due tipi di carcinoma vaginale con eziologia correlata all età: in donne più giovani, l eziologia potrebbe essere simile a quella del cervicocarcinoma e correlata all HR-HPV, alle forme preinvasive (VAIN), fumo e basso stato socio-economico. Tuttavia, nelle pazienti più anziane, che rappresentano la fascia di età più comune, si riconosce una eziologia non HPV correlata, piuttosto legata a stato ormonale, trauma vaginale e fattori genetici ereditari o acquisiti (2). Nel nostro caso, il traumatismo cronico sembra essere stato il fattore eziologico prevalente (prolasso della volta vaginale e cistocele da molti anni). Conclusioni Alcune considerazioni scaturiscono dallo studio del caso riportato: - cessazione dello screening cervico-vaginale in donne sottoposte ad isterectomia per cause benigne e, comunque, dopo una certa età (65 anni) può essere sicuramente argomento di discussione nei casi in cui si riscontrino neoplasie maligne ad una certa età o dopo isterectomia. - Il prolasso dell utero o della volta vaginale possono essere considerati fattori di rischio per lo sviluppo di una neoplasia squamosa a causa del trauma cronico? - Se tale domanda ha una risposta positiva, allora lo screening citologico cervico-vaginale dovrebbe essere prolungato oltre i 65 anni almeno in questo tipo di pazienti a rischio. Bibliografia 1. Hellman K et al. (2006) Clinical and histopathologic factors related to prognosis in primary squamous cell carcinoma of the vagina. Int J Gynecol Cancer 16: Hellman K et al. (2004) Primary carcinoma of the vagina: factors influencing the age at diagnosis. The Radiumhemmet series Int J Gynecol Cancer 14: Skomedal H et al. (1995) Expression of Retinoblastoma Tumor Suppressor Gene Protein, Epidermal Growth Factor Receptor, and c-erbb-2 Oncoprotein in Primary Vaginal Carcinomas. Gynecologic Oncology 59: Yi-Chun Lee et al. (2000) Rapid Progression of Primary Vaginal Squamous Cell Carcinoma in a Young HIV-Infected Woman. Gynecologic Oncology 78: Hellman K et al. (2004) Protein expression patterns in primary carcinoma of the vagina. Br J Cancer. 91:

13 13 Il ruolo dell mrna E6/E7 come marker della progressione delle lesioni da HPV M.T. Bruno, G. Musumeci, N. Cassaro Clinica Ostetrica e Ginecologica. Policlinico Universitario G. Rodolico Università degli studi di Catania Colposcopia Anno XXIII N. 3 pagg L Infezione da Papilloma virus (HPV) è necessaria per lo sviluppo delle lesioni precancerose del collo dell utero e del carcinoma(1). Va però sottolineato che la massima parte delle infezioni è transitoria e guarisce senza esiti; in circa l 80% dei casi si ha l eliminazione spontanea del virus mediamente in 18 mesi. Contemporaneamente il rischio di non eliminare spontaneamente il virus ad alto rischio aumenta con l età. persistenza è caratteristica soprattutto dei virus ad alto rischio, specialmente per il tipo 16, crea le condizioni di avere lesioni epiteliali di alto grado e quindi la possibilità di sviluppare un carcinoma invasivo. Per cui nasce la necessità di trovare dei metodi diagnostici capaci di discernere fra le displasie destinate a regredire spontaneamente da quelle che tendono a progredire. Elementi che possono aiutare il clinico in questo senso sono l età della paziente, la tipizzazione dell HPV, la carica e la persistenza della lesione. L evoluzione della diagnostica di laboratorio nelle infezioni da HPV si è basata a lungo sull apporto indiretto del test citologico, attraverso la valutazione della presenza della coilocitosii come marcatore di infezione da HPV ed ha conosciuto solo negli ultimi anni un impennata qualitativa, grazie allo sviluppo di tecniche biomolecolari. In tutto questo un ruolo determinante lo riveste l HPVDNA test: dotato di una grande sensibilità integra agevolmente l attività del pap test caratterizzata invece, da una bassa sensibilità. L azione sinergica di entrambi offre un notevole contributo al clinico. I numerosi studi condotti negli ultimi anni hanno portato a comprendere l attività oncogena del papillomavirus e la scoperta che, affinché avvenga la progressione a carcinoma, è necessaria la iperespressione delle proteine E6 ed E7 alle quali, peraltro, si attribuisce il potere mutageno e trasformante degli HPV ad alto rischio, espres- Comunicazione libera presentata al XXV Congresso Nazionale della, Verona, 5-7 Dicembre 2010 sione della integrazione nel genoma virale con quello della cellula ospite. Ne consegue che la transcriptasi di E6 ed E7 può essere utilizzato come markers di progressione della lesione. Tutto ciò può essere monitorizzato attraverso la ricerca dell mrna dei geni E6/E7. Fra i test più recentemente introdotti in commercio, merita particolare attenzione la ricerca dell RNA messaggero dei principali tipi oncogeni di HPV (16, 18, 31, 33, 45), espressione di una fase virale attiva. Questo test consiste nel rilevare la presenza di trascritti virali intracellulari, in particolare l espressione di alcune oncoproteine dei geni E6 ed E7 coinvolte nel processo di oncogenesi della cervice mediante alterazione del ciclo cellulare. Il test si esegue su un normale tampone cervicale, prevede una amplificazione real-time dell RNA messaggero virale con la tecnica NASBA e fornisce al medico importanti informazioni per il processo decisionale. In questo studio abbiamo voluto verificare il ruolo della ricerca dell mrna di E6/E7 come markers di progressione dalla displasia verso la forma invasiva. Materiali e Metodi Dal 2008 al 2010 sono state arruolate 204 donne di età compresa fra i 16 e i 52 anni. L età media è di 33.1 anni. I criteri di esclusione erano: gravidanza, malattie immunitarie, trattamenti precedenti per patologie del collo dell utero. Le pazienti hanno firmato un consenso informato. Tutte le pazienti sono state sottoposte a pap test, colposcopia, HPVDNA test. Il pap test è stato classificato secondo il Bethesda System. Il prelievo per l HPV test è stato fatto in corrispondenza della zona di trasformazione e dal canale cervicale e stemperato nel Thin prep. È stata utilizzata la PCR per la determinazione dell HPV e la sua genotipizza-

14 14 Grafico 1 Grafico 2 zione. Per la determinazione della positività all mrna viene utilizzato lo stesso prelievo (in Thin prep), già utilizzato per eseguire la determinazione e la genotipizzazione dell HPV. L RNA cellulare viene estratto dalle cellule e sottoposto ad amplificazione mediante metodica NASBA che rivela l espressione tipo specifica dei 5 genotipi di HPV presenti nel 95% dei carcinomi invasivi della portio (16, 18, 31, 33, 45). Quindi, in tutti i casi in cui il virus HPV apparteneva al tipo 16, 18, 31, 33, 45 è stata eseguita la ricerca dell mrna. Risultati Grafico 3 Il DNA di HPV è stato riscontrato nell 84,8% dei casi. Nel 57.3% dei casi si trattava di infezione da HPV ad alto rischio (HRHPV) e solo nel 12.7% dei casi di infezione da HPV a basso rischio (LRHPV). Nel gruppo di HPV ad alto rischio il genotipo più frequente è stato il 16 (51 casi), quindi il 18 (10 casi), il 31 (7 casi), il 33 (6 casi) il 45 (3 casi). ricerca dell mrna per gli oncogeni E6/E7 è stata eseguita in 48 casi. I risultati sono evidenti nel grafico 1. In 32 casi il test della ricerca del E6/E7 mrna risulta positivo, in 16 casi negativo. Considerando i casi positivi all mrna si può notare la prevalenza del genotipo 16 con 17 casi di HSIL e 7 casi di LSIL. Altri 2 casi di HSIL si hanno con i genotipi 16/18. (Grafico3) Discussione Quindi, tutti i 19 casi di HSIL che abbiamo sottoposto al test dell mrna sono risultati positivi registrando così una incidenza del 100% di positività del test nelle lesioni di alto grado. Tabella 1. - HSIL e LSIL in 32 casi positivi all mrna HPV16 n. casi HPV31 n. casi HPV33 n. casi HPV45 n. casi HPV 16/18 n. casi HSIL 17 2 LSIL presenza dell mrna virale nel 100% di pazienti con lesioni di alto grado conferma la stretta associazione tra l espressione degli oncogeni E6/E7 e la possibile evoluzione neoplastica delle lesioni. Invece, la positività dell mrna nei casi di LSIL sta ad indicare la precocità con cui spesso avviene la integrazione del Dna virale, per cui le lesioni LSIL positive all mrna certamente non appartengono a quel pool di displasie lievi che si può non sottoporre a trattamento perché facilmente regrediscono, ma fanno parte di quel gruppo di lesioni a potenziale evolutivo che sicuramente è meglio trattare.

15 15 Bibliografia 1. Jan M.M. Walboomers, Marcel V. Jacobs, M. Miche Manos et al. Human Papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. Journal of Pathol. 1999;189: Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N. Engl. J. Med. 348(6), (2003). 3. Schiffman M, Castle PE. The promise of global cervical-cancer prevention. N Engl J Med 2005;353: Frazer IH, Cox JT, Mayeaux EJ Jr, et al. Advances in prevention of cervical cancer and other human papillomavirus-related diseases. Pediatr Infect Dis J 2006;25:S Evans MF, Cooper K. Human papillomavirus integration: detection by in situ hybridization and potential clinical application. J. Pathol. 202(1), 1-4 (2004). 6. Sotlar K, Stubner A, Diemer D et al. Detection of high-risk human papillomavirus E6 and E7 oncogene transcripts in cervical scrapes by nested RT-polymerase chain reaction. J. Med. Virol. 74(1), (2004). 7. Molden T, Kraus I, Karlsen F, Skomedal H, Hagmar B. Human papillomavirus E6/ E7 mrna expression in women younger than 30 years of age. Gynecol. Oncol. 100(1), (2006).

16 16 Correlazione tra le Atipie delle Cellule Ghiandolari cervicali (AGC) al Pap test e diagnosi istologica Valutazione di un protocollo di approfondimento diagnostico P. Garutti, C. Bedoni, C. Zavatta, A. Graziano, A. Patella Clinica Ostetrica e Ginecologica, Azienda Ospedaliero-Universitaria, Ferrara Colposcopia Anno XXIII N. 3 pagg Introduzione Il ruolo del Pap test, mentre è chiaro e codificato nella diagnosi delle patologie dell epitelio squamoso del collo dell utero, non è altrettanto definito nell individuare le alterazioni della componente ghiandolare, maggiormente soggette a problemi di riproducibilità (1). Il Bethesda System 2001, anche per le alterazioni ghiandolari evidenziate al Pap test, ha distinto varie classi citologiche (2). Il processo di standardizzazione di tali classi ha indotto così nuovi protocolli di gestione del Pap test anormale per alterazioni ghiandolari, nel tentativo di risolverne la complessità. Dai dati della letteratura emerge infatti un ampia variabilità di lesioni associate ad un Pap test deponente per alterazioni ghiandolari, con un range di malignità che oscilla tra lo 0.1% ed il 17% (2-5). Ciò induce spesso ad effettuare accertamenti aggressivi (escissioni diagnostiche, isteroscopie e raschiamenti frazionati) e ad applicare protocolli non ancora omogenei. Anche il protocollo per lo screening del carcinoma del collo dell utero applicato nella Regione Emilia Romagna (RER), prevede un iter diagnostico-terapeutico per i Pap test con alterazioni di tipo ghiandolare. Secondo tale protocollo, le donne con atipie delle cellule ghiandolari al Pap test vengono sottoposte a colposcopia, valutazione endocervicale (cytobrush e curettage) ed eventualmente anche endometriale (ecografia e/o isteroscopia e raschiamento frazionato). Le pazienti negative a tale approfondimento diagnostico vengono ricontrollate con citologia, colposcopia e valutazione endocervicale a sei e dodici mesi (6). Comunicazione libera presentata al XXV Congresso Nazionale della, Verona, 5-7 Dicembre 2010 Obiettivo primario di questo studio è verificare la correlazione tra il reperto citologico di AGC e la diagnosi istologica e valutare l efficacia del protocollo applicato nella RER. Obiettivo secondario è verificare quali parametri clinici potrebbero essere utilizzati ad integrazione del percorso diagnostico. Materiali e metodi casistica riguarda le pazienti afferite al Centro di Colposcopia della Clinica Ostetrica e Ginecologica dell Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara dal 1 Gennaio 2004 al 31 Dicembre I dati sono stati elaborati dal database Venere in Microsoft Office Access che registra l attività dell ambulatorio di Colposcopia. refertazione citologica sec. Bethesda System 2001 e l esame istologico sono stati effettuati presso l Istituto di Anatomia Patologica. I referti citologici sono stati quindi confrontati con la diagnosi definitiva derivata dall applicazione del protocollo diagnostico terapeutico della RER. I risultati sono stati suddivisi a seconda delle classi di età delle pazienti. Risultati Su 2690 donne afferite al centro per Pap test anomalo, 123 (4,6%) presentavano alterazioni delle cellule ghiandolari (AGC): in 51 casi si trattava di AGC endocervicale, in 40 casi di AGC endometriale, in 6 di AGC NOS (non altrimenti specificate), in 19 casi di AGC probabile neoplasia, in 7 casi di AGC suggestive di patologie neoplastiche (AIS, Adenocarcinoma endocervicale, Adenocarcinoma endometriale, Adenocarcinoma NOS). Delle 123 pazienti, 71 (57,7%) sono state sottoposte ad

17 17 frequenza delle alterazioni ghiandolari citologiche tra i Pap test anomali non è molto elevata in questa casistica (4,6%). diagnosi successiva all approfondimento diagnostico rivela l assenza di lesioni nel 61% dei casi, confermata anche ai controlli successivi; mentre vi è un 17,8% di lesioni significative, di cui il 9,7% è rappresentato da patologia maligna, il 2,4% da AIS, ed anche un 5,7% da patologia squamosa riferibile a CIN2-3. Tali risultati non si discostano da quanto riportato in letteratura (3). Dai nostri dati emerge che nell ambito dei reperti citologici deponenti per AGC coesistono in percentuali significative sia casi che ai successivi accertamenti non risultano patologici (61%), sia lesioni maligne (9,7%), il che impone una particolare attenzione nella gestione di tali pazienti. conseguenza è l impatto considereisteroscopia e raschiamento frazionato, e 21 (17,1%) ad escissione cervicale mediante ansa diatermica. Le pazienti con sanguinamenti anomali nella nostra casistica erano 25 (20,3%), delle quali 5 presentavano una patologia maligna. diagnosi definitiva è risultata negativa in 75 casi (61%), che sono stati rivalutati a 6 e 12 mesi con conferma della negatività. I 123 casi di AGC sono stati analizzati a seconda delle suddette sottoclassi di inquadramento. correlazione fra reperto citologico e quadro istologico è riportata nelle tabelle successive, in cui le pazienti sono raggruppate per fascia di età. Tra le 36 pazienti risultate negative all istologia, in 3 casi vi era iperplasia endometriale, in un caso iperplasia microghiandolare, in 2 casi metaplasia tubarica, in 5 casi polipo del canale cervicale, in 2 casi polipo endometriale. Delle 30 pazienti risultate negative all istologia, in 5 casi vi era iperplasia semplice, in un caso iperplasia endometriale complessa, in un caso iperplasia microghiandolare cervicale, in 2 casi metaplasia tubarica, in 2 casi polipo del canale cervicale, in 4 casi polipo endometriale. Discussione e conclusioni Tabella 1. - Correlazione tra citologia con atipie delle cellule ghiandolari endocervicali e diagnosi istologica definitiva, per fascia di età. Età Negativo CIN 1 Diagnosi definitiva CIN 2 CIN 3 AIS ADK < 35 anni 3 (60) 1 (20) 0 1 (20) anni 25 (69,4) 10 (27,8) 1 (2,8) > 55 anni 8 (80) 1 (10) * (10) 10 Totale 36 (70,6) 12 (23,4) 1 (2) 1 (2) 0 1 (2) 51 Totale * Paziente di 64 anni, sintomatica, colposcopia positiva (sospetto carcinoma), citologia del canale cervicale: adenocarcinoma NOS, diagnosi definitiva: adenocarcinoma endometrioide infiltrante. Tabella 2. - Correlazione tra citologia con atipie delle cellule endometriali e diagnosi istologica definitiva, per fascia di età Età Negativo CIN 1 Diagnosi definitiva CIN 2 CIN 3 AIS ADK < 35 anni anni 18 (85,7) 2 (9,5) * (4,8) 21 > 55 anni 12 (63,1) 5 (26,3) 0 1 (5,3) 0 1** (5,3) 19 TOTALE 30 (75) 7 (17,5) 0 1 (2,5) 0 2 (5) 40 Totale * Paziente di 35 anni, colposcopia positiva (G1), RF: adenocarcnoma dell endometrio. ** Paziente di 58 anni, colposcopia negativa, RF: iperplasia ghiandolare complessa atipica,isterectomia: adenocarcinoma endometriale.

18 18 Tabella 3. - Correlazione tra citologia con atipie delle cellule ghiandolari di significato indeterminato e la diagnosi istologica definitiva, per fascia di età Età Negativo CIN 1 Diagnosi definitiva CIN 2 CIN 3 AIS ADK < 35 anni anni 4 (66,7) 2 (33,3) * > 55 anni TOTALE 4 (66,7) 2 (33,3) Totale * 2 pazienti sottoposte a RF e curettage risultati negativi; 2 pazienti sottoposte a curettage negativo ed ecografia pelvica (negativa) con follow-up negativo. 1 paziente di 41 anni, asintomatica, sottoposta a citologia del canale cervicale con follow-up ad 1 anno negativo; 1 paziente sottoposta a curettage del canale cervicale risultato negativo. Tabella 4. - Correlazione tra citologia con atipie delle cellule ghiandolari probabile neoplasia e la diagnosi istologica definitiva, per fascia di età Età Negativo CIN 1 Diagnosi definitiva CIN 2 CIN 3 AIS ADK < 35 anni 0 2 (66,7) 1 (33,3) anni 5 (45,5) 3 (27,3) 0 2 (18,2) 1* (9) 0 11 > 55 anni ** (100) 5 TOTALE 5 (26,3) 5 (26,3) 1 (5,3) 2 (10,5) 1 (5,3) 5 (26,3) 19 Totale * colposcopia G2, associato a CIS ** adenocarcinomi endometrioidi infiltranti, tutte le pazienti erano in menopausa, 4 pazienti con colposcopia negativa, di cui 1 sintomatica (spotting), 1 paziente con colposcopia positiva (G2). Tabella 5 - Correlazione tra citologia con atipie delle cellule ghiandolari suggestive di patologie neoplastiche (AIS, Adenocarcinoma endocervicale, Adenocarcinoma endometriale, Adenocarcinoma NOS) e la diagnosi istologica definitiva Citologia Negativo CIN 1 Diagnosi definitiva CIN 2 CIN 3 AIS ADK AIS * (100) 0 2 Adenoca endocervicale (50) 0 1** (50) 2 Adenoca endometriale @ (100) 2 Adenoca NOS # (100) 1 TOTALE (14,3) 2 (28,6) 4 (57,1) 7 Totale * 29 anni, colposcopia :ATA-G2, follw-up a 2 anni negativo; 35 anni, colposcopia: sospetto carcinoma, esito escissione AIS + CIS con margini di resezione positivi, isterectomia negativa. ** 50 anni, sintomatica, in menopausa, colposcopia: sospetto carcinoma, esito istologico da isterectomia: carcinoma pazienti in menopausa, sintomatiche, colposcopie negative, esito istologico da isterectomia: 1 adenocarcinoma endometrioide (68 anni) e 1 adenocarcinoma sieroso a cellule chiare (66 anni). # 66 anni, in menopausa, colposcopia negativa, esito istologico da isterectomia: adenocarcinoma endometrioide.

19 19 vole di questa categoria di Pap test anormale, poiché richiede un alta percentuale di accertamenti invasivi per raggiungere una diagnosi definitiva. Pertanto si rende necessario l utilizzo di un iter diagnostico specifico (5,7). Il protocollo della Regione Emilia Romagna prevede una valutazione mediante colposcopia e sondaggio del canale cervicale in tutti i casi ed eventuale valutazione endometriale. valutazione colposcopica ed il sondaggio del canale cervicale è stata utile in quanto ha permesso sia di individuare la patologia squamosa, che si può nascondere dietro al sospetto citologico di alterazione ghiandolare (5,7% CIN 2-3), sia di diagnosticare gli AIS associati a lesioni squamose (2 casi su 3), dato confermato in letteratura in oltre il 50% dei casi (3). Nel protocollo regionale RER la valutazione endometriale è lasciata alla discrezione del clinico. Altri protocolli internazionali invece prendono in considerazione, nell ambito dei parametri che devono guidare il clinico nella prosecuzione degli accertamenti diagnostici, l età della paziente, la presenza di sanguinamenti anomali o altre affezioni croniche suggestive di aumentato rischio di patologia endometriale (3) e l appartenenza ad alcune sottoclassi citologiche di AGC (4, 5). I dati del nostro studio, pur nell esiguità della nostra casistica, mostrano l assenza di lesioni maligne al di sotto dei 35 anni, età che potrebbe rappresentare il cut off per ulteriori approfondimenti diagnostici. Per quanto riguarda l associazione di AGC ai sanguina- menti anomali, nella nostra casistica ha determinato un overtreatment, considerando che è stata espressione di patologia maligna solo in un quinto dei casi sottoposti a valutazione endometriale. Oltretutto la maggior parte dei carcinomi è stata diagnosticata in pazienti completamente asintomatiche. suddivisione in sottoclassi citologiche di AGC rimane soltanto un criterio orientativo nella scelta di un eventuale accertamento endometriale. Infatti sono risultate particolarmente a rischio le sottocategorie AGC suggestive di carcinoma ed AGC probabile neoplasia rispettivamente con il 57,1% ed il 26,3% di adenocarcinomi. Tuttavia anche nell ambito delle AGC endometriale ed AGC endocervicale abbiamo riscontrato una percentuale di patologia maligna che, seppur minore (rispettivamente 5% e 2%), è assolutamente non trascurabile (Tabelle 1 e 2). A nostro avviso quindi la valutazione endometriale potrebbe essere un esame da prevedersi nella totalità dei casi, soprattutto quando dall iter non compaiono chiari segni di compromissione a livello cervicale. In definitiva, un iter ben condotto, che rispetti protocolli standardizzati e condivisi garantisce buoni livelli di assistenza nonostante la complessità che caratterizza questa classe di anomalia citologica come dimostrato in letteratura (7). È innegabile il valore aggiunto del giudizio clinico, per integrare i protocolli e stabilire l iter diagnostico terapeutico personalizzato più appropriato. Bibliografia 1. Confortini M, Di Bonito L, Carozzi F, Ghiringhello B, Montanari G, Parisio F, Prandi S,; GISCI Working Group for Cervical Cytology. Interlaboratory reproducibility of atypical glandular cells of undetermined significance: a national survey. Cytopathology Dec;17(6): Solomon D, Davey D, Kurman R, Moriarty A, O Connor D, Prey M, Raab S, Sherman M, Wilbur D, Wright t Jr, Young N; Forum Group Members; Bethesda 2001 Workshop. The 2001 Bethesda System terminology for reporting results of cervical cytologt. JAMA, 2002, 287, Wright TC, Massad S, Dunton C, Spitzer M, Wilkinson E, Solomon D, for the 2006 American Society for Colposcopy and Cervical Pathology- Sponsored Con- sensus Conference. Am J Ob Gin. 2007; NHS Cervical Screening Programme. Colposcopy and Programme Management: Guidelines for the NHS Cer- vical Screening Programme. NHSCSP Publication No. 20, Sheffield: IARC. Euopean guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer Screening, Second Edition 2008; pp Protocollo diagnostico terapeutico dello screening per la prevenzione del tumore del collo dell utero della Regione Emilia- Romagna: 3 Edizione Sopracordevole F. Percorso diagnostico-terapeutico delle pazienti con lesioni ghiandolari. Colposcopia Anno XIX N. 3 pagg

20 20 Cellule Squamose Atipiche (ASC-US) associate a localizzazione asintomatica di Pemphigus a livello cervico-vaginale: descrizione di due casi Lezzi V., Mancini T., Carriero C., Capursi T., Putignano G. Dipartimento di Ginecologia-Ostetricia e Neonatologia, Università degli Studi di Bari Aldo Moro Colposcopia Anno XXIII N. 3 pagg Introduzione Le lesioni bollose di natura immunopatologica, in rapporto ai diversi tipi di autoanticorpi ed ai differenti meccanismi patogenetici, si distinguono in diverse forme. Il Pemphigus Vulgaris, che ha la prognosi più severa, è determinato da autoanticorpi contro la proteina legante delle cellule dell epitelio squamoso (desmogleina), determinando così le tipiche bolle intraepidermiche. Varianti del pemphigus derivano dal tipo di desmogleina coinvolta (1 e 3). Il Pemfigoide è una forma bollosa clinicamente simile al pemphigus, tendenzialmente più benigna, nella quale gli autoanticorpi colpiscono la proteina che lega lo strato basale dell epitelio allo stroma (pemfigoide bolloso) o più in profondità (pemfigoide cicatriziale). Altre forme bollose croniche, che colpiscono spesso in età pediatrica, sono la malattia da IgA lineari, forma autoimmune idiopatica o indotta da farmaci, e la Hailey-Hailey disease (cosiddetto pemfigo familiare benigno) di origine genetica e non immunitaria. Descrizione dei casi clinici CASO 1. Reperto di cellule squamose atipiche di significato indeterminato (ASCUS) nel corso di uno screening citologico di routine di una donna di 43 anni, parità 1/0/0/1, Le cellule squamose apparivano di tipo intermedio, con nuclei grandi e ipercromatici, ma con cromatina non particolarmente irregolare (figura 1.a-b). Si consigliava secondo prassi la colposcopia, nel corso della quale si evidenzia un area sopraelevata sul labbro posteriore con tendenza alla disepitelizzazione (segno di Comunicazione libera presentata al XXV Congresso Nazionale della, Verona, 5-7 Dicembre 2010 Nikolsky positivo figura 2.a). Si eseguiva biopsia su questa area e l esame istologico riferiva la diagnosi di pemfigo volgare della portio con presenza di acantosi e acantolisi, iperplasia papillare, infiltrazione flogistica linfoplasmacellulare del corion, spongiosi ed emperipolesi. L immunofluorescenza indiretta (IgG) riportava una positività a 1:50. conferma della natura della lesione era data dal reperto di positività dell immunofluorescenza diretta per la presenza di IgG e C3 intraepiteliali. All esame colposcopico allargato apparivano indenni la vagina e la regione vulvo-perineale. Il controllo accurato di tutta la cute non evidenziava alcuna altra lesione di tipo bolloso, così come non lamentava alcun tipo di disturbo o lesione a livello orale. Il controllo oculistico risultava negativo per il tipo di patologia in studio. Il regime di terapia cortisonica era instaurato immediatamente con la prospettiva di un trattamento cronico, e con una graduale riduzione del dosaggio in funzione dell evoluzione della malattia e del titolo delle IgG sieriche. In virtù del pronto intervento terapeutico, i controlli successivi dermatologici, sierologici e ginecologici risultarono negativi. paziente, nel corso dei periodici controlli colpocitologici, ha evidenziato periodicamente la presenza di sporadici elementi suggestivi di ASC-US/AGC: sono state eseguite biopsie sia a livello cervicale, sia a livello endocavitario (isteroscopia), tutte risultate negative. paziente è tuttora sotto regime cortisonico moderato ed attento follow-up ginecologico e dermatologico, ma, nonostante le recidive della patologia a livello cervicale, non ha mai lamentato la comparsa di lesioni bollose a livello di una qualsiasi altra sede cutanea o mucosa dopo più di dieci anni di follow-up. CASO 2. Paziente di 48 anni, con reperto di ASC-US (figura 1.c-d) e con una piccola lesione colposcopica tipo erosione tondeggiante sul labbro anteriore (figura 2.b) oltre ad un ectropion periorifiziale. biopsia e l immunofluorescenza diretta conferma-