25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line

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1 Manuale d istruzioni ClinMass LC-MS/MS Kit Completo 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line MS7000 Per uso diagnostico in vitro IVDD, 98/79/EC

2 RECIPE Chemicals + Instruments GmbH Dessauerstraße 3, Munich / Germany Phone: +49 / 89 / Fax: +49 / 89 / info@recipe.de MS7000 Per uso diagnostico in vitro Versione: 1.0 Data di Revisione: Nome del file: MS7000_m_i.docx

3 Contenuti 1 INTRODUZIONE Uso previsto Simboli IVD Background Clinico Descrizione generale della procedura analitica 5 2 COMPONENTI DEL KIT COMPLETE E ACCESSORI Informazioni per l ordine Informazioni per la sicurezza Condizioni di conservazione e durata dei componenti del kit Disposizioni per lo smaltimento 8 3 STRUMENTAZIONE RICHIESTA 9 4 OPERAZIONI SUL SISTEMA ANALITICO Configurazione del sistema LC Flussare il sistema LC Equilibrazione del sistema LC Inizializzare il sistema analitico Parametri LC Switching valve automatica (analisi on-line) Parametri MS/MS Modalità Standby 15 5 IMPLEMENTAZIONE DELLA PROCEDURA ANALITICA Raccolta e conservazione dei campioni Preparazione del campione Ricostituzione dei calibratori / controlli sierici liofili Flusso di lavoro Preparazione della miscela IS/P Precipitazione Analisi LC-MS/MS Stabilità dei campioni preparati Analisi LC-MS/MS Ottimizzazione degli analiti (MS/MS) Equilibrazione del sistema analitico e corsa test Calibrazione Controllo di qualità Esempi di cromatogrammi Calibratore sierico ClinCal Campioni con epimero C-3 (3-epi-25-OH-vitamina D3) 21

4 Contenuti 6 VALUTAZIONE 22 7 TEST DATI Validazione Linearità, limiti di rilevazione e quantificazione Recupero Precisione Intraserie Interserie Intervalli di riferimento 25 8 REFERENZE 26 9 RISOLUZIONE DEI PROBLEMI APPENDICE: DICHIARAZIONE DI CONFORMITÀ EC 29

5 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina 1 1 Introduzione 1.1 Uso previsto Il kit completo ClinMass permette la determinazione della 25-OH-vitamina D2/D3 in siero e plasma umani in LC-MS/MS. I componenti del kit devono essere usati in accordo con le istruzioni contenute in questo manuale. Il kit non può essere usato con componenti di altri produttori Simboli IVD Simboli in accordo con la direttiva EU 98/79/EC per prodotti medici per uso diagnostico in vitro (IVDD), usati sulle etichette dei prodotti e in questo manuale: Per uso diagnostico in vitro Produttore Numero d ordine Numero di lotto Limite Massimo di temperatura: C Limiti di temperatura: C - C Data di scadenza: Vedere istruzioni per l uso

6 Pagina 2 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line 1.2 Background Clinico Il termine Vitamina D rappresenta un gruppo di steroidi con attività antirachitica. I membri clinicamente rilevanti di questo gruppo solo la Vitamina D2 (ergocalciferolo) e la Vitamina D3 (colecalciferolo). Ad una sufficiente esposizione alla luce solare (UV-B), la Vitamina D3 può essere prodotta dalla pelle, ciò non concorda con la classica definizione di una vitamina. La biosintesi cutanea della Vitamina D3 è la più importante fonte di Vitamina D. L apporto attraverso la dieta diventa importante quando l esposizione al sole è limitata, in quanto solo pochi cibi contengono naturalmente un adeguato o un elevato quantitativo di Vitamina D, per esempio pesci di mare e olio di fegato di merluzzo [1-3]. La Vitamina D, ottenuta dalla nutrizione (D2 e D3) o prodotta a livello endogeno (D3), viene metabolizzata nel fegato in 25-OH-vitamina D. Per un ulteriore idrossilazione nel fegato si genera la forma biologicamente attiva, la 1,25-(OH) 2 -vitamina D (figura 1). Per la valutazione dello stato di Vitamina D, viene generalmente utilizzata la concentrazione del metabolita primario (25-OH-vitamina D). La ragione principale consiste nella lunga stabilità di questo metabolita (3 settimane) che fornisce un indicazione del deposito di Vitamina D in un lungo periodo [1]. Inoltre, le concentrazioni in plasma e siero di 25-OH-vitamina D sono circa 1000 volte maggiori di quelle della 1,25-(OH) 2 -vitamina D [4]. 25 R 2 25 R 2 1 OH R 1 1 OH R 1 Vitamina D2: R1 = H, R2 = H 25-OH-Vitamina D2: R1 = H, R2 = OH 1,25-(OH) 2 -Vitamina D2: R1 = OH, R2 = OH Vitamina D3: R1 = H, R2 = H 25-OH-Vitamina D3: R1 = H, R2 = OH 1,25-(OH) 2 -Vitamina D3: R1 = OH, R2 = OH Figura 1: Vitamina D2, D3 e metaboliti

7 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina 3 La Vitamina D gioca un ruolo importante per l incorporazione del calcio nella matrice ossea. Carenze di Vitamina D (ipovitaminosi D) interferiscono quindi con la corretta mineralizzazione delle ossa. Di conseguenza, le ossa rimangono più fragili e si piegano sotto stress meccanici. La carenza di Vitamina D porta a rachitismo nei bambini e osteoporosi negli adulti. In contrasto, un intossicazione di Vitamina D (ipervitaminosi D) può risultare da un eccessivo consumo con la dieta di Vitamina D2 e D3 causato da cibi fortificati o integratori. I sintomi possono includere nausea, vomito, diarrea, mal di testa, polidipsia e poliuria tutti associati con ipercalcemia [1]. A causa dell influenza del sole sulla sintesi di Vitamina D3 endogena, ci sono diversi intervalli di normalità della Vitamina D in estate e in inverno*. Le concentrazioni di 25-OH-Vitamina D (D2 + D3) maggiori di 30 µg/l [5, 6] sono largamente considerate appropriate per assicurare una sufficiente quantità di Vitamina D, mentre concentrazioni sotto i 20 µg/l [1, 6] indicano chiaramente una carenza (vedere la classificazione dello stato di Vitamina D nella sezione 7.2). Una carenza può essere trattata con una supplementazione di Vitamina D (D2 o D3). Un livello di 40 µg/l richiede un supplemento orale di Vitamina D di µg/giorno in base all esposizione al sole [7]. Le persone a rischio per ipovitaminosi D, specialmente nei mesi invernali, sono gli anziani, le donne incinte, i neonati e tutte le persone che passano poco tempo all aperto. Comunque, livelli insufficienti di Vitamina D non riguardano solo questi gruppi a rischio, ma sono diffusi nella popolazione generale [1, 5, 6, 8]. Secondo [8], in Germania più del 60% dei pazienti misurati presenta livelli di 25-OH-vitamina D sotto i 20 µg/l durante la stagione invernale. Quindi, per prevenire uno stato di carenza di Vitamina D, un regolare monitoraggio è raccomandato specialmente alle persone dei gruppi a rischio. Inoltre, anche le persone sane di età superiore ai 50 anni devono essere controllati ogni 5 anni come misura preventiva contro l osteoporosi [8]. Deve essere considerato che il siero dei pazienti può contenere l epimero C-3 della 25-OH-vitamina D. Questi epimeri sono diasteroisomeri della 25-OH-vitamina D (figura 2) e quindi possono essere separati cromatograficamente dagli analiti e quantificati in spettrometria di massa. Studi recentemente pubblicati riportano significative concentrazioni di of 3-epi-25-OH-vitamina D3, in particolare nei sieri dei neonati (età < 1 anno) [9, 10] e dei bambini [10]. L epimero C-3 della 25-OH-vitamina D2 non è rilevabile in campioni nativi (vedere es. [10], [11] e [12]). Siccome la rilevanza clinica dell epimero C-3 non è ancora chiara, deve essere considerata una quantificazione separata dell epimero C-3 rispetto alla 25-OH-vitamina D3 [10]. * In accordo con [4], i seguenti intervalli di normalità della 25-OH-Vitamina D sono consigliati per l estate e l inverno: estate: µg/l, inverno: µg/l

8 Pagina 4 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line 25 OH 25 OH 1 1 OH OH 3-epi-25-OH-vitamina D2 3-epi-25-OH-vitamina D3 Figura 2: epimero C-3 della 25-OH-vitamina D. Diversamente dalla 25-OH-vitamina D, il gruppo idrossilico è posto sull atomo C-3 sopra il livello dell anello Il presente kit completo* ClinMass LC-MS/MS permette un affidabile determinazione della 25-OH-vitamina D2 e della 25-OH-vitamina D3 per la determinazione dello stato di Vitamina D e permette la separazione e l analisi qualitativa del rispettivo epimero C-3 nella stessa corsa analitica. Per la quantificazione della 25-OH-vitamina D2/D3 viene fornito il calibratore sierico ClinCal a 4 livelli. Il controllo di qualità viene eseguito mediante l uso dei controlli sierici ClinChek. La costante elevata qualità dei reagenti e del materiale di riferimento è garantita dal nostro sistema di qualità interna QM (certificato ISO 9001 e ISO 13485) e da programmi di controllo di qualità esterna (INSTAND, Germania; DEQAS, UK). * Per la determinazione in HPLC è disponibile un kit completo ClinRep con numero d ordine Per la determinazione in UPLC è disponibile un kit completo ClinRep con numero d ordine

9 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina Descrizione generale della procedura analitica In questo metodo analitico la 25-OH-vitamina D2/D3 viene determinata in plasma o siero. L analisi viene eseguita mediante SPE-HPLC online e con spettrometria di massa tandem (LC- MS/MS). I metodi convenzionali in HPLC richiedono una fase preparativa manuale, eseguita prima dell iniezione. Coi metodi HPLC online la purificazione del campione viene eseguita con l LC-MS/MS configurata per scambiare diverse colonne usando una valvola a porte multiple e una colonna SPE (fase preparativa online, vedere sezione ). Dopo la separazione cromatografica gli analiti vengono ionizzati mediante APcI (APcI: atmospheric pressure chemical ionisation) e rivelati mediante uno spettrometro di massa tandem (MS/MS). In APcI, i componenti del campione vengono vaporizzati e poi ionizzati prima di passare nel sistema MS/MS che è composto di due quadrupoli connessi da una cella di collisione. La misura degli analiti in questo metodo è condotta in modalità MRM (MRM: multiple reaction monitoring). In questa modalità solo gli ioni selezionati (chiamati ioni precursori ) con un definito rapporto mass/carica (m/z) vengono isolati nel primo quadrupolo e successivamente trasferiti nella cella di collisione. Lì gli ioni vengono frammentati per impatto con un gas inerte (argon o azoto) a voltaggi selezionati. Di tutti i frammenti generati (chiamati ioni prodotto ), solo quelli con un definito rapporto m/z vengono isolati nel quadrupolo finale per il successivo rilevamento. Quindi, la misura in MRM assicura l identificazione e la quantificazione con elevata selettività e sensibilità, identificando l analita in base alle transizioni di massa caratteristiche del composto d interesse. Questo metodo permette una robusta e affidabile quantificazione in matrici biologiche complesse mediante l utilizzo di uno standard interno marcato isotopicamente (vedere sezione 4.4.2, tabella 5). Per ogni analita (es. 25-OH-vitamina D2 e 25-OH-vitamina D3) vengono usate due transizioni (quantificatrice, qualificatrice). Il tempo di analisi è di 3 minuti. La forma epimerica C-3 della 25-OH-vitamina D3 (3-epi-25-OH-vitamina D3) che l epimero più rilevante in campioni nativi*, viene separato dal picco dell analita con un grado sufficiente per evitare valori analitici falsamente elevati (vedere cromatogrammi esemplicativi in sezione ). Una colonna alternativa con ordine num. MS7035 può essere usata per aumentare la risoluzione a basse concentrazioni di epimero C-3. Il tempo di analisi diventa di 4 minuti. Per l ottimizzazione dei parametri MS/MS (vedere sezione 5.3.1) e per la corsa test del sistema analitico (vedere sezione 5.3.2) è disponibile una mix di ottimizzazione ClinMass (ordine num. MS7014). Per la corsa test per la separazione della 3-epi-25-OH-vitamina D3 è disponibile un ulteriore mix di ottimizzazione ClinMass con ordine num. MS7015 (vedere sezione 5.3.2). La calibrazione del sistema analitico viene eseguita con i calibratori sierici ClinCal. Per questo scopo viene fornito un set di calibratori sierici a 4 livelli (vedere sezione 5.3.3). Il controllo di qualità viene eseguito con i controlli sierici ClinChek. Questi controlli sono disponibili in 2 diverse concentrazioni (vedere sezioni 5.3.4). * 3-epi-OH-vitamina D2 è generalmente non rilevabile in campioni nativi (vedere sezione 1.2). La separazione dei due epimeri rimane teoricamente possibile con questo kit.

10 Pagina 6 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line 2 Componenti del kit completo e accessori 2.1 Informazioni per l ordine Order No.Description Quantity MS7000 ClinMass Complete Kit for 25-OH-Vitamin D2/D3 1 pce. in Plasma and Serum for 300 assays Contents: Autosampler Washing Solution SPE - Buffer Mobile Phase IS Internal Standard Serum Calibrator Set, lyophil. (Level 0-3) Sample Pretreatment Vials P Precipitant Manual 1 x MS x MS x MS x MS x MS x MS x MS7021 Separately available components: MS7005 Autosampler Washing Solution 1000 ml MS7009 SPE - Buffer 1000 ml MS7010 Mobile Phase 700 ml MS7012 IS Internal Standard 30 ml MS7013 Serum Calibrator Set, lyophil. (Level 0-3) 4 x 1 x 1 ml MS7014 Optimisation Mix 2 ml MS7015 Optimisation Mix 3-epi 1 ml MS7020 Sample Pretreatment Vials 100 pcs. MS7021 P Precipitant 15 ml Start Accessories: MS7030 Analytical Column with test chromatogram 1 pce. MS7035 Analytical Column 3-epi with test chromatogram 1 pce. (for the additional analysis of 3-epi-25-OH-Vitamin D3) MS7031 SPE - Column 1 pce. FK7400 Inline-Filter (stainless steel sieve, free of dead volume) 1 pce. Accessories: FK1102 Switching valve Sykam (6-port / 3-channel incl. electr. drive, PEEK) 1 pce. FK7330 Endfittings 2 pcs. FK7340 Sealings and sieves 4 pcs. each FK7350 Endstoppers 2 pcs. ClinChek Controls: MS7080 Serum Control, lyophil., Level I 10 x 1 ml MS7081 Serum Control, lyophil., Level II 10 x 1 ml MS7082 Serum Control, lyophil., Level I, II 2 x 5 x 1 ml

11 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina Informazioni per la sicurezza Diversi componenti del kit come la fase mobile e i reagenti sono preparazioni chimiche che possono contenere sostanze pericolose. Per informazioni sulla sicurezza consultare le rispettive schede di sicurezza (SDS) di ogni componente. I calibratori sono preparati con siero di origine animale (siero di cavallo). Sebbene il siero sia controllato a livello veterinario in termini di regolamentazione EC 1774/2002 deve essere considerato come potenzialmente infetto. Si raccomanda di maneggiare questo prodotto con le stesse precauzioni usate per i campioni dei pazienti. Dettagliate informazioni per la sicurezza sono fornite nell appropriata scheda di sicurezza. Il materiale di controllo è preparato in siero umano. Sebbene il prodotto sia testato per l assenza dei comuni marcatori d infezione, deve essere considerato come potenzialmente infetto. Si raccomanda di maneggiare questo prodotto con le stesse precauzioni usate per i campioni dei pazienti. Dettagliate informazioni per la sicurezza sono fornite nell appropriata scheda di sicurezza Condizioni di conservazione e durata dei componenti del kit Sballare i componenti del kit dalla confezione di trasporto immediatamente dopo averlo ricevuto e seguire le indicazioni di conservazione indicate sulle etichette dei prodotti e in tabella 1. I componenti inutilizzati, conservati nelle condizioni appropriate, possono essere usati fino alla data di scadenza indicata sull etichetta del prodotto. Dopo l uso dei reagenti ClinMass, della fase mobile ClinMass e dell SPE buffer ClinMass, le bottiglie devono essere chiuse e conservate immediatamente nelle condizioni indicate. Se vengono seguite le corrette procedure di conservazione la stabilità dei reagenti è la stessa dei prodotti ancora chiusi. Per le condizioni di conservazione e la stabilità dello Standard Interno ClinMass, delle mix di ottimizzazione ClinMass, dei calibratori ClinCal e dei controlli ClinChek (liofili / dopo ricostituzione) riferirsi ai rispettivi fogli illustrativi dei prodotti. Tabella 1: Condizioni di conservazione dei componenti del kit Ordine num. Descrizione del prodotto Condizioni di conservazione MS7005 Sol. di lavaggio dell autocampionatore Conservare a C MS7009 SPE - Buffer Conservare a C MS7010 Fase Mobile Conservare a C MS7012 IS Standard Interno Conservare sotto - 18 C MS7013 Calibratori sierici, liofili Conservare sotto - 18 C*

12 Pagina 8 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line MS7014 Mix di ottimizzazione Conservare sotto - 18 C MS7015 Mix di ottimizzazione 3-epi Conservare sotto - 18 C MS7020 Vials per la fase preparativa Conservare a temperature ambiente MS7021 P Precipitante Conservare a C MS7030 Colonna Analitica Conservare a C MS7035 Colonna Analitica 3-epi Conservare a C MS7031 Colonna SPE Conservare a C FK7400 FK1102 FK7330 FK7340 FK7350 MS7080- MS7082 Inline-Filter Switching valve Sykam (6-porte / 3-canali) Endfittings Sealings and sieves Endstoppers Controlli sierici, Livelli I, II, I+II Conservare a temperature ambiente Conservare a temperature ambiente Conservare a temperature ambiente Conservare a temperature ambiente Conservare a temperature ambiente Conservare sotto - 18 C* * Si riferisce al prodotto liofilo. Per le condizioni di conservazione dopo la ricostituzione riferirsi al foglio illustrativo Disposizioni per lo smaltimento Per lo smaltimento i rifiuti devono essere raccolti separatamente in base alle diverse proprietà chimiche dei prodotti. Indicazioni per lo smaltimento dei prodotti e il rispettivo confezionamento sono riportate nella sezione 13 delle rispettive schede di sicurezza.

13 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina 9 3 Strumentazione richiesta Per l utilizzo di questo kit è richiesto un sistema HPLC equipaggiato con uno spettrometro di massa tandem (LC-MS/MS) e software di gestione. Requisiti per lo spettrometro di massa tandem: Spettrometro di massa tandem con sufficiente sensibilità. Moduli LC richiesti: Autocampionatore (con funzione di raffreddamento, 4 C) Pompa isocratica HPLC 1 (SPE - buffer) Pompa isocratica HPLC 2 (fase mobile) 6-porte-3-canali-switching valve (e.s. RECIPE, ordine num. FK1102) Riscaldatore di colonna (40 C) Degasatore (opzionale) Per la fase preparativa dei campioni sono richiesti i seguenti strumenti da laboratorio: Pipette e puntali Centrifuga da banco Vortex

14 Pagina OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line 4 Operazioni sul sistema analitico 4.1 Configurazione del sistema LC Connettere i moduli LC (P1, P2, AS) e la switching valve (ASV) automatica come mostrato nella figura sottostante, con eccezione delle (SPE, AC). Inserire il capillare terminale in un contenitore adeguato per lo scarico. P1 P2 AS PF ASV SPE scarico AC CH scarico Figura 3: Configurazione del sistema LC Abbreviazioni: P1: pompa isocratica HPLC (SPE-buffer); P2: pompa isocratica HPLC (fase mobile); AS: autocampionatore; PF: inline-filter (ordine no. FK7400); ASV: automatica switching valve (switching valve, 6-porte/3-canali ad alta pressione; ordine no. FK1102); SPE: Colonna SPE; AC: Colonna analitica; CH: riscaldatore di colonna 4.2 Flussare il sistema LC Impostare entrambe le pompe HPLC (P1, P2) ad un flusso di 1 ml/min e flussare il sistema LC con 10 ml di SPE buffer e fase mobile rispettivamente. Successivamente collegare la colonna SPE (SPE) e l a colonna analitica (AC) come mostrato in figura 3. La colonna analitica deve essere installata nel riscaldatore di colonna (CH). Quando si collegano la colonna SPE e la colonna analitica prestare attenzione che la direzione del flusso segua la direzione indicata con le frecce sulle colonne stesse!

15 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina Equilibrazione del sistema LC Dopo aver flussato il sistema (vedere sezione 4.3) l equilibrazione deve essere eseguita come segue: Impostare entrambe le pompe HPLC (P1, P2) ad un flusso di 0.5 ml/min, impostare il forno portacolonne a 40 C e flussare approssimativamente 10 ml di SPE-buffer e di fase mobile rispettivamente attraverso la colonna. Successivamente, fermare le pompe HPLC e collegare il capillare in uscita dalla colonna analitica allo spettrometro di massa. 4.4 Inizializzare il sistema analitico La sezione seguente fornisce i parametri per il sistema LC (vedere sezione 4.4.1) e per lo spettrometro di massa (vedere sezione 4.4.2). Per l ottimizzazione, l equilibrazione e per l analisi, come per la calibrazione del sistema LC-MS/MS riferirsi alla sezione 5.3. Consultare il manuale dello spettrometro di massa per assicurarsi un corretto uso dello strumento. È consigliato anche un corso agli operatori da parte dell azienda fornitrice della strumentazione Parametri LC Tabella 2: parametri LC Pompa HPLC 1, Isocratica (SPE-buffer): Pompa HPLC 2, Isocratica (fase mobile): SPE-Buffer / fase mobile: Colonna: Flussi usati: 0.1 ml/min, 2.0 ml/min, 5.0 ml/min; vedere tabella 3 Flusso usato: 0.5 ml/min vedere tabella 3 Assicurarsi che le bottiglie siano ben chiuse per evitare l alterazione dei tempi di ritenzione per l evaporazione di alcuni componenti dell SPE-buffer e della fase mobile. La colonna analitica va installata nel forno portacolonna (40 C). Riscaldatore di colonna: 40 C Ad un flusso di 0.5 ml/min, la contropressione della colonna analitica (ordine num. MS7030) non deve superare i 250 bar*. Ad un flusso di 5.0 ml/min, la contropressione della colonna SPE non deve superare i 20 bar. I filtri di ricambio del filtro in linea (PF) devono essere sostituiti ogni 300 iniezioni. Queste parti devono essere sostituite se la contropressione del filtro in linea super i 20 bar (ad un flusso di 5.0 ml/min). * In caso venga usata la colonna con numero d ordine MS7035, la contropressione della colonna non deve superare i 350 bar.

16 Pagina OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Autocampionatore: Impostare la funzione di raffreddamento dell autocampionatore a 4 C. Per il lavaggio del sistema d iniezione è disponibile una soluzione di lavaggio dell autocampionatore (ordine num. MS7005). Riferirsi al manuale d istruzioni dell autocampionatore. Volume d iniezione: µl Intervallo d iniezione: 3 min (4 min*) * al posto della colonna analitica con numero d ordine MS7030, può essere usata la colonna con numero d ordine MS7035 (vedere sezione 1.3). L intervallo d iniezione viene prolungato a 4 minuti (vedere la tabella 3). Switching valve automatica: vedere sezione

17 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina Switching valve automatica (analisi on-line) L analisi viene eseguita on-line mediante l uso della switching valve automatica a 6 porte e 3 canali. Una descrizione del principio di funzionamento viene data in figura 4. P1 P2 P1 P2 AS ASV position: load AS ASV position: inject PF PF ASV 1 4 ASV SPE waste AC CH SPE waste AC CH MS MS exhaust exhaust Figura 4: Switching valve automatica e configurazione del sistema LC Abbreviazioni: P1: pompa HPLC isocratica (SPE-buffer); P2: pompa HPLC isocratica (fase mobile); AS: autocampionatore; PF: inline-filter (ordine no. FK7400); ASV: switching valve automatica (valvola ad alta pressione, 6-porte/3-canali, ordine no. FK1102); SPE: colonna SPE; AC: colonna analitica; CH: forno portacolonne; MS: spettrometro di massa tandem ASV posizione load : min: Il campione viene iniettato nel sistema LC e trasferito nella colonna SPE, che selettivamente estrae gli analiti dalla matrice del campione. I componenti della matrice vengono lavati dalla colonna SPE e portati allo scarico. Nel frattempo, la colonna analitica viene riequilibrata dal precedente ciclo d iniezione. ASV posizione inject : min: La switching valve automatica passa nella posizione di inject. Gli analiti estratti vengono eluiti dalla colonna SPE con fase mobile in controflusso. Vengono trasferiti alla colonna analitica dove vengono separati cromatograficamente. ASV posizione load : min (4.00 min*): La switching valve automatica torna nella posizione di load. Entrambe le colonne (colonna SPE e analitica) vengono riequilibrate per la successiva iniezione. * in caso di uso della colonna analitica con num. d ordine MS7035

18 Pagina OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line I tempi di rotazione e le posizioni della switching valve automatica (ASV), i flussi delle pompe HPLC P1 e P2 devono essere programmati secondo la tabella seguente. Tabella 3: tempi di rotazione e posizioni della switching valve automatica, flussi delle pompe HPLC (P1, P2) Tempo [min] Posizione ASV Pompa P1 (SPE buffer) Flusso [ml/min] Evento colonna SPE Pompa P2 (fase mobile) Flusso [ml/min] Evento colonna analitica 0.00 load 0.1 Caricamento 0.5 Equilibrazione inject 5.0 Eluizione 0.5 Caricamento Separazione load 2.0 Equilibrazione 0.5 Equilibrazione * 0.1 * Al posto della colonna analitica con num. d ordine MS7030 può essere opzionalmente usata la colonna analitica con num. d ordine MS7035 (vedere sezione 1.3). L intervallo d iniezione si allunga a 4.00 min Parametri MS/MS I parametri MS/MS indicati nelle tabelle seguenti rappresentano solo valori indicativi. Questi parametri si applicano alle transizioni di massa dei singoli parametri. Questi valori rappresentano un punto di partenza per l ottimizzazione. I parametri ottimali differiscono tra i diversi sistemi MS/MS, devono essere quindi ottimizzati sul sistema in uso (vedere sezione 5.3.1). Per la quantificazione è disponibile uno Standard Interno ClinMass (contiene d 6-25-OHvitamina D3) con num. d ordine MS7012.

19 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina 15 I seguenti parametri si riferiscono al sistema MS/MS API Tabella 4: parametri MS/MS, API 4000 Ion Source Heated Nebuliser (APcI), positive Resolution Q1 and Q3 unit (0.7 amu) GS 1 40 GS 2 - Curtain Gas (CUR) 40 Collision Gas (CAD) 6 Source Temperature 400 C Interface Heater ON Nebuliser Current (NC) 3 Mass transitions Vedere tabella 5 Tabella 5: Transizioni di massa e parametri specifici per API 4000 Analita 25-OH-Vitamina D2 (quantificatore) 25-OH-Vitamina D2 (qualificatore) 25-OH-Vitamina D3 (quantificatore) 25-OH-Vitamina D3 (qualificatore) d 6-25-OH-Vitamina D3 (quantificatore) d 6-25-OH-Vitamina D3 alternativo Precursore [amu] Prodotto [amu] Dwell time [sec] DP [V] CE [V] CXP [V] EP [V] Modalità Standby Quando il sistema analitico non è in uso, le pompe devono essere spente. L SPE buffer e la fase mobile possono essere lasciate nel sistema LC. Le pompe da vuoto dello spettrometro di massa tandem (sistema MS/MS) devono essere permanentemente in funzione. Al fine di preservare la sorgente ionica e il moltiplicatore, il sistema MS/MS può essere messo in modalità di standby. Per periodi di inattività più lunghi la colonna SPE e la colonna analitica devono essere disconnesse e conservate chiuse. Il sistema LC deve essere flussato con una miscela di acqua/metanolo (1:1).

20 Pagina OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line 5 Implementazione della procedura analitica 5.1 Raccolta e conservazione dei campioni La determinazione della 25-OH-vitamina D può essere eseguita in plasma e siero. I campioni possono essere conservati fino a 2 giorni a temperatura ambiente (15-30 C), fino a 4 giorni a temperatura compresa tra 2-8 C e fino a 4 settimane a temperatura di -18 C (ripetuti cicli di congelamento/scongelamento devono comunque essere evitati). 5.2 Preparazione del campione Ricostituzione dei calibratori / controlli sierici liofili I calibratori sierici ClinCal ed i controlli sierici ClinChek (ordine num. MS7013 e MS ), (vedere sezione 2.1.1) sono liofili e devono quindi essere ricostituiti prima dell uso. Le indicazioni riguardo alla ricostituzione e alla concentrazione degli analiti e le informazioni riguardo la conservazione e la stabilità, sono riportate nei rispettivi foglietti illustrativi Flusso di lavoro Preparazione del campione: Precipitazione: 150 µl miscela IS/P* Agitare per 30 sec (vortex mixer) 50 µl campione (calibratore, controllo, paziente) incubare (10 min, 4 C) Agitare per 10 sec (vortex-mixer) centrifugare (5 min, x g) Analisi LC-MS/MS: iniettare µl * Note: Per la precipitazione viene utilizzata una miscela (miscela IS/P) contenente lo Standard Interno IS e il Precipitante P (vedere sezione ).

21 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero Analisi On-Line Pagina Preparazione della miscela IS/P Lo Standard Interno IS e il Precipitante P possono essere premiscelati (miscela IS/P) in base al numero di campioni da analizzare (vedere tabella 6). La miscela IS/P deve essere usata per la precipitazione della matrice come descritto nella sezione Tabella 6:Preparazione della miscela IS/P in base al numero di campioni Numero di campioni Standard Interno IS [ml] Precipitante P [ml] Volume totale della miscela IS/P [ml] La miscela IS/P può essere conservata fino a 4 settimane ad una temperatura di 2-8 C. Note: A causa della temperatura di conservazione si può formare un precipitato nella miscela IS/P che generalmente si dissolve a temperatura ambiente. Il precipitato non ha un effetto negativo sulla funzionalità della miscela IS/P Precipitazione Pipettare 150 µl della miscela IS/P (per la preparazione vedere ) in una provetta di preparazione del campione (ordine num. MS7020) ed aggiungere 50 µl di campione (calibratore, controllo, paziente). Agitare per 30 sec su un vortex mixer ed incubare 10 min a 4 C. Agitare ancora per 10 sec su un vortex mixer e centrifugare per 5 min a x g Analisi LC-MS/MS Trasferire un aliquota del surnatante in una provetta adatta per l autocampionatore in uso. Il volume d iniezione può variare tra µl in base alla sensibilità dello spettrometro di massa utilizzato Stabilità dei campioni preparati I campioni di plasma e siero preparati possono essere conservati fino a 3 giorni a temperatura ambiente (15-30 C), fino a 1 settimana a temperatura compresa tra 2-8 C e fino a 3 mesi a temperatura di -18 C (evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento).